Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.

Dye doped, core / shell silica nanoparticles: synthesis, characterization, & biotechnological applications

The aim of this thesis was to design, synthesize and develop a nanoparticle based system to be used as a chemosensor or as a label in bioanalytical applications. A versatile fluorescent functionalizable nanoarchitecture has been effectively produced based on the hydrolysis and condensation of TEOS in direct micelles of Pluronic® F 127, obtaining highly monodisperse silica - core / PEG - shell nanoparticles with a diameter of about 20 nm. Surface functionalized nanoparticles have been obtained in a one-pot procedure by chemical modification of the hydroxyl terminal groups of the surfactant. To make them fluorescent, a whole library of triethoxysilane fluorophores (mainly BODIPY based), encompassing the whole visible spectrum has been synthesized: this derivatization allows a high degree of doping, but the close proximity of the molecules inside the silica matrix leads to the development of self - quenching processes at high doping levels, with the concomitant fall of the fluorescence signal intensity. In order to bypass this parasite phenomenon, multichromophoric systems have been prepared, where highly efficient FRET processes occur, showing that this energy pathway is faster than self - quenching, recovering the fluorescence signal. The FRET efficiency remains very high even four dye nanoparticles, increasing the pseudo Stokes shift of the system, attractive feature for multiplexing analysis. These optimized nanoparticles have been successfully exploited in molecular imaging applications such as in vitro, in vivo and ex vivo imaging, proving themselves superior to conventional molecular fluorophores as signaling units.

Synthese und Untersuchung aromatischer Amide und aramidbasierter Blockcopolymere

Aromatische Amide mit p-Verknüpfung bilden die wohl steifste und härteste Klasse organischer Moleküle. Ihre Oligomere und Polymere sind Materialien mit extremer Stabilität und chemischer Robustheit. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese wohldefinierter Oligo-(p-benzamid)e (OPBA) bis zum Hepta-(p-benzamid), deren Kristallstruktur und thermisches Verhalten eingehend untersucht werden. Ihre besondere Steifigkeit wird im Folgenden genutzt, um Stab-Knäuel-Copolymere mit wohldefiniertem OPBA-Stab-Block herzustellen. Das Aggregationsverhalten dieser Copolymere wird näher beschrieben und die Aggregate mittels Rasterkraftmikroskopie (RKM) visualisiert und charakterisiert. Ein Schwerpunkt der durchgeführten Forschung befasst sich mit dem Einflu"s chemischer Variationen von Knäuel- und Stabblock auf die Aggregation. Ausgehend von PEG-OPBA-Copolymeren wird gezeigt, wie sich über kontrolliert radikalische Polymerisation responsive Triblöcke herstellen lassen. Das Verhalten dieser Triblöcke in wässriger Lösung wird eingehender untersucht und anhand von Lichstreu- und RKM-Untersuchungen ein Modell entwickelt, welches dieses Verhalten beschreibt. Neben den OPBA beschäftigt sich die Arbeit mit der Synthese wohldefinierter Oligo-p-phenylen-terephthalamide (OPTA). Der Aufbau PEG-basierter Stab-Knäuel-Copolymere mit monodispersem OPTA-Block wird beschrieben und ihre Aggregate mittels RKM dargestellt. Die Copolymere werden verwendet, um verbesserte Haftungseigenschaften an Twaron-Fasern gegenüber reinem PEG zu demonstrieren.

Inorganic-organic hybrid polymers: Solution-processible coating materials for defined surface functionalization

A new class of inorganic-organic hybrid polymers could successfully been prepared by the combination of different polymerization techniques. The access to a broad range of organic polymers incorporated into the hybrid polymer was realized using two independent approaches.rnIn the first approach a functional poly(silsesquioxane) (PSSQ) network was pre-formed, which was capable to initiate a controlled radical polymerization to graft organic vinyl-type monomers from the PSSQ precursor. As controlled radical polymerization techniques atom transfer radical polymerization (ATRP), as well as reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization could be used after defined tuning of the PSSQ precursor either toward a PSSQ macro-initiator or to a PSSQ macro-chain-transfer-agent. The polymerization pathway, consisting of polycondensation of trialkoxy-silanes followed by grafting-from polymerization of different monomers, allowed synthesis of various functional hybrid polymers. A controlled synthesis of the PSSQ precursors could successfully be performed using a microreactor setup; the molecular weight could be adjusted easily while the polydispersity index could be decreased well below 2.rnThe second approach aimed to incorporate differently derived organic polymers. As examples, polycarbonate and poly(ethylene glycol) were end-group-modified using trialkoxysilanes. After end-group-functionalization these organic polymers could be incorporated into a PSSQ network.rnThese different hybrid polymers showed extraordinary coating abilities. All polymers could be processed from solution by spin-coating or dip-coating. The high amount of reactive silanol moieties in the PSSQ part could be cross-linked after application by annealing at 130° for 1h. Not only cross-linking of the whole film was achieved, which resulted in mechanical interlocking with the substrate, also chemical bonds to metal or metal oxide surfaces were formed. All coating materials showed high stability and adhesion onto various underlying materials, reaching from metals (like steel or gold) and metal oxides (like glass) to plastics (like polycarbonate or polytetrafluoroethylene).rnAs the material and the synthetic pathway were very tolerant toward different functionalities, various functional monomers could be incorporated in the final coating material. The incorporation of N-isopropylacrylamide yielded in temperature-responsive surface coatings, whereas the incorporation of redox-active monomers allowed the preparation of semi-conductive coatings, capable to produce smooth hole-injection layers on transparent conductive electrodes used in optoelectronic devices.rnThe range of possible applications could be increased tremendously by incorporation of reactive monomers, capable to undergo fast and quantitative conversions by polymer-analogous reactions. For example, grafting active esters from a PSSQ precursor yielded a reactive surface coating after application onto numerous substrates. Just by dipping the coated substrate into a solution of a functionalized amine, the desired function could be immobilized at the interface as well as throughout the whole film. The obtained reactive surface coatings could be used as basis for different functional coatings for various applications. The conversion with specifically tuned amines yielded in surfaces with adjustable wetting behaviors, switchable wetting behaviors or as recognition element for surface-oriented bio-analytical devices. The combination of hybrid materials with orthogonal reactivities allowed for the first time the preparation of multi-reactive surfaces which could be functionalized sequentially with defined fractions of different groups at the interface. rnThe introduced concept to synthesis functional hybrid polymers unifies the main requirements on an ideal coating material. Strong adhesion on a wide range of underlying materials was achieved by secondary condensation of the PSSQ part, whereas the organic part allowed incorporation of various functionalities. Thus, a flexible platform to create functional and reactive surface coatings was achieved, which could be applied to different substrates. rn

Realizzazione e caratterizzazione chimico-fisica di una sorgente di plasma di non equilibrio operante a pressione atmosferica per la modifica superficale di materiali polimerici in ambiente controllato

Il plasma, quarto stato della materia, rappresenta un gas ionizzato in cui ioni ed elettroni si muovono a diverse energie sotto l’azione di un campo elettro-magnetico applicato dall’esterno. I plasmi si dividono in plasmi di equilibrio e di non equilibrio termodinamico, quest’ultimi sono caratterizzati da un’alta temperatura elettronica (oltre 10000 K) e da una bassa temperatura traslazionale degli ioni e delle specie neutre (300-1000 K). I plasmi di non equilibrio trovano largo impiego nella microelettronica, nei processi di polimerizzazione, nell’industria biomedicale e del packaging, consentendo di effettuare trattamenti di sterilizzazione e attivazione superficiale. Il lavoro di tesi è incentrato sui processi di funzionalizzazione e polimerizzazione superficiale con l’obbiettivo di realizzare e caratterizzare sorgenti di plasma di non equilibrio a pressione atmosferica operanti in ambiente controllato. È stata realizzata una sorgente plasma operante a pressione atmosferica e in ambiente controllato per realizzare trattamenti di modifica superficiale e di polimerizzazione su substrati polimerici. L’efficacia e l’omogeneità dei trattamenti eseguiti sono stati valutati tramite misura dell’angolo di contatto. La caratterizzazione elettrica ha consentito di determinare i valori di densità di energia superficiale trasferita sui substrati al variare delle condizioni operative. Lo strato depositato durante il processo di polimerizzazione è stato analizzato qualitativamente tramite l’analisi chimica in spettroscopia infrarossa. L’analisi delle prove di funzionalizzazione dimostra l’uniformità dei processi plasma eseguiti; inoltre i valori dell’angolo di contatto misurati in seguito ai trattamenti risultano confrontabili con la letteratura esistente. Lo studio dei substrati trattati in atmosfera satura d’azoto ha rivelato una concentrazione superficiale di azoto pari al 3% attribuibile alla presenza di ammine, ammine protonate e gruppi ammidici; ciò conferma la bontà della soluzione realizzata e dei protocolli operativi adottati per la funzionalizzazione delle superfici. L’analisi spettroscopica dei trattamenti di polimerizzazione, ha fornito spettri IR confrontabili con la letteratura esistente indicando una buona qualità del polimero depositato (PEG). I valori misurati durante la caratterizzazione elettrica della sorgente realizzata risulteranno fondamentali in futuro per l’ottimizzazione del dispositivo. I dati raccolti infatti, determineranno le linee guida per il tailoring dei trattamenti plasma e per lo sviluppo della sorgente. Il presente lavoro di tesi, pur prendendo in esame una piccola parte delle applicazioni industriali dei plasmi non termici, conferma quanto queste siano pervasive nei comuni processi industriali evidenziandone le potenzialità e i numerosi campi d’applicazione. La tecnologia plasma è destinata ad essere imprescindibile per la ricerca di soluzioni innovative ai limiti dei processi tradizionali.

Synthesis and surface modification of silver and gold nanoparticles. Nanomedicine applications against Glioblastoma Multiforme.

In the last decades noble metal nanoparticles (NPs) arose as one of the most powerful tools for applications in nanomedicine field and cancer treatment. Glioblastoma multiforme (GBM), in particular, is one of the most aggressive malignant brain tumors that nowadays still presents a dramatic scenario concerning median survival. Gold nanorods (GNRs) and silver nanoparticles (AgNPs) could find applications such as diagnostic imaging, hyperthermia and glioblastoma therapy. During these three years, both GNRs and AgNPs were synthesized with the “salt reduction” method and, through a novel double phase transfer process, using specifically designed thiol-based ligands, lipophilic GNRs and AgNPs were obtained and separately entrapped into biocompatible and biodegradable PEG-based polymeric nanoparticles (PNPs) suitable for drug delivery within the body. Moreover, a synergistic effect of AgNPs with the Alisertib drug, were investigated thanks to the simultaneous entrapment of these two moieties into PNPs. In addition, Chlorotoxin (Cltx), a peptide that specifically recognize brain cancer cells, was conjugated onto the external surface of PNPs. The so-obtained novel nanosystems were evaluated for in vitro and in vivo applications against glioblastoma multiforme. In particular, for GNRs-PNPs, their safety, their suitability as optoacoustic contrast agents, their selective laser-induced cells death and finally, a high tumor retention were all demonstrated. Concerning AgNPs-PNPs, promising tumor toxicity and a strong synergistic effect with Alisertib was observed (IC50 10 nM), as well as good in vivo biodistribution, high tumor uptake and significative tumor reduction in tumor bearing mice. Finally, the two nanostructures were linked together, through an organic framework, exploiting the click chemistry azido-alkyne Huisgen cycloaddition, between two ligands previously attached to the NPs surface; this multifunctional complex nanosystem was successfully entrapped into PNPs with nanoparticles’ properties maintenance, obtaining in this way a powerful and promising tool for cancer fight and defeat.

Ortsgerichtete Modifikationen von Somatostatin-14 zur Darstellung von maßgeschneiderten Biohybridkonjugaten

Die hochspezifische Funktionalisierung von Proteinen und Peptiden kann durch milde reduktive Spaltung der lösungsmittelzugänglichen Disulfidbrücken und anschließende Rückverbrückung durch den Einbau sogenannter Linkermoleküle über einen konsekutiven Eliminierungs-Additionsprozess verwirklicht werden. Die Erweiterung des Linkerportfolios stellte in erster Instanz die Entwicklung von verschieden funktionalisierten Systemen dar, welche als hochflexible Kernbausteine für den Aufbau komplexer Architekturen dienten. Das Verständnis für die Reaktivität und Reversibilität der Thioladdition an die Mono-und Bissulfone in Abhängigkeit des Substituenten in p-Position konnte durch Variation von Parametern wie Lösungsmittel oder pH-Wert für intelligentes Produktdesign genutzt werden. Heterokonjugate zweier Biomoleküle mit ungepaartem Cystein wurden durch die Kombination von Maleinimid- und Bissulfonchemie innerhalb eines Linkermoleküls realisiert. Polymer-Peptid-Konjugate wurden einerseits über die grafting to Methode durch Modifizierung von Somatostatin mit PEGbissulfonen und anderseits durch grafting from unter Verwendung eines zuvor synthetisierten ATRP-Makroinitiators dargestellt. Multivalente Konjugate konnten durch die Synthese von hochsymmetrischen Tetra- sowie Hexasulfonen und anschließende Umsetzung mit Somatostatin erhalten werden. Die Polyinterkalatorpolymere, die durch lebende radikalische Polymerisation eines Bissulfidmonomers generiert wurden, wurden mit Glutathion umgesetzt. Durch die Interkalation von p-Ethinyl sowie p-Iodmonosulfon in die Disulfidbrücke von Somatostatin konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die Rückverbrückung unter Rezyklisierung gelang. Die biologische Integrität wurde durch die Modifikation nicht beeinträchtigt und die erfolgreiche Aufnahme wurde nur bei den rezeptorpositiven Zellen (CAPAN-2) beobachtet. Das artifizielle Iodderivat im Vergleich zum nativen Somatostatin ein erhöhtes Potential zur Apoptoseinduktion. Die Somatostatinderivate präsentierten sich somit als attraktive potentielle Therapeutika.

Radiolabeling of defined polymer architectures with fluorine-18 and iodine-131 for ex vivo and in vivo evaluation : visualization of structure-property relationships

Nuclear medicine imaging techniques such as PET are of increasing relevance in pharmaceutical research being valuable (pre)clinical tools to non-invasively assess drug performance in vivo. Therapeutic drugs, e.g. chemotherapeutics, often suffer from a poor balance between their efficacy and toxicity. Here, polymer based drug delivery systems can modulate the pharmacokinetics of low Mw therapeutics (prolonging blood circulation time, reducing toxic side effects, increasing target site accumulation) and therefore leading to a more efficient therapy. In this regard, poly-N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide (HPMA) constitutes a promising biocompatible polymer. Towards the further development of these structures, non-invasive PET imaging allows insight into structure-property relationships in vivo. This performant tool can guide design optimization towards more effective drug delivery. Hence, versatile radiolabeling strategies need to be developed and establishing 18F- as well as 131I-labeling of diverse HPMA architectures forms the basis for short- as well as long-term in vivo evaluations. By means of the prosthetic group [18F]FETos, 18F-labeling of distinct HPMA polymer architectures (homopolymers, amphiphilic copolymers as well as block copolymers) was successfully accomplished enabling their systematic evaluation in tumor bearing rats. These investigations revealed pronounced differences depending on individual polymer characteristics (molecular weight, amphiphilicity due to incorporated hydrophobic laurylmethacrylate (LMA) segments, architecture) as well as on the studied tumor model. Polymers showed higher uptake for up to 4 h p.i. into Walker 256 tumors vs. AT1 tumors (correlating to a higher cellular uptake in vitro). Highest tumor concentrations were found for amphiphilic HPMA-ran-LMA copolymers in comparison to homopolymers and block copolymers. Notably, the random LMA copolymer P4* (Mw=55 kDa, 25% LMA) exhibited most promising in vivo behavior such as highest blood retention as well as tumor uptake. Further studies concentrated on the influence of PEGylation (‘stealth effect’) in terms of improving drug delivery properties of defined polymeric micelles. Here, [18F]fluoroethylation of distinct PEGylated block copolymers (0%, 1%, 5%, 7%, 11% of incorporated PEG2kDa) enabled to systematically study the impact of PEG incorporation ratio and respective architecture on the in vivo performance. Most strikingly, higher PEG content caused prolonged blood circulation as well as a linear increase in tumor uptake (Walker 256 carcinoma). Due to the structural diversity of potential polymeric carrier systems, further versatile 18F-labeling strategies are needed. Therefore, a prosthetic 18F-labeling approach based on the Cu(I)-catalyzed click reaction was established for HPMA-based polymers, providing incorporation of fluorine-18 under mild conditions and in high yields. On this basis, a preliminary µPET study of a HPMA-based polymer – radiolabeled via the prosthetic group [18F]F-PEG3-N3 – was successfully accomplished. By revealing early pharmacokinetics, 18F-labeling enables to time-efficiently assess the potential of HPMA polymers for efficient drug delivery. Yet, investigating the long-term fate is essential, especially regarding prolonged circulation properties and passive tumor accumulation (EPR effect). Therefore, radiolabeling of diverse HPMA copolymers with the longer-lived isotope iodine-131 was accomplished enabling in vivo evaluation of copolymer P4* over several days. In this study, tumor retention of 131I-P4* could be demonstrated at least over 48h with concurrent blood clearance thereby confirming promising tumor targeting properties of amphiphilic HPMA copolymer systems based on the EPR effect.

Serum anti-interferon alpha antibodies in chronic hepatitis C patients treated with pegylated interferon alpha containing therapy

The development of anti-IFNα antibodies is an occurrence described in chronic hepatitis C patients during treatment with Interferonα/PEG-Interferonα. However, its relevance, especially in difficult-to treat patients, has not been defined. Methods: We retrospectively measured the serum levels of anti-IFNα antibodies (baseline and week 12) and IFNα levels (week 12) by ELISA in 76 previous non-responders, and in 14 naive patients treated with Pegylated-IFNα and Ribavirin. A group of 57 healthy donors (HD) was also assessed as control. Positivity to anti-IFNα antibodies was established on the values of HD. Results: Baseline anti-IFNα antibodies were detected in 15.5% of patients and in 7% of HD, with significantly higher concentrations in patients than HD (181.5±389.9 vs 95.9±143.0 ng mL−1, p=0.0023). All positive patients were IFNα-experienced. At week 12, the prevalence of positivity increased to 22.3 and 28.5% in experienced and naïve patients, respectively, and the levels of anti-IFNα antibodies did not differ between the two groups (391±792.3 vs 384.7±662.6 ng mL−1, respectively). IFNα concentrations were significantly lower in antibody-positive patients than in antibody-negatives (988.2±1402 vs 3462±830.8 pg mL−1, p≤0.0001) and the levels of antibodies and IFNα were inversely correlated (r=-0.405, p=0.0001). The antibody-positive population clustered in null responders (67%) and 19/21 patients (90%) did not achieve SVR. Conclusions: The development of anti-IFNα antibodies is a non-negligible occurrence in patients treated with PEG-IFNα, is stable over time, and has a relevant clinical impact when associated with low levels of circulating PEG-IFNα. It should be considered in patients undergoing treatments including PEG-IFNα.

Sintesi e caratterizzazione di nanosistemi biocompatibili per drug delivery nel trattamento dell'Alzheimer

Le nanoparticelle polimeriche offrono grandi vantaggi nella nanomedicina in quanto fungono da carrier per il Drug Delivery e possono essere molto utili per le malattie ancor oggi difficili da trattare quali le neurodegenerative come l’Alzheimer. In questo progetto di tesi sono stati creati nanocarrier polimerici utilizzando come polimero un copolimero a blocchi anfifilico noto come PLGA-b-PEG: con varie tecniche si sono ottenute micelle polimeriche nelle quali sono stati intrappolati come principi attivi sia un farmaco, il liraglutide, sia nanoparticelle di magnesio; il primo può ridurre le placche β-amiloidee, tipiche cause dell’Alzheimer, mentre le seconde possono aumentare la plasticità sinaptica anch’essa legata all’Alzheimer. Inoltre è stato sintetizzato e intrappolato anche un promettente agente diagnostico, ovvero nanoparticelle di ferro, utile per aumentare la sensibilità di tecniche di imaging quali MRI e per la rivelazione precoce di malattie. Tutti i sistemi sono stati caratterizzati con tecniche specifiche per valutare i parametri chiave quali dimensione, polidispersità, carica superficiale e concentrazione dei componenti e successivamente sono state utilizzate per studi biologici effettuati da collaboratori esterni. Tutto questo ha come obiettivo futuro la creazione di un carrier teranostico che racchiuderà al suo interno l’agente terapeutico e l’agente diagnostico per combinare i due effetti principali in un unico carrier.

Einfluss verschiedener nanopartikulärer Systeme auf die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität

Die vorliegende Dissertation untersucht Nanopartikel und Nanokapseln aus verschiedenen Materialien mit verschiedenen Modifikationen für einen zielgerichteten Medikamententransport (Drug Targeting). Obwohl bisher zahlreiche Nanopartikel und -kapseln synthetisiert wurden, besteht nach wie vor hinsichtlich der zellulären Verträglichkeit, Biokompatibilität und Aufnahme kein allumfassendes Verständnis. Mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Ergebnissen soll ein Beitrag zur Schließung dieser Lücke geleistet werden.rnIm Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss der Herstellungsmaterialien PS, PLLA, PMMA, Biomakromoleküle (BSA, DNA), ggf. stabilisiert durch HPMA-LMA-Copolymere und neu-synthetisierte Surfmere, der Formmodifikationen Streckung und Kristallisierung, der Oberflächenmodifikationen mittels verschiedener Tenside und PEG auf die zelluläre Aufnahme und Verträglichkeit hin untersucht.rnZusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass zahlreiche Materialien zur Herstellung von Trägersystemen geeignet sind und sich als biokompatibel und nicht-zytotoxisch erwiesen haben, sich jedoch stark hinsichtlich der Aufnahmeeffizienz in verschiedene Zelllinien unterscheiden. rnIm ersten Abschnitt (Kapitel 5.1) wurden in der ersten und zweiten Untersuchung auf allgemeine Parameter, die die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflussen, eingegangen. Hier wurde der Einfluss des Alters von PLLA-Partikeln auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit zunehmender Materialalterung die zelluläre Aufnahme abnimmt. Eine Zytotoxizität konnte nicht gezeigt werden.rnWeiterhin wurde der Einfluss des FCS-Gehalts des Zell-Mediums auf die zelluläre Aufnahme von PMMA-Partikeln untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit einer steigenden FCS-Konzentration eine Abnahme der zellulären Aufnahme von PMMA-Partikeln einhergeht. Die höchste zelluläre Aufnahme konnte bei einem FCS-Gehalt des Zellmediums von 0,05% verzeichnet werden. rnIm zweiten Abschnitt (Kapitel 5.2) wurde die Stabilisierung von Nanopartikeln mittels neusynthetisierter Tenside und deren Einfluss auf die Zelle-Nanopartikel-Interaktionen untersucht. Dazu wurde zum einen die Oberflächenfunktionalisierung von Nanopartikeln mit Hilfe neu-synthetisierter „Surfmere“ und deren Einfluss auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Die hergestellten Surfmere bewirken gleichzeitig eine Stabilisierung und Funktionalisierung der Nanopartikeloberfläche mit Phosphonatgruppen. Hier wurden kovalente „Surfmer“ stabilisierte Nanopartikel mit Tensid- (SDP) stabilisierten Nanopartikeln verglichen. Zudem wurden dialysierte Nanopartikel mit nicht-dialysierten verglichen. Bezüglich der zellulären Aufnahme konnte für die mittels Dialyse gereinigten Nanopartikel eine gute Aufnahme ohne Unterschiede zwischen den kovalent und nicht-kovalent Phosphonat-funktionalisierten Partikeln beobachtet werden. Die ungereinigten, SDP-stabilisierte, nicht-kovalent gebundene Nanopartikel zeigten hingegen eine bis zu 30% stärkere Aufnahme in die HeLa-Zellen und hMSCs.rnWeiterhin der Einsatz von mit HPMA-LMA-Copolymeren stabilisierte Polystyrol- und PLLA-Partikel, die den Einsatz von Tensiden während des Miniemulsionsprozesses überflüssig machen, untersucht. Auch hier konnte keine Zytotoxizität nachgewiesen werden. Die Aufnahme in HeLa-Zellen scheint mehr von der Größe der Nanopartikel als vom verwendeten Material und in hMSCs mehr von den Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel abzuhängen.rnIm dritten Abschnitt (Kapitel 5.3) wird auf die Möglichkeit der Formmodifikation von Polystyrol-Partikeln und deren Einfluss auf die Nanopartikel-Zelle-Interaktionen eingegangen. Es geht dabei um die Aufnahme und Zytotoxizität von verstreckten (elongierten) Polystyrol-Partikeln im Vergleich zu sphärischen Nanopartikeln, sowie die Aufnahme und Zytotoxizität von kristallinen Polystyrol-Partikeln in verschiedene Zelllinien. Bei den verstreckten Partikeln nimmt die Aufnahme-Effizienz in HeLa-Zellen und hMSCs mit zunehmender Verstreckung ab. Eine Zytotoxizität konnte für keinen der erwähnten Nanopartikel nachgewiesen werden. Bei den Polystyrol-Partikeln unterschiedlicher Taktizität zeigen die kristallierten Polystyrol-Partikel eine geringfügig besser Aufnahme-Rate als die nicht-kristallierten Polystyrol-Partikel. Dabei zeigen die nach dem Herstellungsprozess mittels der Lösemittelverdampfungstechnik der wässrigen Phase entnommenen Partikel eine bessere Aufnahme als die nach der Verdampfung des Chloroforms verfügbaren Partikel. Insgesamt konnte jedoch für alle Polystyrol-Partikel trotz der unterschiedlichen Taktizitäten nach der Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs mittels Durchflusszytometrie hohe Fluoreszenz-Intensitäten verzeichnet werden. Setzt man hohe Fluoreszenz-Intensitäten bei in Zellen aufgenommenen Partikeln mit guten Aufnahmeraten gleich, sind die hier dargestellten Aufnahmeraten als sehr gut zu bezeichnen. rnAuf Nanosysteme mit einer reduzierten zellulären Aufnahme wird im letzten Abschnitt (Kapitel 5.4) eingegangen. Dabei wird zum einen die unterschiedliche Oberflächenmodifikation von Polystyrol-Partikeln mit dem Co-Monomer PEG-MA und den Tensiden SDS und Lutensol AT50 untersucht. Von PEG-MA wurden zudem verschiedene Molekulargewichte (Mn=300 g•mol-1 und Mn=2080 g•mol-1) und verschiedene Konzentrationen (1,5%, 5%, 10%) eingesetzt. Ein Teil der Partikel wurde mit SDS und der andere Teil mit Lutensol AT50 hergestellt. In einem weiteren Schritt wurde das jeweilig gegenteilige Tensid (statt SDS Lutensol AT50 und umgekehrt) eingesetzt, um zu überprüfen, ob sich der zuvor beobachtete Effekt umkehren lässt. Anschließend wurde ein erst mit SDS stabilisierter Nanopartikel (BR01) mit verschiedenen Lutensol AT50-Anteilen (5%, 10%, 25%, 50%, 100%) redispergiert. Die effizienteste Aufnahme zeigte der unmodifizierte, mit SDS stabilisierte Nanopartikel BR01, die niedrigste der ebenfalls unmodifizierte, mit Lutensol AT50 stabilisierte Nanopartikel BR02. Eine steigende Konzentration des PEG-MA Mn=300 g•mol-1 hemmt die Aufnahme von mit SDS stabilisierten Partikeln konstant. Für PEG-MA Mn=2080 g•mol-1 konnte hingegen kein Einfluss nachgewiesen werden. Für die mit Lutensol AT50 stabilisierten Partikel konnte kein Einfluss von PEG-MA nachgewiesen werden. Daraus resultiert, dass der Einsatz von physikalisch adsorbiertem Lutensol AT50 die zelluläre Aufnahme effektiver hemmt als der Einsatz von kovalent gebundenem PEG-MA unterschiedlicher Kettenlänge.rnDer Einsatz von mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapseln, die mit zwei verschiedenen Tensiden (SDS und Lutensol AT50) stabilisiert wurden, wurde im Weiteren näher untersucht. Bei den mit SDS stabilisierten Kapseln erwiesen sich die mit ssDNA hergestellten Kapseln BN-54 und BN-55 als leicht toxisch für die HeLa-Zellen. Dagegen sind alle eingesetzten, mit Lutensol AT50 redispergierten Nanokapseln sowohl für HeLa-Zellen als auch für hMSCs zytotoxisch. Hier ist die toxische Wirkung auf das nicht-ionische Tensid Lutensol AT50 zurückzuführen. Eine zelluläre Aufnahme konnte für keine mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapsel nachgewiesen werden.rnDen Abschluss der Untersuchungen bildet die vergleichende Analyse der in dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff PMI versehenen Partikeln hinsichtlich deren Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs und deren zytotoxische Auswirkungen. In der vergleichenden Analyse werden die zuvor vorgestellten Ergebnisse für PMI-Partikeln nochmal im Kontext betrachtet. Dabei erwies sich sowohl für die HeLa-Zellen als auch für die hMSCs, dass die meisten Partikel eine geringe bis keine zelluläre Aufnahme zeigen. Eine gute Aufnahme konnte nur für wenige Nanopartikel (vor allem für die kristallinen Nanopartikel) verzeichnet werden. Eine Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität konnte nicht nachgewiesen werden. rn

Design and Characterization of Luminescent Silica Nanoparticles

The aim of this thesis was to design, synthesize and characterize dye-doped silica nanoparticles (DDSNPs) to be used as chemosensors or labels in bioanalytical applications. DDSNPs represent one of the most versatile and useful components in nanomedicine displaying important features such as high colloid stability in water, low toxicity, one-pot inexpensive synthesis and tunable fluorescence emission. Starting from the one-pot and highly reproducible synthesis of “silica-core/PEG shell” DDSNPs based on the use of micelles of Pluronic F127, in which take place both hydrolysis and condensation of the silica precursor and of the dyes functionalized with a triethoxysilane group, we developed DDSNPs suitable for optical and optoacustic imaging, drug loading and chemical sensing obtaining very interesting results for the further development of nanomedicine.

Functionalization and characterization of magnetic nanoparticles for biomedical applications

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Oberflächenfunktionalisierung von MnO Nanopartikeln (NP). Durch die Verwendung und Verbesserung verschiedener Polymere durch die Einbindung von Poly (Ethylen Glycol) (PEG), gelang es, die Löslichkeit dieser Nanopartikel in wässrigen Lösungen sowie in Körperflüssigkeiten zu erhöhen. Zusätzlich konnten diese Nanopartikel deutlich besser steril filtriert werden und zeigten eine erhöhte Aktivität alsrnKontrastmittel im MRT. Vorläufige Ergebnisse für die Verwendung von Silika als Schutzhülle für MnO NP werden ebenfalls kurz erläutert. Die verwendeten Polymere besaßen dabei zugängliche Aminogruppen, die eine weitere Funktionalisierung durch Bio-aktiver Gruppen ermöglichte. Der Nachweis einer erfolgreichen Bindung durch verschiedene Methoden wie SDS-PAGE, Western- und Northern Blot sowie die Verwendung unterschiedlicher FluoreszenzMessungen wird ebenfalls diskutiert. MnO NP und anderer magnetischer NP werden weiterhin auf ihr toxisches Verhalten gegenüber Caki1 und HeLa Zellen getestet. Dabei zeigte sich, dass MnO NP, im Gegensatz zu einigen Kupferoxiden, quasi nicht toxisch waren und das Proliferationsverhalten dieser Zellen quasi nicht beeinflussten. Weiterhin wurde ein Fluoreszenzfarbstoff, konkret Protoporphyrin IX, an die Oberfläche von MnO NP angebracht.Diese konnten dann erfolgreich als Kontrastmittel in der MRT verwendet werden und zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Photodynamische Therapie. Desweiteren wird die Synthese des Antikörpers gegen p53 ausführlich erläutert. Dabei wurde genau darauf geachtet,dass dieser Antikörper dann an MnO NP gebunden werden kann.

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Größe und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Präsentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDafür wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gewählt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinbürste (PLL-Bürste). Es wird vermutet, dass die PLL-Bürste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im Körper und eine verlängerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antikörper (aDEC205) für die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL für die Spezifität der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Trägermolekül deutlich höher erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinbürste zu übertragen. Anhand dieser polymeren Träger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Knäuels und der Bürste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschließend wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antikörpers mit PLL und anschließender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tikörpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-Bürste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizität bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL Bürsten-Konjugate keine ausgeprägte Zytotoxizität aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabhängi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringfügig erhöhte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antikörper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem „Specific Hybridization Internalization Sensor“ (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch über Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antikörper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. Lösliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit möglich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Träger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Größe, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Außerdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-Bürste übertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Präsentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antikörpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien für die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

Selbstorganisation von Amphiphilen auf Basis von Hexaphenylbenzol und Hexa-peri-hexabenzocoronen

Die Selbstorganisation von amphiphilen Molekülen wird genutzt, um in Lösung, auf der Oberfläche, in der festen Phase und an der Flüssig/Fest-Grenzfläche nanoskopisch strukturierte Materialien zu erhalten. Ziel hierbei ist es, die Dynamik der niedermolekularen Amphiphile mit der Stabilität der hochmolekularen Amphiphile zu vereinigen, um damit die Selbstorganisation der Moleküle zu kontrollieren. Drei Konzepte zur Strukturierung von Kohlenstoff durch Selbstorganisation werden vorgestellt. Im ersten Konzept werden aus Hexaphenylbenzol-Polyethylenglykol- (HPB-PEG) und Hexa-peri-hexabenzocoronen- (HBC-PEG) Derivaten wurmähnliche bzw. faserförmige Strukturen in wässriger Lösung erhalten. Der Wassergehalt in den Hydrogelfasern aus den HPB-PEG-Derivaten kann durch das Substitutionsmuster der Amphiphile und die Länge der PEG-Ketten eingestellt werden. Die Hydrogelfasern ähneln anders als die bisherigen Verfahren, die zur Faserherstellung verwendet werden (Extrudieren, Mikrofluid-Verarbeitung oder Elektrospinning), Systemen in der Natur. Der Beweis für die Bildung von Hydrogelfasern wird mittels spezieller Methoden der polarisierten und depolarisierten dynamischen Lichtstreuung erbracht. Im zweiten Konzept werden durch Elektronenbestrahlung und Pyrolyse von 3',4',5',6'-Tetraphenyl-[1,1':2',1''-terphenyl]-4,4''-dithiol homogene Kohlenstoffmembranen mit Poren erzeugt, die Anwendung in der Filtration finden können und im dritten Konzept wird die Selbstorganisation von einem ortho-verknüpften HPB-Trimer an der Flüssig/Fest-Grenzfläche untersucht. Auf diese Weise werden hochgeordnete lamellare Strukturen erhalten. In allen drei Konzepten sind die Geometrie und die Größe der Moleküle die entscheidenden Parameter zur Erzeugung definierter Strukturen.