The isolation, partial purification and preliminary characterization of a growth factor from chick embryo brains

Chicl( brain growth factor (CBGF) is a mitogen isolated from embryonic chick brains thought to have a potential role as a trophic factor involved in nerve dependent amphibian limb regeneration. In addition, CBGF stimulates 3H-thymidine incorporation in chick embryo brain astrocytes in vitro. In this study, cultured chick embryo brain non-neuronal cells were employed in a bioassay to monitor CBGF activity throughout various stages of its pllrification. Cell culture and assay conditions were optimized. Nonneuronal cells grew best on collagen-coated culture dishes in complete medium, were most responsive to a growth stimulus [10% fetal bovine serum (FBS)] at the second and third subcultures, and were healthiest when rendered "quiescent" in medium supplemented with 1% FBS. The most effective bioassay conditions consisted of a minimum 14.5 hour "quiescence" time (24 hours was used), a 6 hour "prestimulation" time, and a 24 hour 3H-thymidine labeling time. Four-day subconfluent primary non-neuronal cells consisted of 6.63% GFAP positive cells; as a result cultures were thought to be mainly composed of astroblasts. CBGF was purified from 18-day chick embryo brains by ultrafiltration through Amicon PM-30 and YM-2 membranes, size exclusion chromatography through a Biogel P6 column, and analytical reverse-phase high-performance liquid chromatography (rp-HPLC). The greatest activity resided in rp-HPLC fraction #7 (10 ng/ml) which was as effective as 10% FBS at stimulating 3H-thymidine incorporation in chick embryo brain nonneuronal cells. Although other researchers report the isolation of a mitogenic fraction consisting of 5'-GMP from the embryonic chick brain, UV absorbance spectra, rp-HPLC elution profiles, and fast atom bombardment (FAB) mass spectra indicated that CBGF is neither 5'-GMP nor 51-AMP. 2 Moreover, commercially available 5t-GMP was inhibitory to 3H-thymidine incorporation in the chick non-neuronal cells, while Sf-AMP had no effect. Upon treatment with pronase, the biological activity of fraction P6-3 increased; this increase was nearly 30% greater than what would be expected from a simple additive effect of any mitogenic activity of pronase alone together with P6-3 alone. This may suggest the presence of an inhibitor protein. The bioactive component may be a protein protected by a nucleoside/nucleotide or simply a nucleoside/nucleotide acting alone. While the FAB mass spectrum of rp-HPLC fraction #7 did not reveal molecular weight or sequence information, the ion of highest molecular weight was observed at m/z 1610; this is consistent with previous estimations of CBGF's size. 3

Transfection of newt blastema mesenchyme using the techniques of lipofection and direct gene transfer

The regenerating amphibian limb provides a useful system for studying genes involved in the establishment of positional information. While a number of candidate genes that may playa role in pattern formation have been identified, their function in vivo is unknown in this system. To better ascertain the role of these genes, it would be useful to be able to alter their normal patterns of expression in vivo and to assess the effects of this misexpression on limb pattern. In order to achieve this, a method of introducing a plasmid containing the eDNA of a gene of interest into a newt blastema (a growth zone of mesenchymal progenitor cells) is needed. Unfortunately, most commonly used transfection techniques cannot be used with newt blastema cells. In this study, I have used the techniques of lipofection and direct gene transfer to introduce plasmid DNA containing reporter genes into the cells of a regenerating newt limb. The technique of lipofection was most effective when the blastema cells were transfected in vitro. The optimal ratio for transfection was shown to be 1:3 DNA:Lipofectin (W/w) , and an increase in the amount of DNA present in the mixture (1:3 ratio maintained) resulted in a corresponding increase in gene expression. The technique of direct gene transfer was used to transfect newt blastema cells with and without prior complex formation with Lipofectin. Injection of plasmid DNA alone provided the most 3 promising results. It was possible to introduce plasmid DNA containing the reporter gene ~-galactosidase and achieve significant gene expression in cells associated with the injection site. In the future, it would be interesting to use this technique to inject plasmid DNA containing a gene which may have a role in pattern formation into specific areas of the newt blastema and to analyze the resulting limb pattern that emerges.

Plasticité présynaptique et gliale à long-terme en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique,à la jonction neuromusculaire d’amphibien

La plasticité synaptique est une importante propriété du système nerveux, impliquée dans l’intégration de l’information. Cette plasticité a généralement été décrite par des changements aux niveaux pré et postsynaptiques. Notamment, l’efficacité présynaptique, soit la probabilité de libération de neurotransmetteurs associée au contenu quantique d’une synapse, peut être augmentée ou diminuée selon l’activité antérieure de la synapse. Malgré cette caractérisation, les mécanismes à l’origine de la détermination de l’efficacité présynaptique demeurent obscurs. Également, la plasticité synaptique reste encore mal définie au niveau glial, limitant, de ce fait, notre compréhension de l’intégration de l’information. Pourtant, la dernière décennie a mené à une redéfinition du rôle des cellules gliales. Autrefois reléguées à un rôle de support passif aux neurones, elles sont désormais reconnues comme étant impliquées dans la régulation de la neurotransmission. Notamment, à la jonction neuromusculaire (JNM), les cellules de Schwann périsynaptiques (CSPs) sont reconnues pour moduler l’efficacité présynaptique et les phénomènes de plasticité. Un tel rôle actif dans la modulation de la neurotransmission implique cependant que les CSPs soient en mesure de s’adapter aux besoins changeants des JNMs auxquelles elles sont associées. La plasticité synaptique devrait donc sous-tendre une forme de plasticité gliale. Nous savons, en effet, que la JNM est capable de modifications tant morphologiques que physiologiques en réponse à des altérations de l'activité synaptique. Par exemple, la stimulation chronique des terminaisons nerveuses entraîne une diminution persistante de l’efficacité présynaptique et une augmentation de la résistance à la dépression. À l’opposé, le blocage chronique des récepteurs nicotiniques entraîne une augmentation prolongée de l’efficacité présynaptique. Aussi, compte tenu que les CSPs détectent et répondent à la neurotransmission et qu’elles réagissent à certains stimuli environnementaux par des changements morphologiques, physiologiques et d’expression génique, nous proposons que le changement d'efficacité présynaptique imposé à la synapse, soit par une stimulation nerveuse chronique ou par blocage chronique des récepteurs nicotiniques, résulte en une adaptation des propriétés des CSPs. Cette thèse propose donc d’étudier, en parallèle, la plasticité présynaptique et gliale à long-terme, en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique, à la JNM d’amphibien. Nos résultats démontrent les adaptations présynaptiques de l’efficacité présynaptique, des phénomènes de plasticité à court-terme, du contenu mitochondrial et de la signalisation calcique. De même, ils révèlent différentes adaptations gliales, notamment au niveau de la sensibilité des CSPs aux neurotransmetteurs et des propriétés de leur réponse calcique. Les adaptations présynaptiques et gliales sont discutées, en parallèle, en termes de mécanismes et de fonctions possibles dans la régulation de la neurotransmission. Nos travaux confirment donc la coïncidence de la plasticité présynaptique et gliale et, en ce sens, soulèvent l’importance des adaptations gliales pour le maintien de la fonction synaptique.

Régulation transcriptionelle du développement de l'hypothalamus chez l'amphibien

Le noyau paraventriculaire (PVN) de l'hypothalamus régule une série de phénomènes physiologiques incluant l'équilibre énergétique et la pression artérielle. Nous avons identifié une cascade de facteurs de transcription qui contrôle le développement du PVN. SIM1 et OTP agissent en parallèle pour contrôler la différenciation d'au moins cinq types de neurones identifiables par la production d'OT, AVP, CRH, SS et TRH. Ces Facteurs de transcriptions contrôlent le développement des lignées CRH, AVP et OT en maintenant l'expression de Brn2 qui à son tour est nécessaire pour la différenciation terminale de ces neurones. L'analyse du transcriptome du PVN nous a permis d'identifier plusieurs gènes qui ont le potentiel de contrôler le développement du PVN. Nous voulons développer un paradigme de perte de fonction qui permettrait l'étude de ces gènes candidats sur une grande échelle. Le but de ce projet est de caractériser le PVN en développement de l'amphibien en vue de l'utilisation de ce modèle pour des études fonctionnelles. Nous avons cloné des fragments de cDNA de Sim1, OTP, Brn2, Sim2, CRH, Ot, AVP et TRH à partir de l'ARN total de Xenopus Laevis. Nous avons adapté notre technique d'hybridation in situ pour caractériser l'expression de ces gènes chez l'amphibien aux stades 33-39, 44, 51, 54, 60, et chez l'adulte. Résultats. Les Facteurs de transcription Sim1, OTP, et Brn2 commencent à être exprimés dans le PVN prospectif au stade 33. L'expression des marqueurs de différenciation terminale devient détectable entre les stades 37 et 39. De façon intéressante, le PVN occupe initialement un domaine de forme globulaire puis à partir du stade 44 s'allonge le long de l’axe dorso-ventral. Cet allongement se traduit par une organisation en colonnes des cellules du PVN que nous n'avons pas observée chez les rongeurs. Le développement du PVN est conservé chez l'amphibien dans la mesure où la relation entre l'expression des facteurs de transcription et des marqueurs de différenciation terminale est conservée. Il existe par ailleurs des différences entre la topographie des PVN des mammifères et de l'amphibien. L'organisation en colonnes de cellules pourrait correspondre à des mouvements de migration tangentielle. Nous sommes maintenant en mesure de tester la fonction des facteurs de transcription dans le PVN par l'approche d'invalidation par morpholinos.

Le roseau commun (Phragmites Australis) influence-t-il la composition spécifique et le développement larvaire d'amphibiens?

Les plantes envahissantes sont considérées comme l'une des plus grandes menaces sur les espèces, mais leurs impacts sur les amphibiens demeurent peu connus. L’objectif de ce projet est de déterminer l’effet de l’établissement du roseau commun (Phragmites australis) sur la répartition des amphibiens et sur leur développement larvaire. Il est présumé que cette plante s'accapare l'espace et les ressources disponibles en produisant une importante biomasse, qu’elle peut modifier l’hydrologie des marais et la structure des communautés d’amphibiens. J’ai évalué les facteurs influençant la répartition des amphibiens selon les caractéristiques des étangs et du paysage dans 50 sites envahis ou non à divers degrés. Des expériences ont également été menées afin d’étudier les répercussions de trois densités de roseau sur des têtards de la Grenouille des bois (Lithobates sylvaticus) et sur la qualité de son habitat. Mes résultats suggèrent que le roseau à forte densité ralentit le développement larvaire de la grenouille des bois et influence les assemblages phytoplanctoniques. Cependant, il n’y a aucune relation entre la densité de la plante et la survie, la morphologie des têtards et les caractéristiques biotiques et abiotiques de l’eau. Dans notre aire d’étude, le paysage autour des étangs a une plus grande influence sur la répartition des amphibiens que l'établissement du roseau. Toutefois, la probabilité d’assèchement est plus élevée lorsque la plante est établie en grande quantité, ce qui, si l’envahissement s’intensifie, aura un effet néfaste sur la survie des têtards et mettra en péril la persistance des populations.

Efficacité et toxicité de l'eugénol administré à des doses anesthésiantes chez des grenouilles Xenopus laevis.

L’eugénol permet d’induire une anesthésie chirurgicale chez la grenouille africaine à griffes (Xenopus laevis) sans causer de lésions chez des grosses grenouilles (90-140g). Le premier objectif de la présente étude était de déterminer la durée de l’anesthésie et d’évaluer la dépression du système nerveux central ainsi que les changements de saturation en oxygène et de fréquence cardiaque chez des petites (7.5 ± 2.1 g) et moyennes (29.2 ± 7.4 g) grenouilles Xenopus laevis en fonction du temps d’exposition à un bain d’eugénol de 350 µL/L. Suite à une immersion de 5 ou 10 minutes, la réponse au test à l’acide acétique, au réflexe de retrait et au réflexe de retournement était absente pendant 1 heure (petites grenouilles) et 0,5 heure (moyennes) et l’anesthésie chirurgicale durait au maximum 15 et 30 minutes chez les petites et moyennes grenouilles respectivement. La saturation en oxygène n’était pas affectée de façon significative, mais la fréquence cardiaque était diminuée jusqu’à 1 heure post-immersion dans les deux groupes. Le deuxième objectif était de déterminer la toxicité de l’eugénol chez des grenouilles de taille moyenne après une ou trois administrations à une dose anesthésique, avec ou sans période de récupération d’une semaine. Histologiquement, il y avait de l’apoptose tubulaire rénale et des membranes hyalines pulmonaires après une administration, et de la nécrose hépatique et des hémorragies dans les tissus adipeux après trois administrations. Ces résultats suggèrent que le poids corporel est un paramètre important à considérer lors de l’anesthésie de grenouilles Xenopus laevis par immersion dans l’eugénol.

Évaluations physiologiques de la tricaïne méthanesulfonate pour l’anesthésie des grenouilles africaines à griffes (Xenopus laevis)

Il existe peu d’études sur les effets physiologiques et pharmacologiques du médicament anesthésiant le plus utilisé chez les anoures, la tricaïne méthanesulfonate, et son utilisation chez la grenouille Xenopus laevis. Notre premier objectif était d’évaluer l’effet de bains d’immersion de 20 minutes de 1 et 2 g/L de tricaïne méthanesulfonate sur la fonction cardiorespiratoire, l’analgésie et les réflexes ainsi que d’étudier la pharmacocinétique. Nos résultats démontrent que des bains de 1 et 2 g/L produisent une anesthésie chirurgicale de 30 et 60 minutes respectivement, sans effet significatif sur le système cardiorespiratoire. À la suite d’une immersion à 2 g/L, on note une demi-vie terminale de 3,9 heures. Cette dose ne produit aucun effet sur l’histologie des tissus 24 heures après l’immersion. Dans une deuxième expérience, nous avons évalué les effets d’une surdose de tricaïne méthanesulfonate en bain d’immersion sur les systèmes cardiorespiratoire et nerveux central grâce à l’électroencéphalographie ainsi que l’effet d’une injection de pentobarbital sodique après 2 heures d’immersion. L’EEG montre un effet dépresseur sur le SNC avec l’utilisation de la tricaïne méthanesulfonate sans voir un arrêt de signal d’EEG sur la période de 2 heures d’enregistrement. Les surdoses à 1 g/L et 3 g/L n’ont pas d’effet significatif sur le rythme cardiaque, et l’injection de pentobarbital suite au bain d’immersion de tricaïne méthanesulfonate est nécessaire pour induire l’euthanasie. Nous avons démontré que le bain de tricaïne méthanesulfonate peut produire une anesthésie de 30 à 60 minutes avec dépression du SNC sans effet cardiovasculaire chez les Xenopus laevis.

Vergleichend anatomische Studien an den nasalen und vomeronasalen olfaktorischen Organen der Anuren unter funktionsmorphologischen und phylogenetischen Aspekten

Gegenüber anderen sensorischen Systemen wie z. B. optischer oder akustischer Wahrnehmung wurde der olfaktorische Sinn der Anuren von wissenschaftlicher Seite her in der Vergangenheit eher vernachlässigt. Dementsprechend gering sind auch die Erkenntnisse bezüglich der biologischen Bedeutung von Gerüchen für die Froschlurche sowie das Verständnis der damit verbundenen physiologischen Abläufe. Wie die meisten Tetrapoden besitzen auch Anuren ein mehrteiliges Geruchsorgan, welches im Wesentlichen aus dem klassischen olfaktorischen sowie dem vomeronasalen System besteht. Das klassische olfaktorische Organ nimmt bekanntermaßen flüchtige Geruchsstoffe aus der Atemluft wahr. Über die Aufgaben des Vomeronasalorgans - auch Jacobsonsches Organ genannt - herrscht allgemein noch Uneinigkeit. Es ist bekannt, dass dieses flüssigkeitsgefüllte Organ bei verschiedenen Gruppen der Landwirbeltiere durch die Wahrnehmung von Pheromonen sowohl an der sozialen Interaktion beteiligt ist, als auch auf andere olfaktorische Stimuli wie z. B. Futtergeruch reagiert. Verschiedene Untersuchungen am Vomeronasalorgan der Säuger konnten zeigen, dass bei diesen Tieren ein intranasales Pumpsystem existiert, welches Geruchsstoffe und Flüssigkeit innerhalb der Nase bewegt und so das blindsackförmige Organ mit Geruchsinformationen versorgt. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurde auf der Basis einer breit angelegten anatomischen Studie der nasalen Strukturen unterschiedlicher Anuren der Versuch einer tiefergehenden Funktionsanalyse der olfaktorischen Organe vorgenommen. Dabei wurden die nasalen Baupläne aller wichtigen systematischen Gruppen der anuren Amphibien verglichen. Zur Unterstützung der histologischen Daten wurde ein digitales dreidimensionales Modell der Nasenhöhlen erstellt, sowie Vitalfärbungen mit einem fluoreszierenden Farbstoff durchgeführt. Die anatomischen Befunde der Untersuchung liefern deutliche Hinweise darauf, dass Anuren - ähnlich wie Säuger - einen vasomotorischen Pumpmechanismus zur Befüllung des Vomeronasalorgans besitzen. Des Weiteren wurden basierend auf den hier gewonnenen Daten Theorien zu unterschiedlichen Details des intranasalen Transports sowie der Aufnahme olfaktorischer Stimuli bei Anura aufgestellt. Die Untersuchung macht außerdem deutlich, dass bei Anuren vier voneinander unabhängige olfaktorische Systeme existieren. Darüber hinaus werden anhand der gewonnenen Erkenntnisse einige Aspekte phylogenetischer Zusammenhänge bezüglich der Entstehung der verschiedenen Geruchssysteme innerhalb der Vertebraten neu diskutiert.

Nuevas tendencias internacionales de la cooperación internacional y la conservación de la biodiversidad: Afectación local y retos institucionales para su financiamiento

No es un misterio que la cooperación internacional está siendo ampliamente revisada por los donantes, especialmente de Europa y Estados Unidos, debido a las crisis que están sufriendo dichas economías, y que exigen mayor concentración de esfuerzos en resolver los problemas internos y dejar para un segundo plano la Ayuda Oficial para el Desarrollo (AOD). En este contexto, la cooperación para la investigación científica y técnica en materia de biodiversidad se torna en un reto para ser alcanzado a través de los mecanismos tradicionales.Ante esta coyuntura, la incorporación de prácticas de mercadeo en el sector ambiental del país debe ser considerada como una alternativa para que los institutos ambientales de Colombia, logren generar recursos propios y poder así, facilitar el cumplimiento de acuerdos internacionales como las Metas Aichi.

Distortion product otoacoustic emissions in the bullfrog

Recovery of distortion product otoacoustic emissions in the bullfrog after noise exposure does not correlate with hair cell damage noted on the amphibian papilla.

Habitat correlates of distribution and local population decline of the endemic Sardinian newt Euproctus platycephalus

Habitat-based statistical models relating patterns of presence and absence of species to habitat variables could be useful to resolve conservation-related problems and highlight the causes of population declines. In this paper, we apply such a modelling approach to an endemic amphibian, the Sardinian mountain newt Euproctus platycephalus, considered by IUCN a critically endangered species. Sardinian newts inhabit freshwater habitat in streams, small lakes and pools on the island of Sardinia (Italy). Reported declines of newt populations are not yet supported by quantitative data, however, they are perceived or suspected across the species' historical range. This study represents a first attempt trying to statistically relate habitat characteristics to Sardinian newt occurrence and persistence. Linear regression analysis revealed that newts are more likely to be found in sites with colder water temperature, less riparian vegetation and, marginally, absence of fish. The implications of the results for the conservation of the species are discussed, and suggestions for the short-term management of newt inhabited sites suggested. (C) 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Nitrogen fluxes from treefrogs to tank epiphytic bromeliads: an isotopic and physiological approach

Diverse invertebrate and vertebrate species live in association with plants of the large Neotropical family Bromeliaceae. Although previous studies have assumed that debris of associated organisms improves plant nutrition, so far little evidence supports this assumption. In this study we used isotopic ((15)N) and physiological methods to investigate if the treefrog Scinax hayii, which uses the tank epiphytic bromeliad Vriesea bituminosa as a diurnal shelter, contributes to host plant nutrition. In the field, bromeliads with frogs had higher stable N isotopic composition (delta(15)N) values than those without frogs. Similar results were obtained from a controlled greenhouse experiment. Linear mixing models showed that frog feces and dead termites used to simulate insects that eventually fall inside the bromeliad tank contributed, respectively, 27.7% (+/- 0.07 SE) and 49.6% (+/- 0.50 SE) of the total N of V. bituminosa. Net photosynthetic rate was higher in plants that received feces and termites than in controls; however, this effect was only detected in the rainy, but not in the dry season. These results demonstrate for the first time that vertebrates contribute to bromeliad nutrition, and that this benefit is seasonally restricted. Since amphibian-bromeliad associations occur in diverse habitats in South and Central America, this mechanism for deriving nutrients may be important in bromeliad systems throughout the Neotropics.

Habitat Split as a Cause of Local Population Declines of Amphibians with Aquatic Larvae

Most amphibian species have biphasic life histories and undergo an ontogenetic shift from aquatic to terrestrial habitats. In deforested landscapes, streams and forest fragments are frequently disjunct, jeopardizing the life cycle of forest-associated amphibians with aquatic larvae. We tested the impact of habitat split-defined as human-induced disconnection between habitats used by different life-history stages of a species-on four forest-associated amphibian species in a severely fragmented landscape of the Brazilian Atlantic Forest. We surveyed amphibians in forest fragments with and without streams (referred to as wet and dry fragments, respectively), including the adjacent grass-field matrix. Our comparison of capture rates in dry fragments and nearby streams in the matrix allowed us to evaluate the number of individuals that engaged in high-risk migrations through nonforested habitats. Adult amphibians moved from dry fragments to matrix streams at the beginning of the rainy season, reproduced, and returned at the end of the breeding period. Juveniles of the year moved to dry fragments along with adults. These risky reproductive migrations through nonforested habitats that expose individuals to dehydration, predation, and other hazards may cause population declines in dry fragments. Indeed, capture rates were significantly lower in dry fragments compared with wet fragments. Declining amphibians would strongly benefit from investments in the conservation and restoration of riparian vegetation and corridors linking breeding and nonbreeding areas.