Valutazione preliminare dell'effetto domino negli stabilimenti a rischio di incidente rilevante dell'Emilia Romagna

Nell'ambito dell'industria di processo, si definisce "effetto domino" la propagazione di un evento incidentale primario dovuta all’accadimento di uno o più incidenti secondari innescati dall’evento primario, con amplificazione dell’area di danno. Un incidente con effetto domino vede infatti la presenza iniziale di uno scenario incidentale primario, solitamente causato dal rilascio di sostanze pericolose e/o dal rilascio di energia tali da determinare effetti dannosi in grado di innescare successivamente degli eventi incidentali secondari, che determinino un'intensificazione delle conseguenze dell'evento iniziale. Gli incidenti con effetto domino possono avere conseguenze all'interno dello stabilimento in cui ha origine lo scenario incidentale primario o all'esterno, eventualmente coinvolgendo, stabilimenti limitrofi: nel primo caso si parla di effetto domino intra-stabilimento, nel secondo di effetto domino inter-stabilimento. Gli ultimi decenni hanno visto un forte aumento della domanda di prodotti dell'industria chimica e dunque del numero di impianti di processo, talvolta raggruppati nei cosiddetti "chemical clusters", ossia aree ad elevata concentrazione di stabilimenti chimici. In queste zone il rischio di effetto domino inter-stabilimento è particolarmente alto, a causa della stretta vicinanza di installazioni che contengono elevati quantitativi di sostanze pericolose in condizioni operative pericolose. È proprio questa consapevolezza, purtroppo confermata dal verificarsi di diversi incidenti con effetto domino, che ha determinato negli ultimi anni un significativo aumento delle ricerche relative all'effetto domino e anche una sua maggiore considerazione nell'ambito della normativa. A riguardo di quest'ultimo aspetto occorre citare la Direttiva Europea 2012/18/UE (comunemente denominata Direttiva Seveso III) e il suo recepimento nella normativa italiana, il Decreto Legislativo del 26 giugno 2015, "Attuazione della direttiva 2012/18/UE relativa al controllo del pericolo di incidenti rilevanti connessi con sostanze pericolose, entrato in vigore il 29 luglio 2015: questo decreto infatti dedica ampio spazio all'effetto domino e introduce nuovi adempimenti per gli stabilimenti a Rischio di Incidente Rilevante presenti sul territorio nazionale. In particolare, l'Allegato E del D. Lgs. 105/2015 propone una metodologia per individuare i Gruppi domino definitivi, ovvero i gruppi di stabilimenti a Rischio di Incidente Rilevante tra i quali è possibile il verificarsi di incidenti con effetto domino inter-stabilimento. Nel presente lavoro di tesi, svolto presso ARPAE (Agenzia Regionale per la Prevenzione, l'Ambiente e l'Energia) dell'Emilia Romagna, è stata effettuata, secondo la metodologia proposta dall'Allegato E del D. Lgs. 105/2015, la valutazione dell'effetto domino inter-stabilimento per gli stabilimenti a Rischio di Incidente Rilevante presenti in Emilia Romagna, al fine di individuare i Gruppi domino definitivi e di valutare l'aggravio delle conseguenze fisiche degli eventi incidentali primari origine di effetto domino.

Analisi di mercato e design strategico di una macchina utensile ad altissima produttività

L’elaborato ha l’obiettivo di analizzare lo sviluppo di un nuovo prodotto destinato al mercato delle macchine utensili ad elevata produttività, dette macchine transfer. Verranno esaminate le varie fasi che consentono la definizione del nuovo prodotto e delle relative specifiche. La tesi è divisa in due parti principali: -Analisi di mercato e design strategico, la quale consiste nell’analisi dei concorrenti e del mercato al fine di comprendere quali funzioni deve avare la macchina per poter essere competitiva. -Progettazione e ingegnerizzazione di una macchina con le caratteristiche precedentemente individuate, con approfondimento sui gruppi più importanti della stessa.

Studio e ottimizzazione del modulo raggruppatore di una macchina confezionatrice per prodotti igienico sanitari femminili

Le macchine automatiche prodotte dall’azienda VIRE Automation di Faenza sono atte al confezionamento di prodotti igienico sanitari del settore baby, femminile e adulto. La macchina può essere suddivisa in due gruppi funzionali, il primo legato al raggruppamento dei prodotti in pile e il secondo dedicato al confezionamento vero e proprio. Il presente elaborato consiste nello studio e nella progettazione del raggruppatore della macchina dedicata ai prodotti femminili; in particolare lo scopo è il corretto funzionamento del gruppo con performance superiori a quelle attuali. Il progetto si è articolato nell’applicazione del metodo della Casa della Qualità come strumento di supporto, per poi passare allo studio della parte logica della macchina e ad un'analisi cinematica e dinamica del gruppo estrattore; infine vengono presentate ulteriori soluzioni tecniche adottate.

Bluetooth per TuCSoN mobile: panorama tecnologico ed esperimenti

La tesi analizza lo stack di comunicazione Bluetooth e le possibili estensioni di TuCSoN per permettere il suo utilizzo. Come risultato di questo lavoro, sono state realizzate delle librerie software che permettono lo scambio di messaggi tra TuCSoN su Android e dispositivi Bluetooth.

Simulazione di fluidi in Computer Graphics

Questa tesi si focalizza sullo studio dei modelli fisico-matematici attualmente in uso per la simulazione di fluidi al calcolatore con l’obiettivo di fornire nozioni di base e avanzate sull’utilizzo di tali metodi. La trattazione ha lo scopo di facilitare la comprensione dei principi su cui si fonda la simulazione di fluidi e rappresenta una base per la creazione di un proprio simulatore. E’ possibile studiare le caratteristiche di un fluido in movimento mediante due approcci diversi, l’approccio lagrangiano e l’approccio euleriano. Mentre l’approccio lagrangiano ha lo scopo di conoscere il valore, nel tempo, di una qualsiasi proprietà di ciascuna particella che compone il fluido, l’approccio euleriano, fissato uno o più punti del volume di spazio occupato da quest’ultimo, vuole studiare quello che accade, nel tempo, in quei punti. In particolare, questa tesi approfondisce lo studio delle equazioni di Navier-Stokes, approcciandosi al problema in maniera euleriana. La soluzione numerica del sistema di equazioni differenziali alle derivate parziali derivante dalle equazioni sopracitate, approssima la velocità del fluido, a partire dalla quale è possibile risalire a tutte le grandezze che lo caratterizzano. Attenzione viene riservata anche ad un modello facente parte dell’approccio semi-lagrangiano, il Lattice Boltzmann, considerato una via di mezzo tra i metodi puramente euleriani e quelli lagrangiani, che si basa sulla soluzione dell’equazione di Boltzmann mediante modelli di collisione di particelle. Infine, analogamente al metodo di Lattice Boltzmann, viene trattato il metodo Smoothed Particles Hydrodynamics, tipicamente lagrangiano, secondo il quale solo le proprietà delle particelle comprese dentro il raggio di una funzione kernel, centrata nella particella di interesse, influenzano il valore della particella stessa. Un resoconto pratico della teoria trattata viene dato mediante delle simulazioni realizzate tramite il software Blender 2.76b.

Rilevazione di eventi geo-localizzati sulla piattaforma Twitter: Una valutazione sperimentale

I Social Network sono una fonte di informazioni di natura spontanea, non guidata, provviste di posizione spaziale e prodotte in tempo reale. Il Social Sensing si basa sull'idea che gruppi di persone possano fornire informazioni, su eventi che accadono nelle loro vicinanze, simili a quelle ottenibili da sensori. La letteratura in merito all’utilizzo dei Social Media per il rilevamento di eventi catastrofici mostra una struttura comune: acquisizione, filtraggio e classificazione dei dati. La piattaforma usata, nella maggior parte dei lavori e da noi, è Twitter. Proponiamo un sistema di rilevamento di eventi per l’Emilia Romagna, tramite l’analisi di tweet geolocalizzati. Per l’acquisizione dei dati abbiamo utilizzato le Twitter API. Abbiamo effettuato due passaggi per il filtraggio dei tweet. Primo, selezione degli account di provenienza dei tweet, se non sono personali è improbabile che siano usati per dare informazioni e non vanno tenuti in considerazione. Secondo, il contenuto dei tweet, vengono scartati se presentano termini scurrili, parole come “buon giorno” e un numero di tag, riferiti ad altri utenti, superiore a quattro. La rilevazione di un valore anomalo rispetto all'insieme delle osservazioni che stiamo considerando (outlier), è il primo indice di un evento eccezionale. Per l’analisi siamo ricorsi all’outlier detection come indice di rilevamento di un evento. Fatta questa prima analisi si controlla che ci sia un effettivo picco di tweet in una zona della regione. Durante il periodo di attività non sono accaduti eventi straordinari, abbiamo quindi simulato un avvenimento per testare l'efficacia del nostro sistema. La maggior difficoltà è che i dati geolocalizzati sono in numero molto esiguo, è quindi difficile l'identificazione dei picchi. Per migliorare il sistema si propone: il passaggio a streaming dei tweet e un aumento della velocità di filtraggio; la automatizzazione dei filtri; l'implementazione di un modulo finale che operi a livello del testo.

Onde gravitazionali - teoria e rivelazione

Nel redarre la tesi si è perseguito l'intento di illustrare la teoria alla base delle onde gravitazionali e dei metodi che ne consentono la rivelazione. È bene tenere presente che con il seguente elaborato non si sta proponendo, in alcun modo, una lettura da sostituire ad un testo didattico. Pur tuttavia, si è cercato di presentare gli argomenti in maniera tale da emulare l'itinerario formativo di uno studente che, per la prima volta, si approcci alle nozioni, non immediatamente intuitive, ivi descritte. Quindi, ogni capitolo è da interpretarsi come un passo verso la comprensione dei meccanismi fisici che regolano produzione, propagazione ed infine rivelazione delle perturbazioni di gravità. Dopo una concisa introduzione, il primo capitolo si apre con il proposito di riepilogare i concetti basilari di geometria differenziale e relatività generale, gli stessi che hanno portato Einstein ad enunciare le famose equazioni di campo. Nel secondo si introduce, come ipotesi di lavoro standard, l'approssimazione di campo debole. Sotto questa condizione al contorno, per mezzo delle trasformazioni dello sfondo di Lorentz e di gauge, si manipolano le equazioni di Einstein, ottenendo la legge di gravitazione universale newtoniana. Il terzo capitolo sfrutta le analogie tra equazioni di campo elettromagnetiche ed einsteiniane, mostrando con quanta naturalezza sia possibile dedurre l'esistenza delle onde gravitazionali. Successivamente ad averne elencato le proprietà, si affronta il problema della loro propagazione e generazione, rimanendo sempre in condizioni di linearizzazione. È poi la volta del quarto ed ultimo capitolo. Qui si avvia una dissertazione sui processi che acconsentono alla misurazione delle ampiezze delle radiazioni di gravità, esibendo le idee chiave che hanno condotto alla costruzione di interferometri all'avanguardia come LIGO. Il testo termina con uno sguardo alle recenti scoperte e alle aspettative future.

Confronto simulativo tra architetture per la mobilità: analisi simulatore MIPv6 e confronto con ABPS

Il presente elaborato tratta il lavoro di studio, analisi e sperimentazione effettuato dal sottoscritto, Giovanni Sitta, in conclusione al Corso di Laurea Magistrale in Informatica presso l'Università degli Studi di Bologna. Questo ha dapprima previsto un periodo di approfondimento di alcune architetture di supporto alla mobilità dei terminali di rete, in particolare di due protocolli allo stato dell'arte, Mobile IPv6 (MIPv6) e Locator/Identifier Separation Protocol (LISP), e di una terza architettura sperimentale denominata Always Best Packet Switching (ABPS). Sono stati in seguito esaminati tre simulatori, uno per ciascuna architettura di supporto alla mobilità considerata, realizzati come estensioni della libreria INET del framework OMNeT++, assicurandosi che fossero conformi alle specifiche del protocollo implementato (almeno entro i limiti di semplificazione rilevanti ai fini del lavoro), e correggendone eventuali problematiche, mancanze e anomalie in caso questi non le rispettassero. Sono poi stati configurati alcuni scenari simulativi utilizzando le tre librerie, in prima battuta di natura molto semplice, utilizzati per verificare il corretto funzionamento dei simulatori in condizioni ideali, e successivamente più complessi, allestendo un ambiente di esecuzione più verosimile, dotato di un maggior numero di host connessi alla rete e di ostacoli per i segnali radio usati nelle comunicazioni wireless. Tramite i risultati sperimentali ottenuti da queste simulazioni è stato infine possibili realizzare un confronto tra le prestazioni di MIPv6, LISP e ABPS.

Fondamenti teorici della teoria classica del campo elettromagnetico

In questo lavoro vogliamo studiare l'evoluzione dell'elettromagnetismo classico ed i fondamenti teorici della teoria classica del campo elettromagnetico. Riprenderemo i risultati sperimentali principali costruendo una teoria coerente dell'interazione elettromagnetica sfruttando il formalismo Lagrangiano già sviluppato per i sistemi meccanici. Lo studio delle proprietà del campo elettromagnetico è di fondamentale importanza per la fisica teorica: la sua relativa semplicità lo rende un buon candidato per lo sviluppo del formalismo necessario alla descrizione dei sistemi ad infiniti gradi di libertà. Questo servirà inoltre come punto di partenza per lo sviluppo di teorie di campo quantistiche più avanzate.

Identificazione di miRNA correlati ad EGFR: nuovi potenziali biomarcatori di risposta alla terapia di 2a-3a linea in pazienti con NSCLC metastatico

La diagnosi di neoplasia epiteliale maligna polmonare è legata tradizionalmente alla distinzione tra carcinoma a piccole cellule (small-cell lung cancer, SCLC) e carcinoma non-a piccole cellule del polmone (non-small-cell lung cancer, NSCLC). Nell’ambito del NSCLC attualmente è importante di-stinguere l’esatto istotipo (adenocarcinoma, carcinoma squamocellulare e carcinoma neuroendocrino) perchè l’approccio terapeutico cambia a seconda dell’istotipo del tumore e la chemioterapia si dimostra molto spesso inefficace. Attualmente alcuni nuovi farmaci a bersaglio molecolare per il gene EGFR, come Erlotinib e Gefitinib, sono utilizzati per i pazienti refrattari al trattamento chemioterapico tradizionale, che non hanno risposto a uno o più cicli di chemioterapia o che siano progrediti dopo questa. I test per la rilevazione di specifiche mutazioni nel gene EGFR permettono di utilizzare al meglio questi nuovi farmaci, applicandoli anche nella prima linea di trattamento sui pazienti che hanno una maggiore probabilità di risposta alla terapia. Sfortunatamente, non tutti i pazienti rispondono allo stesso modo quando trattati con farmaci anti-EGFR. Di conseguenza, l'individuazione di biomarcatori predittivi di risposta alla terapia sarebbe di notevole importanza per aumentare l'efficacia dei questi farmaci a target molecolare e trattare con farmaci diversi i pazienti che con elevata probabilità non risponderebbero ad essi. I miRNAs sono piccole molecole di RNA endogene, a singolo filamento di 20-22 nucleotidi che svolgono diverse funzioni, una delle più importanti è la regolazione dell’espressione genica. I miRNAs possono determinare una repressione dell'espressione genica in due modi: 1-legandosi a sequenze target di mRNA, causando così un silenziamento del gene (mancata traduzione in proteina), 2- causando la degradazione dello specifico mRNA. Lo scopo della ricerca era di individuare biomarcatori capaci di identificare precocemente i soggetti in grado di rispondere alla terapia con Erlotinib, aumentando così l'efficacia del farmaco ed evitan-do/riducendo possibili fenomeni di tossicità e il trattamento di pazienti che probabilmente non ri-sponderebbero alla terapia offrendo loro altre opzioni prima possibile. In particolare, il lavoro si è fo-calizzato sul determinare se esistesse una correlazione tra la risposta all'Erlotinib ed i livelli di espressione di miRNAs coinvolti nella via di segnalazione di EGFR in campioni di NSCLC prima dell’inizio della terapia. Sono stati identificati 7 microRNA coinvolti nel pathway di EGFR: miR-7, -21, 128b, 133a, -133b, 146a, 146b. Sono stati analizzati i livelli di espressione dei miRNA mediante Real-Time q-PCR in campioni di NSCLC in una coorte di pazienti con NSCLC metastatico trattati con Erlotinib dal 1° gennaio 2009 al 31 dicembre 2014 in 2°-3° linea dopo fallimento di almeno un ciclo di chemioterapia. I pazienti sottoposti a trattamento con erlotinib per almeno 6 mesi senza presentare progressione alla malattia sono stati definiti “responders” (n=8), gli altri “non-responders” (n=25). I risultati hanno mostrato che miR-7, -133b e -146a potrebbero essere coinvolti nella risposta al trat-tamento con Erlotinib. Le indagini funzionali sono state quindi concentrate su miR-133b, che ha mo-strato la maggiore espressione differenziale tra i due gruppi di pazienti. E 'stata quindi studiata la capacità di miR-133b di regolare l'espressione di EGFR in due linee di cellule del cancro del polmone (A549 e H1299). Sono stati determinati gli effetti di miR-133b sulla crescita cellulare. E’ stato anche analizzato il rapporto tra miR-133b e sensibilità a Erlotinib nelle cellule NSCLC. L'aumento di espressione di miR-133b ha portato ad una down-regolazione del recettore di EGF e del pathway di EGFR relativo alla linea cellulare A549. La linea cellulare H1299 era meno sensibili al miR-133b up-regulation, probabilmente a causa dell'esistenza di possibili meccanismi di resistenza e/o di com-pensazione. La combinazione di miR-133b ed Erlotinib ha aumentato l'efficacia del trattamento solo nella linea cellulare A549. Nel complesso, questi risultati indicano che miR-133b potrebbe aumentare / ripristinare la sensibilità di Erlotinib in una frazione di pazienti.

Efficacia della formazione alla salute e sicurezza sul lavoro: fattori di successo e criticità

Background: sulla base delle evidenze emerse dalle rassegne sistematiche in materia (Johnstone, 1994; Cohen et al.,1998; Robson et al., 2012; Burke et al., 2006; Ricci et al., 2015) si è ipotizzato che la formazione alla salute e sicurezza sul lavoro sia maggiormente efficace quando non è presentata come obbligatoria e venga articolata su più livelli di apprendimento, attraverso metodologie adeguate per ogni livello, con docenti che abbiano caratteristiche corrispondenti allo specifico obiettivo di apprendimento e la cui durata sia parametrata all’obiettivo stesso. Obiettivo di questa ricerca è valutare se esista e quanto sia intensa la relazione causale tra la formazione alla sicurezza sul lavoro e i suoi effetti sul miglioramento delle conoscenze, degli atteggiamenti, dei comportamenti, degli esiti per la salute, del clima di sicurezza aziendale, del controllo comportamentale percepito dai lavoratori, delle condizioni operative e procedure interne, oltre l’eventuale effetto di moderazione determinato da caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti e dal gradimento della formazione. Metodo: la variabile indipendente è costituita dell’intervento formativo erogato, articolato in tre condizioni: formazione obbligatoria, formazione non obbligatoria, gruppo di controllo: sono stati posti a confronto due interventi di pari durata (16 settimane, per 10h complessive), realizzati con identiche modalità (step1 audio-visivo; step2 affiancamento su lavoro da parte del preposto; step3 discussione di auto-casi), ma differenziati rispetto all’essere presentati uno come formazione obbligatoria, l’altro come non obbligatoria. I due gruppi sono anche stati confrontati con un gruppo di controllo per il quale la formazione è prevista successivamente. I partecipanti sono stati assegnati in modo casuale al gruppo con obbligo formativo, senza obbligo formativo, di controllo. Sono stati presi come indicatori (variabili dipendenti) per valutare l’effetto della formazione: I livello – conoscenze: riconoscimento o produzione di un maggior numero di risposte corrette. II livello – atteggiamenti e credenze: maggiore propensione a mettere in atto comportamenti auto ed etero protettivi. III livello – comportamenti: comportamenti osservati più adeguati per la tutela della salute propria e altrui. IV livello – salute: maggior grado di benessere bio-psico-sociale auto-riferito. Le misure di esito consistono nella variazione tra la rilevazione iniziale e ogni rilevazione successiva, sulla base delle diverse misure registrate per ognuno dei quattro livelli dell’intervento formativo. Lo stesso confronto del tempo è stato realizzato per le misure del clima di sicurezza aziendale, del controllo comportamentale percepito dai lavoratori, delle condizioni operative e procedure interne, oltre l’eventuale effetto di moderazione determinato da caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti e dal gradimento della formazione, quest’ultimo misurato solo immediatamente al termine dell’intervento. Risultati: le condizioni di intervento non differiscono in termini di efficacia, la formazione determina infatti gli stessi risultati per i partecipanti del gruppo obbligo formativo e di quello non obbligo, con una significativa differenza post-intervento rispetto al gruppo di controllo. La formazione ha un effetto forte nel miglioramento delle conoscenze che solo parzialmente decade nel tempo, ma comunque mantenendo un livello maggiore rispetto ai valori iniziali. In relazione al miglioramento di atteggiamenti e comportamenti sicuri nel lavoro al Videoterminale, l’effetto della formazione è modesto: per gli atteggiamenti si registra solo un miglioramento verso l’applicazione delle procedure come utili realmente e non come mero adempimento, ma tale effetto decade entro quattro mesi riportando i partecipanti su valori iniziali; i comportamenti invece migliorano nel tempo, ma con deboli differenze tra partecipanti alla formazione e gruppo di controllo, tuttavia tale miglioramento non decade in seguito. Non si registrano invece effetti della formazione nella direzione attesa in termini di esiti per la salute, per il miglioramento del clima di sicurezza e come maggior controllo comportamentale percepito, non risultano nemmeno dati evidenti di moderazione degli effetti dovuti a caratteristiche socio-demografiche dei partecipanti. Inoltre emerge che il gradimento per la formazione è correlato con migliori atteggiamenti (strumento audio-visivo), il miglioramento del clima di sicurezza e un maggior controllo comportamentale percepito (studio di auto-casi), ovvero gli step che hanno visto l’intervento di formatori qualificati. Infine, la formazione ha determinato migliori condizioni operative e l’adeguamento delle procedure interne. Conclusioni: la presente ricerca ci consente di affermare che la formazione erogata è stata efficace, oltre che molto gradita dai partecipanti, in particolare quando il formatore è qualificato per questa attività (step1 e 3). L’apprendimento prodotto è tanto più stabile nel tempo quanto più i contenuti sono in stretta relazione con l’esperienza lavorativa quotidiana dei partecipanti, mentre negli altri casi il decremento degli effetti è alquanto rapido, di conseguenza ribadiamo la necessità di erogare la formazione con continuità nel tempo. E’ risultato comunque modesto l’effetto della formazione per migliorare gli atteggiamenti e i comportamenti nel lavoro al VDT, ma, al di là di alcuni limiti metodologici, sono obiettivi ambiziosi che richiedono più tempo di quanto abbiamo potuto disporre in questa occasione e il cui conseguimento risente molto delle prassi reali adottate nel contesto lavorativo dopo il termine della formazione. Le evidenze finora prodotte non hanno poi chiarito in modo definitivo se attraverso la formazione si possano determinare effetti significativi nel miglioramento di esiti per la salute, anche eventualmente attraverso interventi di supporto individuale. Inoltre l’assenza di differenze significative negli effetti tra i partecipanti assegnati alla condizione di obbligo e quelli di non obbligo, eccezion fatta in direzione opposta alle attese per la misura del danno da lavoro, suggeriscono che nell’erogare la formazione, occorre sottolineare in misura molto rilevante l’importanza dell’intervento che viene realizzato, anche qualora esistesse una prescrizione normativa cogente. Infine, la ricerca ci ha fornito anche indicazioni metodologiche e misure valide che invitano ad estendere questa formazione, e la sua valutazione di efficacia, a diversi comparti economici e svariate mansioni. Nel fare questo è possibile fare riferimento, e testare nuovamente, un modello che indica la corretta percezione del rischio (conoscenza) come fattore necessario, ma non sufficiente per ottenere, con la mediazione di atteggiamenti favorevoli allo specifico comportamento, azioni sicure, attraverso le quali si rinforza l’atteggiamento e migliorano le conoscenze. La formazione, per raggiungere i propri obiettivi, deve tuttavia agire anche sui meccanismi di conformismo sociale favorevoli alla safety, questi originano da conoscenze e azioni sicure e reciprocamente le rinforzano.

Ruolo di Clusterina nella progressione del tumore prostatico

Clusterina (CLU) è una proteina ubiquitaria, presente nella maggior parte dei fluidi corporei e implicata in svariati processi fisiologici. Dalla sua scoperta fino ad oggi, CLU è risultata essere una proteina enigmatica, la cui funzione non è ancora stata compresa appieno. Il gene codifica per 3 varianti trascrizionali identificate nel database NCBI con i codici: NM_001831 (CLU 1 in questo lavoro di tesi), NR_038335 (CLU 2 in questo lavoro di tesi) e NR_045494 (CLU 3 in questo lavoro di tesi). Tutte le varianti sono trascritte come pre-mRNA contenenti 9 esoni e 8 introni e si differenziano per l’esone 1, la cui sequenza è unica e caratteristica di ogni variante. Sebbene in NCBI sia annotato che le varianti CLU 2 e CLU 3 non sono codificanti, tramite analisi bioinformatica è stato predetto che da tutti e tre i trascritti possono generarsi proteine di differente lunghezza e localizzazione cellulare. Tra tutte le forme proteiche ipotizzate, l’unica a essere stata isolata e sequenziata è quella tradotta dall’AUG presente sull’esone 2 che dà origine a una proteina di 449 aminoacidi. Il processo di maturazione prevede la formazione di un precursore citoplasmatico (psCLU) che subisce modificazioni post-traduzionali tra cui formazione di ponti disolfuro, glicosilazioni, taglio in due catene denominate β e α prima di essere secreta come eterodimero βα (sCLU) nell’ambiente extracellulare, dove esercita la sua funzione di chaperone ATP-indipendente. Oltre alla forma extracellulare, è possibile osservare una forma intracellulare con localizzazione citosolica la cui funzione non è stata ancora completamente chiarita. Questo lavoro di tesi si è prefissato lo scopo di incrementare le conoscenze in merito ai trascritti CLU 1 e CLU 2 e alla loro regolazione, oltre ad approfondire il ruolo della forma citosolica della proteina in relazione al signaling di NF-kB che svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo e metastatizzazione del tumore. Nella prima parte, uno screening di differenti linee cellulari, quali cellule epiteliali di prostata e di mammella, sia normali sia tumorali, fibroblasti di origine polmonare e linfociti di tumore non-Hodgkin, ha permesso di caratterizzare i trascritti CLU 1 e CLU 2. Dall’analisi è emerso che la sequenza di CLU 1 è più corta al 5’ rispetto a quella depositata in NCBI con l’identificativo NM_001831 e il primo AUG disponibile per l’inizio della traduzione è localizzato sull’esone 2. È stato dimostrato che CLU 2, al contrario di quanto riportato in NCBI, è tradotto in proteina a partire dall’AUG presente sull’esone 2, allo stesso modo in cui viene tradotto CLU 1. Inoltre, è stato osservato che i livelli d’espressione dei trascritti variano notevolmente tra le diverse linee cellulari e nelle cellule epiteliali CLU 2 è espressa sempre a bassi livelli. In queste cellule, l’espressione di CLU 2 è silenziata per via epigenetica e la somministrazione di farmaci capaci di rendere la cromatina più accessibile, quali tricostatina A e 5-aza-2’-deossicitidina, è in grado di incrementarne l’espressione. Nella seconda parte, un’analisi bioinformatica seguita da saggi di attività in vitro in cellule epiteliali prostatiche trattate con farmaci epigenetici, hanno permesso di identificare, per la prima volta in uomo, una seconda regione regolatrice denominata P2, capace di controllare l’espressione di CLU 2. Rispetto a P1, il classico promotore di CLU già ampiamente studiato da altri gruppi di ricerca, P2 è un promotore debole, privo di TATA box, che nelle cellule epiteliali prostatiche è silente in condizioni basali e la cui attività incrementa in seguito alla somministrazione di farmaci epigenetici capaci di alterare le modificazioni post-traduzionali delle code istoniche nell’intorno di P2. Ne consegue un rilassamento della cromatina e un successivo aumento di trascrizione di CLU 2. La presenza di un’isola CpG differentemente metilata nell’intorno di P1 spiegherebbe, almeno in parte, i differenti livelli di espressione di CLU che si osservano tra le diverse linee cellulari. Nella terza parte, l’analisi del pathway di NF-kB in un modello sperimentale di tumore prostatico in cui CLU è stata silenziata o sovraespressa, ha permesso di capire come la forma citosolica di CLU abbia un ruolo inibitorio nei confronti dell’attività del fattore trascrizionale NF-kB. CLU inibisce la fosforilazione e l’attivazione di p65, il membro più rappresentativo della famiglia NF-kB, con conseguente riduzione della trascrizione di alcuni geni da esso regolati e coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, quali l’urochinasi attivatrice del plasminogeno, la catepsina B e la metallo proteinasi 9. È stato dimostrato che tale inibizione non è dovuta a un’interazione fisica diretta tra CLU e p65, per cui si suppone che CLU interagisca con uno dei componenti più a monte della via di segnalazione responsabile della fosforilazione ed attivazione di p65.

Mortalità e incidenza di tumore in una coorte di lavoratori esposti ad asbesto nel settore della navalmeccanica. Confronti esterni, interni e caso-controllo nested

Obiettivi. Lo scopo di questo studio è di confrontare la mortalità e l’incidenza per tutte le cause, tutti i tumori, tumori specifici e per le cause non neoplastiche, in una coorte dei lavoratori impiegati nel cantiere navale di Monfalcone (GO) tra il 1974 e il 1994, con quella della popolazione generale della regione FVG e d’Italia. L’obiettivo è eseguire tali confronti considerando il livello di esposizione ad amianto, la durata di esposizione (in anni) precedente al 1985, il periodo di prima assunzione, quali principali indicatori di esposizione occupazionale ad asbesto. Obiettivo secondario è quello di contribuire alla conoscenza circa la correlazione tra esposizione ad asbesto e l’incidenza di tumori nelle principali sedi digestive. Metodi. Tramite metodo indiretto sono stati calcolati SIR (periodo 1995-2009) e SMR (periodo 1995-2012) per tumore maligno della pleura, tumore di trachea bronchi e polmone, per tutti i tumori e per malattie non neoplastiche. È stato condotto uno studio caso- controllo nested per la stima degli gli ORs rispettivamente per tumore maligno della pleura e del polmone. Sono stati applicati modelli di Poisson per la stima degli IRRs riguardanti le principali sedi digestive, utilizzando quali variabili esplicative: a) il rischio di esposizione ad asbesto legato alla mansione e b) il numero di anni di esposizione precedenti al 1985. Risultati. Nell’intera coorte (5582 uomini) gli SMR indicavano un eccesso di mortalità per tumore maligno della pleura incrementato rispettivamente di circa 7 volte (SMR= 7,03; IC95% 5,61-8,79) e di poco più di 14 volte (SMR= 14,20; IC95% 11,33-17,75) rispettivamente quando il confronto è stato fatto con la popolazione standard del FVG e dell’Italia. L’aumento della mortalità per tumore maligno della pleura risulta fortemente aumentato in tutte le stratificazioni. Gli SMR per il tumore di trachea, bronchi e polmone sono risultati essere prossimi all'unità quando le analisi sono state eseguite nell’intera coorte, mentre risultano aumentati in modo significativo rispetto alla popolazione generale quando calcolati nei soggetti a rischio medio e assunti presso i cantieri navali di Monfalcone prima del 1974 (SMR= 1,38 95%CI 1,00-1,85) e nei soggetti classificati a rischio medio e assunti nel periodo 1985-1994 (SMR= 4,88 95%CI 1,00-14,25). Analogamente, nell’intera coorte, i SIR per tumore maligno della pleura calcolati nell’intera coorte erano aumentati di oltre 7 volte (SIR= 7,65; IC95% 6,19-9,49), mentre l’incidenza del tumore di trachea bronchi e polmone non vede incrementi rispetto alla popolazione di riferimento. Coloro che hanno avuto una durata di esposizione maggiore di 30 anni prima del 1985 dimostrano un aumento dell’incidenza di tumore di trachea, bronchi e polmone (SIR=1,34 IC95% 1,00-1,77), statisticamente significativo, così come per coloro che son stati classificati a rischio medio di esposizione e assunti precedentemente al 1974 (SIR=1,46 IC95% 1,06-1,95) e per coloro che sono stati classificati ad alto rischio e assunti nel periodo 1985-1994 (SIR=5,68 IC95% 1,17-16,60). Nell’intera coorte si registra un significativo aumento di incidenza di tumore dello stomaco in coloro classificati a alto rischio (SIR= 1,47 IC95% 1,05-2,00), mentre l’incidenza di tumore del pancreas vede un incremento dell’incidenza in coloro classificati a medio rischio di esposizione ad asbesto (SIR= 2,21 IC95% 1,21-3,72). Il sottogruppo le cui informazioni risultavano mancanti mostrano un incremento del SIR, borderline ma non significativo, per tumore del colon-retto (SIR= 1,29 IC95% 0,94-1,73). Emerge un significativo aumento dell’incidenza del tumore dello stomaco in coloro con un periodo di esposizione precedente al 1985 compreso tra 10 e 20 anni (SIR= 1,71 IC95% 1,12-2,49). Anche i SIR per il tumore del pancreas vedono un incremento statisticamente significativo in coloro che hanno una durata di esposizione precedente al 1985 inferiore a 10 anni e maggiore di 30: rispettivamente i SIR sono stati di 2,23 (IC95% 1,07-4,10) e 2,57 (IC95% 1,53-4,07). I risultati relativi ai confronti interni non mostrano significatività statistica. Conclusioni. I risultati indicano che nella coorte degli uomini ex- lavoratori dei cantieri navali di Monfalcone vi era un incremento forte e statisticamente significativo della mortalità e dell’incidenza di tumore maligno della pleura rispetto sia alla popolazione generale del FVG sia a quella dell’Italia. Eccessi di mortalità ed incidenza sono stati rilevati talvolta anche per il tumore di trachea, bronchi e polmone, quando le analisi sono state condotte stratificando la coorte in gruppi omogenei di rischio. Il più elevato eccesso rispetto all’atteso sia della mortalità per tumore maligno della pleura e del tumore del polmone, che dell’incidenza, si osservava nei lavoratori con mansioni a rischio medio, seguito dal gruppo con mansioni a rischio elevato. I Risultati riguardanti l’incidenza dei tumori delle principali sedi digestive ha visto nell’intera coorte un aumento significativo dei SIR per tumore dello stomaco e del pancreas, anche quando condotti per sottogruppi. Tuttavia le stime relative agli outcome diversi dal tumore maligno della pleura e del tumore del polmone devono essere interpretate con cautela. Le associazioni positive riscontrate tramite confronti interni non presentano significatività statistica.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Teoria della legittimazione e diritto penale. Il ruolo del consenso sociale nelle dinamiche della legalità

Nel Capitolo I abbiamo osservato come la legittimazione abbia per oggetto la fonte di produzione del diritto, mentre la legalità l’atto emanato dalla fonte nell’esercizio del potere. La legittimazione è fondamento del potere, attiene alla sua titolarità e giustifica l’obbedienza e l’uso della forza. La legalità si riferisce all’esercizio del potere, regolandolo. Si è visto come «quando si esige la legittimazione del potere, si chiede che colui che lo detiene abbia il diritto di averlo. Quando si invoca la legalità del potere, si domanda che chi lo detiene lo eserciti non secondo il proprio capriccio ma in conformità di regole stabilite ed entro i limiti di queste. Il contrario del potere legittimo è il potere di fatto, il contrario del potere legale è il potere arbitrario» . Si è poi precisato che legittimazione e legalità sono i fondamenti alla base dello Stato democratico: laddove non v’è legittimazione non vi può essere neppure democrazia, distinguendo la legittimazione formale, che riguarda chi è legittimato ad agire, ad esercitare il potere, compiendo atti giuridici prescrittivi; dalla legittimazione sostanziale, che riguarda invece che cosa non può e che cosa non può non essere deciso, ossia i limiti e i vincoli imposti all’esercizio del potere . La legittimazione è però presente in tutte le forme di Stato, tanto in quelli autoritari, quanto in quelli democratici. Ciò che distingue tra autoritarietà e democraticità dello Stato è il tipo di atto attraverso il quale si manifesta la legittimazione del potere. Il potere autoritario riceve la propria legittimazione attraverso atti di fede, quello democratico con atti di fiducia. Gli atti di fede possono solo essere spezzati, rotti. Al contrario, gli atti di fiducia possono essere rinnovati o revocati, e pertanto hanno bisogno di norme legali che ne regolino il funzionamento. In tal senso, modelli autoritari e democratici differiscono ulteriormente: nei primi, legittimato il potere, è legittimo tutto ciò che di esso è manifestazione; si può dire che la legittimazione resta tutta assorbita nella legalità. Diversamente, nei modelli democratici, è necessario vi siano norme che disciplinano quell’atto di fiducia legittimante il potere, ma non solo, ve ne devono anche essere altre che regolino l’esercizio del potere stesso. Non solo, ma la legittimazione per essere democratica deve avvenire periodicamente e ha bisogno di un pubblico attivo, informato, consapevole dei suoi diritti, perché è la democrazia ad aver bisogno di un pubblico, di un consenso sociale, che attraverso la propria legittimazione del potere controlli chi quel potere è chiamato ad esercitarlo. Si comprende, allora, perché il principio di legalità in sé e per sé non può garantire la democrazia. Esso garantisce la conformità alla legge, la non arbitrarietà nell’esercizio del potere, ma nulla dice su chi quella legge ha il potere di emanarla, e infatti l’art. 1 del Codice Rocco, durante il fascismo, non garantiva certo le libertà democratiche. Allo stesso modo, la legittimazione sociale in sé e per sé non garantisce la democrazia, perché anche forme di Stato autoritarie, plebiscitarie, hanno un consenso sociale che le sorregge e legittima tutto ciò che chi esercita il potere decide di fare, almeno fino a quando continuano ad avervi fede. Nel Capitolo II abbiamo mostrato come, attraverso la riserva di legge, la Costituzione garantisca entrambi i fondamenti democratici: quello della legalità nell’esercizio della potestà punitiva e quello della legittimazione del Parlamento che la esercita. Dunque, legalità e legittimazione periodica sono un binomio indissolubile, perché possa aversi uno Stato democratico; inoltre è necessario che l’esercizio del potere avvenga “in pubblico” e che l’opinione pubblica abbia una coscienza critica che le consenta di valutare e orientare le proprie scelte. È stato poi sostenuto nel Capitolo III come lo stesso Parlamento non possa – in democrazia – essere libero di sanzionare con pena tutto ciò che vuole, ma sia vincolato direttamente dalla Costituzione rigida e almeno indirettamente dal consenso sociale, che dovrebbe impedire che sia trasformato in illecito penale tutto ciò per la collettività non dovrebbe essere sanzionato come tale. In questo l’informazione, attraverso i mezzi di comunicazione, rappresenta un postulato necessario per ogni modello democratico in grado di influenzare i cittadini nella percezione della realtà. In quest’ultimo Capitolo IV, infine, abbiamo messo in luce come una distorta percezione della realtà, da parte del consenso sociale, alteri “patologicamente” la legittimazione democratica, facendole perdere ogni sua funzione di garanzia nel delimitare il potere politico.