Synthetic long peptide booster immunization in rhesus macaques primed with replication-competent NYVAC-C-KC induces a balanced CD4/CD8 T-cell and antibody response against the conserved regions of HIV-1.

The Thai trial (RV144) indicates that a prime-boost vaccine combination that induces both T-cell and antibody responses may be desirable for an effective HIV vaccine. We have previously shown that immunization with synthetic long peptides (SLP), covering the conserved parts of SIV, induced strong CD4 T-cell and antibody responses, but only modest CD8 T-cell responses. To generate a more balanced CD4/CD8 T-cell and antibody response, this study evaluated a pox-vector prime/SLP boost strategy in rhesus macaques. Priming with a replication-competent NYVAC, encoding HIV-1 clade C gag, pol and nef, induced modest IFNγ T-cell immune responses, predominantly directed against HIV-1 Gag. Booster immunization with SLP, covering the conserved parts of HIV-1 Gag, Pol and Env, resulted in a more than 10-fold increase in IFNγ ELISpot responses in four of six animals, which were predominantly HIV-1 Pol-specific. The animals showed a balanced polyfunctional CD4 and CD8 T-cell response and high Ab titres.

CD4 expression decrease by antisense oligonucleotides. Inhibition of rat T CD4+ cell reactivity

In previous studies, we have demonstrated the inhibition of CD4 expression in rat lymphocytes treated with phorbol myristate acetate (PMA) by antisense oligonucleotides (AS-ODNs) directed against the AUG start region of the cd4 gene. The aim of the present study was to inhibit CD4 expression in lymphocytes without promoting CD4 synthesis and to determine the effect of this inhibition on CD4+ T cell function. Four 21-mer ODNs against the rat cd4 gene (AS-CD4-1 to AS-CD4-4) were used. Surface CD4 expression was measured by immunofluorescence staining and flow cytometry, and mRNA CD4 expression was measured by RT-PCR. T CD4+ cell function was determined by specific and unspecific proliferative response of rat-primed lymphocytes. After 24 hours of incubation, AS-CD4-2 and AS-CD4-4 reduced lymphocyte surface CD4 expression by 40%. This effect remained for 72 hours and was not observed on other surface molecules, such as CD3, CD5, or CD8. CD4 mRNA expression was reduced up to 40% at 24 hours with AS-CD4-2 and AS-CD4-4. After 48 hours treatment, CD4 mRNA decreased up to 27% and 29% for AS-CD4-2 and AS-CD4-4, respectively. AS-CD4-2 and AS-CD4-4 inhibited T CD4+ cell proliferative response upon antigen-specific and unspecific stimuli. Therefore, AS-ODNs against CD4 molecules inhibited surface and mRNA CD4 expression, under physiologic turnover and, consequently, modulate T CD4+ cell reactivity.

CD4 expression decrease by antisense oligonucleotides. Inhibition of rat T CD4+ cell reactivity

In previous studies, we have demonstrated the inhibition of CD4 expression in rat lymphocytes treated with phorbol myristate acetate (PMA) by antisense oligonucleotides (AS-ODNs) directed against the AUG start region of the cd4 gene. The aim of the present study was to inhibit CD4 expression in lymphocytes without promoting CD4 synthesis and to determine the effect of this inhibition on CD4+ T cell function. Four 21-mer ODNs against the rat cd4 gene (AS-CD4-1 to AS-CD4-4) were used. Surface CD4 expression was measured by immunofluorescence staining and flow cytometry, and mRNA CD4 expression was measured by RT-PCR. T CD4+ cell function was determined by specific and unspecific proliferative response of rat-primed lymphocytes. After 24 hours of incubation, AS-CD4-2 and AS-CD4-4 reduced lymphocyte surface CD4 expression by 40%. This effect remained for 72 hours and was not observed on other surface molecules, such as CD3, CD5, or CD8. CD4 mRNA expression was reduced up to 40% at 24 hours with AS-CD4-2 and AS-CD4-4. After 48 hours treatment, CD4 mRNA decreased up to 27% and 29% for AS-CD4-2 and AS-CD4-4, respectively. AS-CD4-2 and AS-CD4-4 inhibited T CD4+ cell proliferative response upon antigen-specific and unspecific stimuli. Therefore, AS-ODNs against CD4 molecules inhibited surface and mRNA CD4 expression, under physiologic turnover and, consequently, modulate T CD4+ cell reactivity.

Influence of PTPN2 and pre-existing immunity on the generation of effector and memory CD8 T cells

Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection envers les maladies infectieuses. Au cours d'une réponse à une infection primaire, des cellules B et des cellules T spécifiques, dirigées contre le pathogène en question, sont générées et certaines d'entre elles deviennent des cellules dites mémoires. Leur fonction est de nous protéger contre une nouvelle infection avec le même pathogène, une infection secondaire. Dans certaines situations, comme c'est par exemple le cas avec la grippe, les pathogènes ne sont pas toujours complètement identiques et les cellules mémoires ne sont pas à même d'assurer leur rôle protecteur et d'empêcher une réinfection. Pourtant, on ne sait à l'heure actuelle que très peu comment une immunité acquise, mais non protectrice, influence le développement d'une réponse immunitaire ultérieure. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié comment les cellules T mémoires cytotoxiques altèrent la réponse de cellules T cytotoxiques nouvellement induites. Au cours d'une réaction immunitaire dirigée contre une infection primaire, un vaste répertoire de lymphocytes T est créé, constitué de cellules T possédant divers degrés d'affinité pour le pathogène. Lors d'une infection secondaire, seules les cellules T ayant une forte affinité pour le pathogène participent à la réponse. Nous avons pu démontrer que ce phénomène de restriction du répertoire des cellules T est principalement causé par les cellules T mémoires qui sont à même de reconnaître un antigène pathogénique présent dans les deux infections. Dans un deuxième projet, nous avons étudié comment l'absence de PTPN2 influence la réponse des cellules T. Chez l'homme, une mutation dans le gène de PTPN2 est associée à des maladies auto-immunes et résulte en une activité réduite de cette phosphatase dans les lymphocytes T. Nous avons montré que la baisse d'activité de la phosphatase PTNP2 conduit à une meilleure expansion des cellules T ayant une qualité comparable à des cellules T auto-antigène spécifiques. De plus, nous avons observé que la survie de ces cellules T effectues ayant une phosphatase diminuée est nettement améliorée. Cela peut conduire à une réponse immunitaire plus efficace ou, éventuellement, à une pathologie auto-immune plus grave. En outre, nos résultats montrent qu'en manipulant l'activité de cette phosphatase, il est possible d'augmenter l'efficacité du transfert des cellules T dans un hôte receveur. Un tel transfert de cellules T est pratiqué chez des patients atteints de tumeurs. Nos travaux suggèrent que la manipulation de la phosphatase PTPN2 pourrait donc représenter une approche thérapeutique novatrice et prometteuse. -- Notre système immunitaire joue un rôle important pour la protection contre les maladies. Les cellules T CD8+ ont une importance primordiale pour le contrôle d'infections primaires causées par des virus ou bactéries, mais également contre certaines tumeurs. Par conséquent, mieux comprendre les exigences nécessaires à l'induction de bonnes réponses des cellules T CD8 pourrait nous permettre de construire des vaccins contre les pathogènes contre lesquels nous n'avons pour l'instant pas de vaccins mais aussi d'améliorer les réactions immunitaires dirigées anti-tumorales. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'influence qu'une immunité préexistante a sur la réponse des cellules T CD8. Nous sommes souvent exposés à des pathogènes qui sont similaires mais pas identiques à ceux que nous avons rencontrés auparavant. De telles infections hétérologues ne sont pas l'objet de beaucoup d'études et certains exemples indiquent même qu'une immunité préexistante partielle peut mener à une aggravation de la maladie. Nous avons étudié le répertoire des lymphocytes T CD8 qui sont générés lors d'une rencontre avec un nouvel antigène, et ce en comparant infection primaire et secondaire. En utilisant le modèle expérimental d'infections à Listeria monocytogenes, nous avons pu montrer que lors d'une infection primaire, un répertoire diversifié comprenant des cellules T CD8 de forte et faible affinité est constitué. Au contraire, dans le cas d'une infection secondaire, le répertoire des cellules T est fortement limité et seulement les lymphocytes T de forte affinité sont impliqués dans la réponse immunitaire. Nous avons pu démontrer que ces Rangements sont provoqués par des cellules T CD8 mémoires capables de reconnaître un antigène présent dans les deux infections. Cette augmentation du seuil d'activation des cellules effectrices est majoritairement causée par les lymphocytes T CD8 mémoires non transférables. Ces observations indiquent que les vaccins visant à induire des cellules T anti-tumorales de faible affinité seraient inefficaces si le vaccin contient des épitopes contre lesquels il existe une mémoire immunologique. Les réponses immunitaires conduites par les cellules T contre les antigènes tumoraux dépendent des cellules T CD8 de faible réactivité contre les antigènes tumoraux puisque les cellules à forte réactivité sont éliminées par les mécanismes de tolérance. Nous basant sur l'existence dans la littérature de preuves indiquant que PTPN2 influence la réponse des cellules T de faible affinité, nous nous sommes intéressés à comprendre comment PTPN2 impacte les réponses des cellules T CD8 en général. Nous avons remarqué que des cellules T CD8 déficientes en PTPN2 exhibent une meilleure capacité à proliférer suite à une faible ou courte stimulation du récepteur des lymphocytes T. La phase effectrice est prolongée et la contraction retardée résultant ainsi à globalement plus de cellules effectrices. Ce phénomène est également accompagné d'une meilleure survie des cellules effectrices de différentiation terminale. Une fois transférées dans un nouvel hôte receveur, les cellules effectrices terminales KLRG1+CD127- déficientes en phosphatase PTPN2 peuvent survivre et se transformer en cellules mémoires CD127+ fonctionnelles. De façon inattendue, nous avons découvert que l'élimination de PTPN2 améliore l'efficacité du transfert et la formation des cellules mémoires ainsi que leur capacité protectrice. Manipuler l'activité de cette phosphatase apparaît donc comme une approche intéressante et prometteuse pour la thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T. Nos observations montrent que la manipulation d'un facteur intrinsèque, l'absence de PTPN2, peut, dans certaines circonstances, améliorer la réponse des cellules T. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la réponse des lymphocytes T CD8 pourrait donc permettre la manipulation de ces derniers et conduire à des réponses immunitaires plus vigoureuses. Si ces réponses sont déclenchées par l'utilisation de vaccins, il est nécessaire de considérer l'historique d'une exposition préalable à des agents pathogènes ou à des vaccins puisque celle-ci peut, comme nous l'avons démontré, influencer le répertoire des cellules T recrutées dans la réponse immunitaire et, par conséquent, modifier l'aptitude de notre système immunitaire à faire face à une infection. -- Our immune system plays an important role in the protection from disease. CD8 T cells are critical for the control of primary infections with most viruses and certain bacteria as well as against some tumors. Therefore, better knowledge of CD8 T cell responses might enable us to generate vaccines against pathogens for which currently no vaccines are available or to improve anti-tumor immune responses. In the first part of this thesis we addressed the issue how previously acquired immunity impacts on the response of CD8 T cells. We are often exposed to pathogens that are related but not identical to the previously encountered ones. Such heterologous infections are not well studied and there are some indications that partial pre-existing immunity may in some cases even lead to an enhancement of disease. We specifically studied the T cell repertoire of CD8 T cells that are responding to a newly encountered antigen in secondary compared to primary infections. Using the experimental model of Listeria monocytogenes infections, we showed that in primary infections a wide repertoire including high and low affinity CD8 T cells is recruited into the immune response. In contrast to this, in secondary infections, the T cell repertoire is severely restricted and only T cells of high affinity are responding. We were able to pinpoint this difference to the presence of memory CD8 T cells that recognize an antigen that is shared between the two subsequent infections. This increase in the activation threshold was most effectively mediated via non-transferable memory CD8 T cells. This would argue that vaccines targeting low affinity tumor-specific T cells would fail if the vaccine contains previously encountered CD8 T cell epitopes. T cell mediated immune responses to tumor antigen rely often on T cells which weakly react to tumor antigen as high affinity T cells are eliminated by tolerance mechanisms. Following indication in the literature that PTPN2 impacts on the response of such weakly antigen-reactive T cells, we investigated how PTPN2 impacts in general the response of CD8 T cells. We observed that CD8 T cells lacking PTPN2 show an enhanced expansion following weak or short-term T cell receptor stimulation. The effector phase is prolonged and contraction delayed thus resulting in overall more effector cells. This is accompanied by a better survival of terminal effector cells. When transferred into new recipients, KLRG1+CD127- terminal effector cells lacking PTPN2 can survive and convert into CD127+ functional memory cells. Surprisingly, we discovered that elimination of PTPN2 enhances the transfer efficacy and formation of memory cells as well as the protective capacity. Targeting PTPN2 might thus be a promising approach for adoptive T cell therapy. Our observations show how the manipulation of an intrinsic factor, the absence of PTPN2, can enhance T cell responses under certain circumstances. A better understanding of underlying mechanisms for the control of CDS T cell responses might enable the manipulation of these and allow for more powerful responses. If these responses are induced through vaccines it is imperative that the previous history of exposure to pathogens or vaccines is considered as it can, as we have shown in this thesis, influence the recruited T cell repertoire and thus possibly the ability to handle the infection.

Mammalian Target of Rapamycin Complex 2 Controls CD8 T Cell Memory Differentiation in a Foxo1-Dependent Manner.

Upon infection, antigen-specific naive CD8 T cells are activated and differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor cells (MPECs). The underlying signaling pathways remain largely unresolved. We show that Rictor, the core component of mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2), regulates SLEC and MPEC commitment. Rictor deficiency favors memory formation and increases IL-2 secretion capacity without dampening effector functions. Moreover, mTORC2-deficient memory T cells mount more potent recall responses. Enhanced memory formation in the absence of mTORC2 was associated with Eomes and Tcf-1 upregulation, repression of T-bet, enhanced mitochondrial spare respiratory capacity, and fatty acid oxidation. This transcriptional and metabolic reprogramming is mainly driven by nuclear stabilization of Foxo1. Silencing of Foxo1 reversed the increased MPEC differentiation and IL-2 production and led to an impaired recall response of Rictor KO memory T cells. Therefore, mTORC2 is a critical regulator of CD8 T cell differentiation and may be an important target for immunotherapy interventions.

Impact of T cell receptor affinity on the molecular mechanisms modulating CD8 T cell signalling and function against NY-ESO-1 tumour antigen

It is well established that cytotoxic T lymphocytes play a pivotal role in the protection against intracellular pathogens and tumour cells. Such protective immune responses rely on the specific T cell receptor (TCR)-mediated recognition by CD8 T cells of small antigenic peptides presented in the context of class-I Major Histocompatibility Complex molecules (pMHCs) on the surface of infected or malignant cells. The strength (affinity/avidity) of this interaction is a major correlate of protection. Although tumour-reactive CD8 T cells can be observed in cancer patients, anti-tumour immune responses are often ineffective in controlling or eradicating the disease due to the relative low TCR affinity of these cells. To overcome this limitation, tumour-specific CD8 T cells can be genetically modified to express TCRs of improved binding strength against a defined tumour antigen before adoptive cell transfer into cancer patients. We previously generated a panel of TCRs specific for the cancer-testis antigen NY-ESO-l,57.165 with progressively increased affinities for the pMHC complex, thus providing us with a unique tool to investigate the causal link between the surface expression of such TCRs and T cell activation and function. We recently demonstrated that anti-tumour CD8 T cell reactivity could only be improved within physiological affinity limits, beyond which drastic functional declines were observed, suggesting the presence of multiple regulatory mechanisms limiting T cell activation and function in a TCR affinity-dependent manner. The overarching goal of this thesis was (i) to assess the precise impact of TCR affinity on T cell activation and signalling at the molecular level and (ii) to gain further insights on the mechanisms that regulate and delimitate maximal/optimized CD8 T cell activation and signalling. Specifically, by combining several technical approaches we characterized the activation status of proximal (i.e. CD3Ç, Lek, and ZAP-70) and distal (i.e. ERK1/2) signalling molecules along the TCR affinity gradient. Moreover, we assessed the extent of TCR downmodulation, a critical step for initial T cell activation. CD8 T cells engineered with the optimal TCR affinity variants showed increased activation levels of both proximal and distal signalling molecules when compared to the wild-type T cells. Our analyses also highlighted the "paradoxical" status of tumour-reactive CD8 T cells bearing very high TCR affinities, which retained strong proximal signalling capacity and TCR downmodulation, but were unable to propagate signalling distally (i.e. pERKl/2), resulting in impaired cell-mediated functions. Importantly, these very high affinity T cells displayed maximal levels of SHP-1 and SHP-2 phosphatases, two negative regulatory molecules, and this correlated with a partial pERKl/2 signalling recovery upon pharmacological SHP-l/SHP-2 inhibition. These findings revealed the putative presence of inhibitory regulators of the TCR signalling cascade acting very rapidly following tumour-specific stimulation. Moreover, the very high affinity T cells were only able to transiently express enhanced proximal signalling molecules, suggesting the presence of an additional level of regulation that operates through the activation of negative feedback loops over time, limiting the duration of the TCR-mediated signalling. Overall, the determination of TCR-pMHC binding parameters eliciting optimal CD8 T cell activation, signalling, and effector function while guaranteeing high antigen specificity, together with the identification of critical regulatory mechanisms acting proximally in the TCR signalling cascade, will directly contribute to optimize and support the development of future TCR-based adoptive T cell strategies for the treatment of malignant diseases. -- Les lymphocytes T CD8 cytotoxiques jouent un rôle prédominant dans la protection contre les pathogènes intracellulaires et les cellules tumorales. Ces réponses immunitaires dépendent de la spécificité avec laquelle les récepteurs T (TCR) des lymphocytes CD8 reconnaissent les peptides antigéniques présentés par les molécules du complexe Majeur de Histocompatibilité de classe I (pCMH) à la surface des cellules infectées ou malignes. La force (ou affinité/avidité) de l'interaction du TCR-pCMH est un corrélat majeur de protection. Les réponses immunitaires sont cependant souvent inefficaces et ne permettent pas de contrôler ou d'éliminer les cellules tumorales chez les patients atteint du cancer, et ce à cause de la relative faible reconnaissance des TCRs exprimés par les lymphocytes T CD8 envers les antigènes tumoraux. Afin de surmonter cette limitation, les cellules T anti-tumorales peuvent être génétiquement modifiées en les dotant de TCRs préalablement optimisés afin d'augmenter leur reconnaissance ou affinité contre les antigènes tumoraux, avant leur ré¬infusion dans le patient. Nous avons récemment généré des cellules T CD8 exprimant un panel de TCRs spécifiques pour l'antigène tumoral NY-ESO-l157.16J avec des affinités croissantes, permettant ainsi d'investiguer la causalité directe entre l'affinité du TCR-pCMH et la fonction des cellules T CD8. Nous avons démontré que la réactivité anti-tumorale pouvait être améliorée en augmentant l'affinité du TCR dans une intervalle physiologique, mais au delà duquel nous observons un important déclin fonctionnel. Ces résultats suggèrent la présence de mécanismes de régulation limitant l'activation des cellules T de manière dépendante de l'affinité du TCR. Le but de cette thèse a été (i) de définir l'impact précis de l'affinité du TCR sur l'activation et la signalisation des cellules T CD8 au niveau moléculaire et (ii) d'acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent et délimitent l'activation et la signalisation maximale des cellules T CD8 optimisées. Spécifiquement, en combinant plusieurs approches technologiques, nous avons caractérisé l'état d'activation de différentes protéines de la voie de signalisation proximale (CD3Ç, Lek et ZAP-70) et distale (ERK1/2) le long du gradient d'affinité du TCR, ainsi que l'internalisation du TCR, une étape clef dans l'activation initiale des cellules T. Les lymphocytes T CD8 exprimant des TCRs d'affinité optimale ont montré des niveaux d'activation augmentés des molécules proximales et distales par rapport aux cellules de type sauvage (wild-type). Nos analyses ont également mis en évidence un paradoxe chez les cellules T CD8 équipées avec des TCRs de très haute affinité. En effet, ces cellules anti-tumorales sont capables d'activer leurs circuits biochimiques au niveau proximal et d'internaliser efficacement leur TCR, mais ne parviennent pas à propager les signaux biochimiques dépendants du TCR jusqu'au niveau distal (via phospho-ERKl/2), avec pour conséquence une limitation de leur capacité fonctionnelle. Finalement, nous avons démontré que SHP-1 et SHP-2, deux phosphatases avec des propriétés régulatrices négatives, étaient majoritairement exprimées dans les cellules T CD8 de très hautes affinités. Une récupération partielle des niveaux d'activation de ERK1/2 a pu être observée après l'inhibition pharmacologique de ces phosphatases. Ces découvertes révèlent la présence de régulateurs moléculaires qui inhibent le complexe de signalisation du TCR très rapidement après la stimulation anti-tumorale. De plus, les cellules T de très hautes affinités ne sont capables d'activer les molécules de la cascade de signalisation proximale que de manière transitoire, suggérant ainsi un second niveau de régulation via l'activation de mécanismes de rétroaction prenant place progressivement au cours du temps et limitant la durée de la signalisation dépendante du TCR. En résumé, la détermination des paramètres impliqués dans l'interaction du TCR-pCMH permettant l'activation de voies de signalisation et des fonctions effectrices optimales ainsi que l'identification des mécanismes de régulation au niveau proximal de la cascade de signalisation du TCR contribuent directement à l'optimisation et au développement de stratégies anti-tumorales basées sur l'ingénierie des TCRs pour le traitement des maladies malignes.

Direct Interrogation of Viral Peptides Presented by the Class I HLA of HIV-Infected T Cells

Identification of CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes has traditionally relied upon testing of overlapping peptide libraries for their reactivity with T cells in vitro. Here, we pursued deep ligand sequencing (DLS) as an alternative method of directly identifying those ligands that are epitopes presented to CTLs by the class I human leukocyte antigens (HLA) of infected cells. Soluble class I HLA-A*11:01 (sHLA) was gathered from HIV-1 NL4-3-infected human CD4+ SUP-T1 cells. HLA-A*11:01 harvested from infected cells was immunoaffinity purified and acid boiled to release heavy and light chains from peptide ligands that were then recovered by size-exclusion filtration. The ligands were first fractionated by high-pH high-pressure liquid chromatography and then subjected to separation by nano-liquid chromatography (nano-LC)–mass spectrometry (MS) at low pH. Approximately 10 million ions were selected for sequencing by tandem mass spectrometry (MS/MS). HLA-A*11:01 ligand sequences were determined with PEAKS software and confirmed by comparison to spectra generated from synthetic peptides. DLS identified 42 viral ligands presented by HLA-A*11:01, and 37 of these were previously undetected. These data demonstrate that (i) HIV-1 Gag and Nef are extensively sampled, (ii) ligand length variants are prevalent, particularly within Gag and Nef hot spots where ligand sequences overlap, (iii) noncanonical ligands are T cell reactive, and (iv) HIV-1 ligands are derived from de novo synthesis rather than endocytic sampling. Next-generation immunotherapies must factor these nascent HIV-1 ligand length variants and the finding that CTL-reactive epitopes may be absent during infection of CD4+ T cells into strategies designed to enhance T cell immunity.

Characterization of local and systemic immune-modulation in melanoma patients

Le mélanome cutané est un des cancers les plus agressifs et dont l'incidence augmente le plus en Suisse. Une fois métastatique, le pronostic de survie moyenne avec les thérapies actuelles est d'environ huit mois, avec moins de 5% de survie à cinq ans. Les récents progrès effectués dans la compréhension de la biologie de la cellule tumorale mais surtout dans l'importance du système immunitaire dans le contrôle de ce cancer ont permis le développement de nouveaux traitements novateurs et prometteurs. Ces thérapies, appelées immunothérapies, reposent sur la stimulation et l'augmentation de la réponse immunitaire à la tumeur. Alors que les derniers essais cliniques ont démontré l'efficacité de ces traitements chez les patients avec des stades avancés de la maladie, le contrôle de la maladie à long- terme est seulement atteint chez une minorité des patients. La suppression locale et systémique de la réponse immunitaire spécifique anti-tumorale apparaitrait comme une des raisons expliquant la persistance d'un mauvais pronostic clinique chez ces patients. Des études sur les souris ont montré que les vaisseaux lymphatiques joueraient un rôle primordial dans ce processus en induisant une tolérance immune, ce qui permettrait à la tumeur d'échapper au contrôle du système immunitaire et métastatiser plus facilement. Ces excitantes découvertes n'ont pas encore été établi et prouvé chez l'homme. Dans cette thèse, nous montrons pour la première fois que les vaisseaux lymphatiques sont directement impliqués dans la modulation de la réponse immunitaire au niveau local et systémique dans le mélanome chez l'homme. Ces récentes découvertes montrent le potentiel de combiner des thérapies visant le système lymphatique avec les immunothérapies actuellement utilisées afin d'améliorer le pronostic des patients atteint du mélanome. -- Cutaneous melanoma is one of the most invasive and metastatic human cancers and causes 75% of skin cancer mortality. Current therapies such as surgery and chemotherapy fail to control metastatic disease, and relapse occurs frequently due to microscopic residual lesions. It is, thus, essential to develop and optimize novel therapeutic strategies to improve curative responses in these patients. In recent decades, tumor immunologists have revealed the development of spontaneous adaptive immune responses in melanoma patients, leading to the accumulation of highly differentiated tumor-specific T cells at the tumor site. This remains one of the most powerful prognostic markers to date. Immunotherapies that augment the natural function of these tumor-specific T cells have since emerged as highly attractive therapeutic approaches to eliminate melanoma cells. While recent clinical trials have demonstrated great progress in the treatment of advanced stage melanoma, long-term disease control is still only achieved in a minority of patients. Local and systemic immune suppression by the tumor appears to be responsible, in part, for this poor clinical evolution. These facts underscore the need for a better analysis and characterization of immune- related pathways within the tumor microenvironment (TME), as well as at the systemic level. The overall goal of this thesis is, thus, to obtain greater insight into the complexity and heterogeneity of the TME in human melanoma, as well as to investigate immune modulation beyond the TME, which ultimately influences the immune system throughout the whole body. To achieve this, we established two main objectives: to precisely characterize local and systemic immune modulation (i) in untreated melanoma patients and (ii) in patients undergoing peptide vaccination or checkpoint blockade therapy with anti-cytotoxic T- lymphocyte-asisctaed protein-4 (CTLA-4) antibody. In the first and main part of this thesis, we analyzed lymphatic vessels in relation to anti-tumor immune responses in tissues from vaccinated patients using a combination of immunohistochemistry (IHC) techniques, whole slide scanning/analysis, and an automatic quantification system. Strikingly, we found that increased lymphatic vessel density was associated with high expression of immune suppressive molecules, low functionality of tumor-infiltrating CD8+ T cells and decreased cytokine production by tumor-antigen specific CD8+ T cells in the blood. These data revealed a previously unappreciated local and systemic role of lymphangiogenesis in modulating T cell responses in human cancer and support the use of therapies that target lymphatic vessels combined with existing and future T cell based therapies. In the second objective, we describe a metastatic melanoma patient who developed pulmonary sarcoid-like granulomatosis following repetitive vaccination with peptides and CpG. We demonstrated that the onset of this pulmonary autoimmune adverse event was related to the development of a strong and long-lasting tumor-specific CD8+ T cell response. This constitutes the first demonstration that a new generation tumor vaccine can induce the development of autoimmune adverse events. In the third objective, we assessed the use of Fourier Transform Infrared (FTIR) imaging to identify melanoma cells and lymphocyte subpopulations in lymph node (LN) metastasis tissues, thanks to a fruitful collaboration with researchers in Brussels. We demonstrated that the different cell types in metastatic LNs have different infrared spectral features allowing automated identification of these cells. This technic is therefore capable of distinguishing known and novel biological features in human tissues and has, therefore, significant potential as a tool for histopathological diagnosis and biomarker assessment. Finally, in the fourth objective, we investigated the role of colony- stimulating factor-1 (CSF-1) in modulating the anti-tumor response in ipilimumab-treated patients using IHC and in vitro co-cultures, revealing that melanoma cells produce CSF-1 via CTL-derived cytokines when attacked by cytotoxic T lymphocytes (CTLs), resulting in the recruitment of immunosuppressive monocytes. These findings support the combined use of CSF-1R blockade with T cell based immunotherapy for melanoma patients. Taken together, our results reveal the existence of novel mechanisms of immune modulation and thus promote the optimization of combination immunotherapies against melanoma. -- Le mélanome cutané est un des cancers humains les plus invasifs et métastatiques et est responsable de 75% de la mortalité liée aux cancers de la peau. Les thérapies comme la chirurgie et la chimiothérapie ont échoué à contrôler le mélanome métastatique, par ailleurs les rechutes sous ces traitements ont été montrées fréquentes. Il est donc essentiel de développer et d'optimiser de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer les réponses thérapeutiques de ces patients. Durant les dernières décennies, les immunologistes spécialisés dans les tumeurs ont démontré qu'un patient atteint du mélanome pouvait développer spontanément une réponse immune adaptative à sa tumeur et que l'accumulation de cellules T spécifiques tumorales au sein même de la tumeur était un des plus puissants facteurs pronostiques. Les immunothérapies qui ont pour but d'augmenter les fonctions naturelles de ces cellules T spécifiques tumorales ont donc émergé comme des approches thérapeutiques très attractives pour éliminer les cellules du mélanome. Alors que les derniers essais cliniques ont démontré un progrès important dans le traitement des formes avancées du mélanome, le contrôle de la maladie à long-terme est seulement atteint chez une minorité des patients. La suppression immune locale et systémique apparaitrait comme une des raisons expliquant la persistance d'un mauvais pronostic clinique chez ces patients. Ces considérations soulignent la nécessité de mieux analyser et caractériser les voies immunitaires non seulement au niveau local dans le microenvironement tumoral mais aussi au niveau systémique dans le sang des patients. Le but de cette thèse est d'obtenir une plus grande connaissance de la complexité et de l'hétérogénéité du microenvironement tumoral dans les mélanomes mais aussi d'investiguer la modulation immunitaire au delà du microenvironement tumoral au niveau systémique. Afin d'atteindre ce but, nous avons établi deux objectifs principaux : caractériser précisément la modulation locale et systémique du système immunitaire (i) chez les patients atteints du mélanome qui n'ont pas reçu de traitement et (ii) chez les patients qui ont été traités soit par des vaccins soit par des thérapies qui bloquent les points de contrôles. Dans la première et majeure partie de cette thèse, nous avons analysé les vaisseaux lymphatiques en relation avec la réponse immunitaire anti-tumorale dans les tissus des patients vaccinés grâce à des techniques d'immunohistochimie et de quantification informatisé et automatique des marquages. Nous avons trouvé qu'une densité élevée de vaisseaux lymphatiques dans la tumeur était associée à une plus grande expression de molécules immunosuppressives ainsi qu'à une diminution de la fonctionnalité des cellules T spécifiques tumoral dans la tumeur et dans le sang des patients. Ces résultats révèlent un rôle jusqu'à là inconnu des vaisseaux lymphatiques dans la modulation directe du système immunitaire au niveau local et systémique dans les cancers de l'homme. Cette recherche apporte finalement des preuves du potentiel de combiner des thérapies visant le système lymphatique avec des autres immunothérapies déjà utilisées en clinique. Dans le second objectif, nous rapportons le cas d'un patient atteint d'un mélanome avec de multiples métastases qui a développé à la suite de plusieurs vaccinations répétées et consécutives avec des peptides et du CpG, un évènement indésirable sous la forme d'une granulomatose pulmonaire sarcoid-like. Nous avons démontré que l'apparition de cet évènement était intimement liée au développement d'une réponse immunitaire durable et spécifique contre les antigènes de la tumeur. Par là- même, nous prouvons pour la première fois que la nouvelle génération de vaccins est aussi capable d'induire des effets indésirables auto-immuns. Pour le troisième objectif, nous avons voulu savoir si l'utilisation de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) était capable d'identifier les cellules du mélanome ainsi que les différents sous-types cellulaires dans les ganglions métastatiques. Grâce à nos collaborateurs de Bruxelles, nous avons pu établir que les diverses composantes cellulaires des ganglions atteints par des métastases du mélanome présentaient des spectres infrarouges différents et qu'elles pouvaient être identifiées d'une façon automatique. Cette nouvelle technique permettrait donc de distinguer des caractéristiques biologiques connues ou nouvelles dans les tissus humains qui auraient des retombées pratiques importantes dans le diagnostic histopathologique et dans l'évaluation des biomarqueurs. Finalement dans le dernier objectif, nous avons investigué le rôle du facteur de stimulation des colonies (CSF-1) dans la modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale chez les patients qui ont été traités par l'Ipilimumab. Nos expériences in vivo au niveau des tissus tumoraux et nos co-cultures in vitro nous ont permis de démontrer que les cytokines secrétées par les cellules T spécifiques anti-tumorales induisaient la sécrétion de CSF-1 dans les cellules du mélanome ce qui résultait en un recrutement de monocytes immunosuppresseurs. Dans son ensemble, cette thèse révèle donc l'existence de nouveaux mécanismes de modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale et propose de nouvelles optimisations de combinaison d'immunothérapies contre le mélanome.

Valeur diagnostique du rapport CD103+CD4+/CD4+ pour différencier la sarcoïdose d'autres causes de lymphocytose alvéolaire.

Introduction: CD103 is a specific integrin present on some CD4+ lymphocytes of the mucosal immune system. It has been hypothesized that most CD4+ lymphocytes in pulmonary sarcoidosis do not originate from mucosal sites but from redistribution from the peripheral blood, and therefore do not bear the CD103 integrin. Several studies have suggested that a low CD103+ percentage among bronchoalveolar lavage (BAL) CD4+ lymphocytes discriminates between sarcoidosis and other causes of lymphocytic alveolitis, but contradictory data exist. Methods: We reviewed 1151 consecutive patients with BAL lymphocytosis >10% and flow cytometry performed between 2006 and 2014. 944 cases were excluded due to poor BAL quality (n= 97), unavailable clinical data (n= 760), or unclear diagnosis (n= 87). The remaining 207 patients were grouped into 9 diagnostic categories. To assess the discriminative value of the CD103+CD4+/CD4+ ratio to distinguish sarcoidosis from the other entities, area under ROC curves (AUC) were determined. Results: Sarcoidosis patients (n=53) had a lower CD103+CD4+/CD4+ ratio than the other diagnostic categories. AUC was 62% for sarcoidosis compared to all other patients and 69% for sarcoidosis compared to other interstitial lung diseases. When combining CD103+CD4+/CD4+ and CD4+/CD8+ ratios, AUC increased to 76% and 78% respectively. When applying published cut-offs from 4 previous studies to our population, AUC varied between 54 and 73%. Conclusions: The CD103+CD4+/CD4+ ratio does not accurately discriminate between sarcoidosis and other causes of lymphocytic alveolitis, neither alone nor in combination with CD4+/CD8+ ratio, and is not a relevant marker for the diagnosis of sarcoidosis.

Spinal Cord T-Cell Infiltration in the Rat Spared Nerve Injury Model: A Time Course Study.

The immune system is involved in the development of neuropathic pain. In particular, the infiltration of T-lymphocytes into the spinal cord following peripheral nerve injury has been described as a contributor to sensory hypersensitivity. We used the spared nerve injury (SNI) model of neuropathic pain in Sprague Dawley adult male rats to assess proliferation, and/or protein/gene expression levels for microglia (Iba1), T-lymphocytes (CD2) and cytotoxic T-lymphocytes (CD8). In the dorsal horn ipsilateral to SNI, Iba1 and BrdU stainings revealed microglial reactivity and proliferation, respectively, with different durations. Iba1 expression peaked at D4 and D7 at the mRNA and protein level, respectively, and was long-lasting. Proliferation occurred almost exclusively in Iba1 positive cells and peaked at D2. Gene expression observation by RT-qPCR array suggested that T-lymphocytes attracting chemokines were upregulated after SNI in rat spinal cord but only a few CD2/CD8 positive cells were found. A pronounced infiltration of CD2/CD8 positive T-cells was seen in the spinal cord injury (SCI) model used as a positive control for lymphocyte infiltration. Under these experimental conditions, we show early and long-lasting microglia reactivity in the spinal cord after SNI, but no lymphocyte infiltration was found.

CD8 engineered cytotoxic T cells reprogram melanoma tumor environment.

NlmCategory="UNASSIGNED">Cytotoxic T lymphocytes (CTL) from CD8β-deficient mice have powerful FasL-mediated cytotoxicity and IFNγ responses, but ablated Ca(2+) and NFAT signaling, which can be restored by transduction with CD8β. Upon infection with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), these cells yielded GP33-specific CTL (CD8βR) that exhibited high FasL/Fas-mediated cytotoxicity, IFNγ CXCL9 and 10 chemokine responses. Transfer of these cells in B16-GP33 tumor bearing mice resulted in (i) massive T cell tumor infiltration, (ii) strong reduction of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), regulatory T cells (Treg) and IL-17-expressing T helper cells, (iii) maturation of tumor-associated antigen-presenting cells and (iv) production of endogenous, B16 melanoma-specific CTL that eradicated the tumor long after the transferred CD8βR CTL perished. Our study demonstrates that the synergistic combination of strong Fas/FasL mediated cytotoxicity, IFNγ and CXCL9 and 10 responses endows adoptively transferred CTL to reprogram the tumor environment and to thus enable the generation of endogenous, tumoricidal immunity.

Evaluation of bursal lymphoid depletion: comparison between the conventional histology method and digital lymphocyte depletion evaluation system

Abstract: Fifty-five bursa of Fabricius (BF) were evaluated by optical microscopy for three different avian histopathologists (H1, H3 and H4) to determine the degree of lymphoid depletion. One histologist evaluated the same slides at two different times (H1 and H2) with four-months interval between the observations. The same BFs were evaluated using the system of Digital Lymphocyte Depletion Evaluation (ADDL), being performed by three differents operators of the system, not histopathologists. The results showed was a significant difference between the histopathologists and between the scores established by the same expert (H1 and H2). However, there were not significant differences between the scores with the ADDL system, obtained using ADDL. The results make clear the fragility of the subjective lymphocyte depletion score classification by the traditional histologic method, while the ADDL system proves to be more appropriated for the assessment of the lymphoid loss in the BF.

Inflammatory and anti-inflammatory effects of soybean agglutinin

Soybean agglutinin (SBA) lectin, a protein present in raw soybean meals, can bind to and be extensively endocytosed by intestinal epithelial cells, being nutritionally toxic for most animals. In the present study we show that SBA (5-200 µg/cavity) injected into different cavities of rats induced a typical inflammatory response characterized by dose-dependent exudation and neutrophil migration 4 h after injection. This effect was blocked by pretreatment with glucocorticoid (0.5 mg/kg) or by co-injection of N-acetyl-galactosamine (100 x [M] lectin), but not of other sugars (100 x [M] lectin), suggesting an inflammatory response related to the lectin activity. Neutrophil accumulation was not dependent on a direct effect of SBA on the macrophage population since the effect was not altered when the number of peritoneal cells was increased or decreased in vivo. On the other hand, SBA showed chemotactic activity for human neutrophils in vitro. A slight increase in mononuclear cells was observed 48 h after ip injection of SBA. Phenotypic analysis of these cells showed an increase in the CD4+/CD8- lymphocyte population that returned to control levels after 15 days, suggesting the development of an immune response. SBA-stimulated macrophages presented an increase in the expression of CD11/CD18 surface molecules and showed some characteristics of activated cells. After intravenous administration, SBA increased the number of circulating neutrophils and inhibited in a dose-dependent manner the neutrophil migration induced by ip injection of carrageenan into peritoneal cavities. The co-injection of N-acetyl-galactosamine or mannose, but not glucose or fucose, inhibited these effects. The data indicate that soybean lectin is able to induce a local inflammatory reaction but has an anti-inflammatory effect when present in circulating blood

Immunologic patterns associated with cure in human American cutaneous leishmaniasis

Patients with American cutaneous leishmaniasis were studied before therapy (active lesion) and at the end of therapy (cured patients). Assays of lymphocyte proliferative responses of peripheral blood mononuclear cells induced in vitro by Leishmania braziliensis promastigote antigens (Lb) were performed. Antigen-stimulated cells were harvested for CD4 and CD8 phenotype analysis and the levels of gamma interferon (IFN-<FONT FACE="Symbol">g</font>) and interleukin 4 (IL-4) produced were also determined in the culture supernatants. Two different patterns of Lb-induced T cell responses were observed: a) predominance of responding CD4+ cells and mixed type 1 and type 2 cytokine production (IFN-<FONT FACE="Symbol">g</font> and IL-4) during the active disease, and b) similar proportions of responding CD4+ and CD8+ cells, and type 1 cytokine production (presence of IFN-<FONT FACE="Symbol">g</font> and very low IL-4) at the end of therapy (healed lesions). This last pattern is probably associated with a beneficial T cell response

Detection of early apoptosis and cell death in T CD4+ and CD8+ cells from lesions of patients with localized cutaneous leishmaniasis

Human localized cutaneous leishmaniasis (LCL), induced by Leishmania braziliensis, ranges from a clinically mild, self-healing disease with localized cutaneous lesions to severe forms which can present secondary metastatic lesions. The T cell-mediated immune response is extremely important to define the outcome of the disease; however, the underlying mechanisms involved are not fully understood. A flow cytometric analysis of incorporation of 7-amino actinomycin D and CD4+ or CD8+ T cell surface phenotyping was used to determine whether different frequencies of early apoptosis or accidental cell death occur at different stages of LCL lesions. When all cells obtained from a biopsy sample were analyzed, larger numbers of early apoptotic and dead cells were observed in lesions from patients with active disease (mean = 39.5 ± 2.7%) as compared with lesions undergoing spontaneous healing (mean = 17.8 ± 2.2%). Cells displaying normal viability patterns obtained from active LCL lesions showed higher numbers of early apoptotic events among CD8+ than among CD4+ T cells (mean = 28.5 ± 3.8 and 15.3 ± 3.0%, respectively). The higher frequency of cell death events in CD8+ T cells from patients with LCL may be associated with an active form of the disease. In addition, low frequencies of early apoptotic events among the CD8+ T cells were observed in two patients with self-healing lesions. Although the number of patients in the latter group was small, it is possible to speculate that, during the immune response, differences in apoptotic events in CD4+ and CD8+ T cell subsets could be responsible for controlling the CD4/CD8 ratio, thus leading to healing or maintenance of disease.