Impaired liver regeneration in inducible nitric oxide synthasedeficient mice

The mechanisms that permit adult tissues to regenerate when injured are not well understood. Initiation of liver regeneration requires the injury-related cytokines, tumor necrosis factor (TNF) α and interleukin (IL) 6, and involves the activation of cytokine-regulated transcription factors such as NF-κβ and STAT3. During regeneration, TNFα and IL-6 promote hepatocyte viability, as well as proliferation, because interventions that inhibit either cytokine not only block hepatocyte DNA synthesis, but also increase liver cell death. These observations suggest that the cytokines induce hepatoprotective factors in the regenerating liver. Given evidence that nitric oxide can prevent TNF-mediated activation of the pro-apoptotic protease caspase 3 and protect hepatocytes from cytokine-mediated death, cytokine-inducible nitric oxide synthase (iNOS) may be an important hepatoprotective factor in the regenerating liver. In support of this hypothesis we report that the hepatocyte proliferative response to partial liver resection is severely inhibited in transgenic mice with targeted disruption of the iNOS gene. Instead, partial hepatectomy is followed by increased caspase 3 activity, hepatocyte death, and liver failure, despite preserved induction of TNFα, IL-6, NF-κβ, and STAT3. These results suggest that during successful tissue regeneration, injury-related cytokines induce factors, such as iNOS and its product, NO, that protect surviving cells from cytokine-mediated death.

Telomerase activity: A biomarker of cell proliferation, not malignant transformation

Telomerase activity is readily detected in most cancer biopsies, but not in premalignant lesions or in normal tissue samples with a few exceptions that include germ cells and hemopoietic stem cells. Telomerase activity may, therefore, be a useful biomarker for diagnosis of malignancies and a target for inactivation in chemotherapy or gene therapy. These observations have led to the hypothesis that activation of telomerase may be an important step in tumorigenesis. To test this hypothesis, we studied telomerase activity in isogeneic samples of uncultured and cultured specimens of normal human uroepithelial cells (HUCs) and in uncultured and cultured biopsies of superficial and myoinvasive transitional cell carcinoma (TCC) of the bladder. Our results demonstrated that four of four TCC biopsies, representing both superficial and myoinvasive TCCs, were positive for telomerase activity, but all samples of uncultured HUC were telomerase negative. However, when the same normal HUC samples were established as proliferating cultures in vitro, telomerase activity was readily detected but usually at lower levels than in TCCs. Consistent with the above observation of the telomerase activity in HUCs, telomeres did not shorten during the HUC in vitro lifespan. Demonstration of telomerase in proliferating human epithelial cells in vitro was not restricted to HUCs, because it was also present in prostate and mammary cell cultures. Notably, telomerase activity was relatively low or undetectable in nonproliferating HUC cultures. These data do not support a model in which telomerase is inactive in normal cells and activated during tumorigenic transformation. Rather, these data support a model in which the detection of telomerase in TCC biopsies, but not uncultured HUC samples, reflects differences in proliferation between tumor and normal cells in vivo.

Inherited susceptibility to uterine leiomyomas and renal cell cancer

Herein we report the clinical, histopathological, and molecular features of a cancer syndrome with predisposition to uterine leiomyomas and papillary renal cell carcinoma. The studied kindred included 11 family members with uterine leiomyomas and two with uterine leiomyosarcoma. Seven individuals had a history of cutaneous nodules, two of which were confirmed to be cutaneous leiomyomatosis. The four kidney cancer cases occurred in young (33- to 48-year-old) females and displayed a unique natural history. All these kidney cancers displayed a distinct papillary histology and presented as unilateral solitary lesions that had metastasized at the time of diagnosis. Genetic-marker analysis mapped the predisposition gene to chromosome 1q. Losses of the normal chromosome 1q were observed in tumors that had occurred in the kindred, including a uterine leiomyoma. Moreover, the observed histological features were used as a tool to diagnose a second kindred displaying the phenotype. We have shown that predisposition to uterine leiomyomas and papillary renal cell cancer can be inherited dominantly through the hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC) gene. The HLRCC gene maps to chromosome 1q and is likely to be a tumor suppressor. Clinical, histopathological, and molecular tools are now available for accurate detection and diagnosis of this cancer syndrome.

Identification of a unique membrane-bound molecule on a hemopoietic stem cell line and on multipotent progenitor cells.

Hemopoietic stem cells are a distinct population of cells that can differentiate into multilineages of hemopoietic cells and have long-term repopulation capability. A few membrane-bound molecules have been found to be preferentially, but not uniquely, present on the surface of these primitive cells. We report here the identification of a unique 105-kDa glycoprotein on the surface of hemopoietic stem cell line BL3. This molecule, recognized by the absorbed antiserum, is not present on the surface of myeloid progenitors 32D and FDC-P1 cells, EL4 T cells, and NIH 3T3 fibroblasts. This antiserum can also be used to block the proliferation of BL3 cells even in the presence of mitogen-stimulated spleen cell conditioned medium, which is known to have a stimulating activity on BL3 cells. It can also inhibit development of in vitro, fetal liver cell-derived multilineage colonies, but not other types of colonies, and of in vivo bone marrow cell-derived colony-forming unit spleen foci. These data suggest that gp105 plays an important role in hemopoietic stem cell differentiation.

Resistência de células de carcinoma epidermóide bucal à terapia fotodinâmica mediada pelo ácido 5-aminolevulínico

O carcinoma epidermóide bucal (CEC) é uma neoplasia maligna com alta morbidade e mortalidade e de difícil tratamento. O tratamento convencional para o CEC inclui cirurgia e radioterapia, seguida ou não de quimioterapia. Apesar de serem amplamente difundidos, esses tratamentos podem ser ineficazes para alguns CECs resistentes. A terapia fotodinâmica (PDT) oncológica tem sido utilizada para o tratamento adjuvante do CEC bucal, principalmente nos casos menos invasivos e que necessitam de redução do tumor para a ressecção cirúrgica. Contudo, semelhantemente aos tratamentos convencionais, a PDT pode também induzir o aparecimento de populações celulares resistentes, fato já descrito para carcinoma cutâneo, adenocarcinoma de cólon e adenocarcinoma mamário. A hipótese de que células de CEC bucal possam desenvolver resistência à PDT ainda não foi testada. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar se células de CEC bucal (SCC9) desenvolvem resistência a ciclos repetidos de PDT mediada pelo ácido 5- aminolevulínico (5-ALA-PDT) e avaliar se nesse processo ocorre modificação da expressão de marcadores relacionados a sobrevivência celular (NF?B, Bcl-2, iNOS, mTOR e Akt). Foi utilizada linhagem de células de CEC bucal (SCC9), submetida às seguintes condições: 1) Controle - células cultivadas sem nenhum tratamento; 2) ALA - células incubadas com 5-ALA (1mM durante 4 horas); 3) LED - tratadas com iluminação LED (630nm, 5,86J/cm2, 22,5J, 150mW, 150s); 4) PDT - tratadas com 5- ALA-PDT, com os protocolos do grupo ALA e LED combinados, gerando dose letal de 90%. Inicialmente foi realizado somente um ciclo de PDT, sendo avaliada a viabilidade celular em todos os grupos após 24, 48, 72 e 120h da irradiação. Também foi realizado ensaio de detecção da fragmentação de DNA (TUNEL) e análise por imunofluorescência da expressão das proteínas NF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt nas células viáveis. Como resultado desse primeiro tratamento com 5-ALA-PDT, observou-se que as células sobreviventes ao tratamento apresentaram intensa marcação para pmTOR e exibiram potencial de crescimento durante o período analisado. Após esses ensaios, as células que sobreviveram a essa primeira sessão foram coletadas, replaqueadas e novamente cultivadas, sendo então submetidas a novo ciclo de 5-ALA-PDT. Esse processo foi realizado 5 vezes, variando-se a intensidade de irradiação à medida que se observava aumento na viabilidade celular. As populações celulares que exibiram viabilidade 1,5 vezes maior do que a detectada no primeiro ciclo PDT foram consideradas resistentes ao tratamento. Os mesmos marcadores analisados no primeiro ciclo de PDT foram novamente avaliados nas populações resistentes. Foram obtidas quatro populações celulares resistentes, com viabilidade de até 4,6 vezes maior do que a do primeiro ciclo de PDT e irradiação com LED que variou de 5,86 a 9,38J/cm2. A população mais resistente apresentou ainda menor intensidade de protoporfirina IX, maior capacidade de migração e modificação na morfologia nuclear. As populações resistentes testadas exibiram aumento na expressão de pNF?B, iNOS, pmTOR e pAkt, mas não da proteína anti-apoptótica Bcl- 2. Ensaio in vivo foi também conduzido em ratos, nos quais CEC bucal foi quimicamente induzido e tratado ou não com 5-ALA-PDT. Houve intensa expressão imuno-histoquímica das proteínas pNF?B, Bcl-2, iNOS, pmTOR e pAkt em relação ao controle não tratado, nas células adjacentes à área de necrose provocada pela PDT. Concluiu-se que as células de CEC bucal tratadas com 5-ALA-PDT a uma dose de 90% de letalidade desenvolveram viabilidade crescente após ciclos repetidos do tratamento, bem como exibiram superexpressão de proteínas relacionadas à sobrevivência celular, tanto in vitro quanto in vivo. Esses fatos, aliados à maior capacidade de migração, sugerem a aquisição de fenótipo de resistência à 5-ALAPDT. Esse aspecto deve ser cuidadosamente considerado no momento da instituição dessa terapia para os CECs bucais.

Expressão dos receptores Toll-like em carcinoma espinocelular de orofaringe

Nos últimos anos, notou-se aumento da incidência de carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF) associado ao HPV. Sabe-se que CECOF associado ao HPV apresenta melhor prognóstico do que CECOF não infectado por HPV. Inúmeros estudos em carcinoma cervical demonstram alterações de TLRs, isto provavelmente devido às associações das oncoproteínas E6 e E7 com estes receptores. Em humanos, existem 10 TLRs identificados, os quais colaboram na resposta imune contra bactérias, fungos e vírus, bem como colaboram na promoção ou regressão do tumor. Esta influência do TLR na carcinogênese tem sido alvo de inúmeros estudos devido à ligação entre inflamação e o câncer. O presente trabalho teve como objetivo verificar diferenças na expressão e função de receptores Toll-like em carcinoma espinocelular de orofaringe (CECOF). Para tal, foram utilizados trinta e sete espécimes diagnosticados como CECOF e a expressão imuno-histoquímica das proteínas p16 e TLR4 analisadas. Duas linhagens de CECOF HPV16 + e duas CECOF HPV-. foram utilizadas para análise da expressão de TLR1-10, IL-6 e IL-8, por qPCR. A detecção dos principais TLRs (TLR1, TLR2, TLR6 e TLR4) foi feita por citometria de fluxo. Para ativação da via de sinalização de TLR2, e posterior análise da expressão de IL6 e IL8, as células foram estimuladas com peptidoglicano. Para verificar a expressão e função de TLR4, as células foram estimuladas com LPS e LPS UP para posterior análise de IL-6 e IL-8, por ELISA. Os resultados demonstraram diferenças na expressão gênica de TLR1 e TLR6 entre as linhagens HPV- e o grupo HPV+ e diferenças na expressão proteica de TLR9. TLR2 apresentou aumento da expressão proteica em todas as linhagens e demonstra desencadeamento da resposta imune, com secreção de IL6 e IL8 nas linhagens HPV- (SCC72 e SCC89) e em uma das linhagens HPV+ (SCC2). Interessantemente, TLR4 não apresentou diferenças significativas na expressão gênica e proteica. Entretanto, as linhagens HPV+ não demonstraram resposta pró-inflamatória mesmo quando estimuladas com LPS e LPS ultra puro, agonista específico de TLR4. Assim, este trabalho contribui para estabelecer o perfil da expressão dos receptores Toll-like em linhagens celulares de CECOF HPV- e HPV+, e aponta para alterações ocorridas na via de sinalização mediada por TLR4. Além disso, nossos resultados abrem portas para futuros estudos na avaliação de alterações causadas no sistema imune inato pelo HPV, em carcinomas espinocelulares de orofaringe.

Avaliação do potencial antiproliferativo do Dendrímero de Poliglicerol associado ao celecoxibe em linhagens celulares de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço

Diversos mecanismos celulares estão associados à patogênese do Carcinoma Epidermoide de Cabeça e Pescoço (CECP). Algumas dessas alterações envolvem proteínas pertencentes à via de sinalização do Akt, e o fator de transcrição NF-kB, o qual têm importante papel na fisiologia normal e no câncer. A proteína COX-2, descrita em processos inflamatórios, também participa da carcinogênese e está associada com a via de sinalização do Akt e com o NF-kB. Dendrímeros são uma forma única de nanotecnologia, surgindo como nanotransportadores com a capacidade de penetrar na célula tumoral liberando drogas quimioterápicas em seu interior. Os benefícios desta tecnologia são o aumento da eficicácia do princípio ativo utilizado e a redução dos seus efeitos secundários tóxicos. O Celecoxibe, antiinflamatório não esteroidal, inibidor seletivo da COX-2, tem se mostrado um importante agente anticarcinogênico, no entanto seu mecanismo de ação no CECP não é totalmente compreendido. Neste trabalho, um Dendrímero de Poliglicerol associado ao Celecoxibe (PGLD-celecoxibe) foi sintetizado e caracterizado por técnicas de espectroscopia ¹H-RMN, ¹³C-RMN, Maldi-Tof, TLC e DSC. Além disso, o conjugado foi testado in vitro em três linhagens celulares de CECP. O PGLD-Celecoxibe foi sintetizado com sucesso e promoveu a redução da dose capaz de inibir a proliferação celular, reduzindo o IC 50 do Celecoxibe de forma significativa em todas as linhagens celulares, se aproximando da dose sérica alcançada por este medicamento, resultado corroborado pelo Ensaio de Migração Celular. O mecanismo de morte celular observado foi a apoptose, associada a diminuição significativa da expressão de COX-2 ou por uma via alternativa independente. Alguns dos grupos tratados apresentaram alteração na expressão das proteínas pAkt e NF-kB.

Detecção dos herpesvirus humanos na mucosa oral de pacientes irradiados para tratamento de carcinoma epidermoide em região de cabeça e pescoço

A radioterapia para tratamento das neoplasias malignas em região de cabeça e pescoço é acompanhada de diversas complicações, decorrentes do comprometimento dos tecidos radiossensíveis localizados próximos ao tumor. Entre essas complicações a mucosite é a que merece maior destaque. A mucosite é uma reação tóxica inflamatória da mucosa oral causada pelo tratamento citorredutivo induzido pela radioterapia (RT) ou pela quimioterapia (QT). Ela manifesta-se com sinais de edema, eritema, úlcera e formação pseudomembrana, resultando em sintomas de ardência, que pode progredir para dor intensa e consequente prejuízo na alimentação e comunicação verbal. Infecções bacterianas, fúngicas ou virais podem acometer a mucosa bucal irradiada e exacerbar a manifestação da mucosite oral por meio da ativação de fatores de transcrição da resposta inflamatória. Existem poucos dados na literatura sobre a participação dos herpesvirus humanos na mucosite oral induzida pela radioterapia. A proposta desse trabalho foi avaliar a excreção oral dos herpesvirus humanos (HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV, HHV6, HHV7 e HHV8) e sua possível associação com o desenvolvimento e agravamento da mucosite oral, em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide (CEC) de boca e orofaringe, submetidos à radioterapia associado à quimioterapia. Nesse estudo foram analisadas 158 amostras de lavado bucal, de 20 pacientes, submetidos à radioterapia para CEC em região de cabeça e pescoço, coletadas semanalmente, durante todo o tratamento. Foi realizada a extração do DNA dessas amostras e em seguida sua amplificação através da PCR utilizando dois conjuntos de primers: HSVP1/P2 para os subtipos HSV-1, HSV-2, EBV, CMV e HHV-8 e o VZVP1/P2 para os subtipos VZV, HHV-6 e HHV-7. As amostras positivas foram submetidas à digestão enzimática com enzimas de restrição BamHI e BstUI para determinação específica de cada um dos oito herpesvirus. Foi também avaliada clinicamente, a mucosite oral, em cada uma das coletas, seguindo os critérios da OMS e NCIC. As análises da amostra mostraram a excreção do EBV, HHV-6 e HHV-7, em todas as semanas de tratamento radioterápico, enquanto que a excreção do HSV1 não pode ser observada no momento da triagem. Considerando-se todos os períodos em conjunto (Triagem, semanas de radioterapia e Controle), a maior frequência foi de pacientes que excretaram EBV (55,0%), seguida daqueles que excretaram HHV-7 (20,5%). A frequência de excreção de EBV foi significativamente maior do que a dos demais vírus (Teste ?2, p<0.001 para todos os cruzamentos). A frequência de excreção de HHV-7 foi significativamente maior do que a de HSV-1 (5,9%) e HHV-6 (5,5%) (Teste ?2, p=0.001 para ambos os cruzamentos). Não houve diferenças estatísticas significantes entre as frequências de HSV-1 e HHV-6. Como conclusão, verificou-se uma correlação positiva entre a excreção oral do EBV e a presença de mucosite induzida pela associação de radioterapia e quimioterapia com graus >=2, sobretudo se considerarmos as três últimas semanas de radioterapia, período este em que a severidade da mucosite foi estatisticamente maior. Esses achados nos possibilitam inferir que o ambiente inflamatório local de mucosites com grau >=2 seja mais favorável para excreção oral do EBV.

Carcinoma renal em doentes com leiomiomatose hereditária e cancro de células renais : a propósito de um caso clínico

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Antitumor activity of 3-ingenyl angelate: Plasma membrane and mitochondrial disruption and necrotic cell death

Options for skin cancer treatment currently include surgery, radiotherapy, topical chemotherapy, cryosurgery, curettage, and electrodes-sication. Although effective, surgery is costly and unsuitable for certain patients. Radiotherapy can leave a poor cosmetic effect, and current chemotherapy is limited by low cure rates and extended treatment schedules. Here, we describe the preclinical activity of a novel topical chemotherapeutic agent for the treatment of skin cancer, 3-ingenyl angelate (PEP005), a hydrophobic diterpene ester isolated from the plant Euphorbia peplus. Three daily topical applications of 42 nmol (18 mug) of PEP005 cured a series of s.c. mouse tumors (B16 melanoma, LK2 UV-induced squamous cell carcinoma, and Lewis lung carcinoma; it = >14 tumors/group) and human tumors (DO4 melanoma, HeLa cervical carcinoma, and PC3 and DU145 prostate carcinoma; it = >4 tumors/group) previously established (5-10 mm(3)) on C57BL/6 or Fox1(nu) mice. The treatment produced a mild, short-term erythema and eschar formation but, ultimately, resulted in excellent skin cosmesis. The LD90 for PEP005 for a panel of tumor cell lines was 180-220 muM. Electron microscopy showed that treatment with PEP005 both ill vitro (230 tot) and ill vivo (42 nmol) rapidly caused swelling of mitochondria and cell death by primary necrosis. Cr-51 release, uptake of propidium iodide, and staining with the mitochondria dye JC1, revealed that PEP005 (230 muM) treatment of tumor cells ill vitro resulted in a rapid plasma membrane perturbation and loss of mitochondrial membrane potential. PEP005 thus emerges as a new topical anti-skin cancer agent that has a novel mode of action involving plasma membrane and mitochondrial disruption and primary necrosis, ultimately resulting in an excellent cosmetic outcome.

Use of oesophagogastroscopy to assess the response of oesophageal carcinoma to neoadjuvant therapy

Background: Approximately 25 per cent of patients with oesophageal cancer who undergo neoadjuvant chemoradiotherapy have no evidence of tumour in the resected specimen (complete pathological response). Those who do not respond have a poor 5-year survival compared with complete responders, regardless of whether or not they undergo surgery. Selecting for surgery only those who have a response to neoadjuvant therapy has the potential to improve overall survival as well as to rationalize the management of non-responders. This study assessed the accuracy of oesophagogastroscopy in this setting. Methods: A prospective database of 804 patients undergoing oesophageal resection for carcinoma was reviewed. Endoscopic assessment of the response to neoadjuvant therapy in 100 consecutive patients was compared with the pathological assessment of response. The survival for each level of response was compared. Results: At endoscopy 30 patients were considered to have had a complete response. This was confirmed pathologically in 15 patients. Survival was improved in those with a pathologically confirmed complete response (3-year survival rate 62.4 (s.e. 12.9) per cent) compared with non-responders (16.3 (s.e. 6.6) per cent). Those with microscopic residual disease also had an improved 3-year survival rate (46.3 (s.e. 12.2) per cent); however, oesophagogastroscopy failed to identify this subset. Conclusion: Oesophagogastroscopy may be useful in the assessment of tumour response to neoadjuvant therapy. However, owing to its poor accuracy patients should not be excluded from further therapeutic intervention on the basis of this assessment alone.

An in vivo comparative study of sonic, desert and Indian hedgehog reveals that hedgehog pathway activity regulates epidermal stem cell homeostasis

Despite the well-characterised role of sonic hedgehog (Shh) in promoting interfollicular basal cell proliferation and hair follicle downgrowth, the role of hedgehog signalling during epidermal stem cell fate remains largely uncharacterised. In order to determine whether the three vertebrate hedgehog molecules play a role in regulating epidermal renewal we overexpressed sonic (Shh), desert (Dhh) and Indian (Ihh) hedgehog in the basal cells of mouse skin under the control of the human keratin 14 promoter. We observed no overt epidermal morphogenesis phenotype in response to Ihh overexpression, however Dhh overexpression resulted in a range of embryonic and adult skin manifestations indistinguishable from Shh overexpression. Two distinct novel phenotypes were observed amongst Shh and Dhh transgenics, one exhibiting epidermal progenitor cell hyperplasia with the other displaying a complete loss of epidermal tissue renewal indicating deregulation of stem cell activity. These data suggest that correct temporal regulation of hedgehog activity is a key factor in ensuring epidermal stem cell maintenance. In addition, we observed Shh and Dhh transgenic skin from both phenotypes developed lesions reminiscent of human basal cell carcinoma (BCC), indicating that BCCs can be generated despite the loss of much of the proliferative (basal) compartment. These data suggest the intriguing possibility that BCC can arise outside the stem cell population. Thus the elucidation of Shh (and Dhh) target gene activation in the skin will likely identify those genes responsible for increasing the proliferative potential of epidermal basal cells and the mechanisms involved in regulating epidermal stem cell fate.

Antioxidative function of L-FABP in L-FABP stably transfected Chang liver cells

Liver fatty acid binding protein (L-FABP) contains amino acids that are known to possess antioxidant function. In this study, we tested the hypothesis that L-FABP may serve as an effective endogenous cytoprotectant against oxidative stress. Chang liver cells were selected as the experimental model because of their undetectable L-FABP mRNA level. Full-length L-FABP cDNA was subcloned into the mammalian expression vector pcDNA3.1 (pcDNA-FABP). Chang cells were stably transfected with pc-DNA-FABP or vector (pcDNA3.1) alone. Oxidative stress was induced by incubating cells with 400 mu mol/L H2O2 or by subjecting cells to hypoxia/reoxygenation. Total cellular reactive oxygen species (ROS) was determined using the fluorescent probe DCF. Cellular damage induced by hypoxia/reoxygenation was assayed by lactate dehydrogenase (LDH) release. Expression of L-FABP was documented by regular reverse transcription polyrnerase chain reaction (RT-PCR), real-time RT-PCR, and Western blot. The pcDNA-FABP-transfected cells expressed full-length L-FABP mRNA, which was absent from vector-transfected control cells. Western blot showed expression of 14-kd L-FABP protein in pcDNA-FABP-transfected cells, but not in vector-transfected cells. Transfected cells showed decreased DCF fluorescence intensity under oxidative stress (H2O2 and hypoxia/reoxygenation) conditions versus control in inverse proportion to the level of L-FABP expression. Lower LDH release was observed in the higher L-FABP-expressed cells in hypoxia/reoxygenation experiments. In conclusion, we successfully transfected and cloned a Chang liver cell line that expressed the L-FABP gene. The L-FABP-expressing cell line had a reduced intracellular ROS level versus control. This finding implies that L-FABP has a significant role in oxidative stress.