Interaccion de proteínas en estados intermediarios de plegamiento con membranas lipídicas

Comprender cómo una proteína adquiere su conformación tridimensional específica es un problema clave para la biología celular y molecular. Es un entretenido desafío intelectual y un problema de considerable importancia tecnológica debido al interés de expresar proteínas recombinantes biológicamente activas. Un fuerte incentivo es poder describir cómo ocurre el plegamiento en el medio celular, acoplado a la biosíntesis de la proteína y probablemente codificado por la secuencia primaria. La mayor parte de la información que disponemos, sin embargo, proviene de estudios estructurales, cinéticos, bioquímicos y termodinámicos in vitro de proteínas maduras. Particularmente importante pata la comprensión del problema del plegamiento ha sido la descripción de las rutas seguidas y de los estados intermedios de este proceso. Uno de estos estados intermedios es el glóbulo fundido: es un estado conformacional en el cual la proteína conserva su estructura terciaria. La proteína se encuentra parcialmente desplegada pero su grado de compactación es similar al del estado nativo. Aunque solo algunas proteínas pueden ser asimiladas en esa conformación, es aceptado que el glóbulo fundido es intermedio cinético entre la estructura nativa y la desplegada existencia universal. El estudio de proteínas en el estado de glóbulo fundido no sólo es relevante para comprender los procesos de plegamiento, sino también la inserción y translocación de proteínas solubles e intrínsecas en membranas lipídicas. (...) El objetivo general de este proyecto es estudiar las interacciones de proteínas en estados conformacionales intermedios con membranas lipídicas. El propósito es contribuir al conocimiento de los mecanismos por los cuales una proteína soluble puede, en ciertas circunstancias, penetrar y atravesar una membrana lipídica y estudiar de que manera el ambiente lipídico participa en el procesos de plegamiento de una proteína de membrana. Como modelo experimental se utilizará inicialmente a-lactoalbúmina, cuyo intermediario de plegamiento estable es el más estudiado y con la cual este grupo de trabajo posee experiencia. Se explorará también la posibilidad de utilizar otras proteínas, como anhidrasa carbónica, cuyos intermediarios de plegamiento pueden ser aislados. Se estudiarán particularmente los siguientes aspectos: 1. Estabilidad del intermediario en membrana 2. Estructura de intermediarios en membranas lipídicas. (...)

Preservación de la información génica en bacterias; mecanismos y modulación molecular. Preservation of the genetic information in bacteria; mechanisms and molecular modulation.

El objetivo general del presente proyecto es contribuir a la caracterización genética y bioquímica molecular de mecanismos involucrados en el mantenimiento de la información génica, a través del estudio de sistemas fisiológicos involucrados en la prevención, reparación y tolerancia de mutaciones. Dichos sistemas se encuentran evolutivamente conservados y ampliamente distribuidos en los seres vivos. La importancia de los mismos se refleja en el hecho que su deficiencia genera en humanos, enfermedades genéticas, apoptosis y cáncer; y en especies procariotas, células denominadas "hipermutadoras". En los últimos años el estudio de la hipermutabilidad en bacterias ha cobrado gran interés ya que se le atribuye importancia en procesos infectivos y en aspectos básicos relacionados a evolución. Nuestro modelo de estudio son las bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, siendo esta última especie no solo modelo de estudio sino también especie de referencia. P. aeruginosa es una bacteria ambiental gram negativa, e importante patógeno oportunista de humanos. Específicamente nos proponemos estudiar en P. aeruginosa algunos aspectos particulares del Sistema de Reparación de Bases Apareadas Incorrectamente (Mismatch Repair System, MRS), del Sistema de Prevención/Reparación de Lesiones Oxidativas generadas a través de 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxo-dG ó GO) y el papel de las ADN Polimerasas de baja fidelidad en la modulación de la tasa de mutación. Asimismo estamos interesados en estudiar en cepas de E. coli deficientes en el sistema Dam, la existencia de subpoblaciones de alta estabilidad genética debido a la eliminación de posibles mutantes por incremento de la expresión de los otros componentes del MRS. Metodológicamente la caracterización bioquímica de factores proteicos se llevará a cabo utilizando proteínas recombinantes purificadas, análisis de interacción proteína-proteína y proteína-ADN mediante electroforesis en geles y resonancia plasmónica de superficie (Biacore), mutagenésis dirigida in vitro, y estudios de complementación en cepas mutantes específicas. Aspectos fenotípicos y de regulación génica en cultivos de biofilm y células en suspensión serán estudiados mediante la construcción de cepas mutantes, fusiones transcripcionales, PCR en tiempo real, western blot y microscopia de fluorescencia confocal.

Mapeo de QTL para Mal de Río Cuarto en maíz. QTL mapping for tolerance to Mal de Río Cuarto disease in maize.

El Mal de Río Cuarto (MRC) es una enfermedad del maíz (Zea mays L.), endémica de ciertas zonas de la Argentina y constituye la patología más importante de este cultivo por la severidad de los daños y por la creciente difusión del área geográfica afectada. El empleo de la resistencia genética bajo un manejo integrado de la enfermedad, constituye la estrategia más económica y ambientalmente sustentable para lograr el incremento y la estabilidad en la producción de los cultivos de maíz, reduciendo el uso nocivo de agroquímicos. La reacción a la enfermedad MRC se encuentra influida por una fuerte interacción genotipo-ambiente que dificulta el mejoramiento genético. En los ensayos multiambientales la inconsistencia de la respuesta y la inestabilidad de los genotipos ensayados hace dificultoso llevar a cabo una buena selección basada en los síntomas de la enfermedad. Para contribuir a aumentar la eficacia de los métodos de mejoramiento es posible implementar programas en los que se incluyan herramientas biotecnológicas como los marcadores moleculares, que permiten reducir el efecto ambiental y contribuyen a soslayar, al menos en parte, los inconvenientes planteados por los efectos de la interacción genotipo-ambiente facilitando la identificación de los genotipos buscados. La selección fenotípica realizada convencionalmente, puede ser complementada con la selección asistida por marcadores (marker-assisted selection MAS) consistente en utilizar la información genética que brindan marcadores moleculares de ADN, tales como los SSR, asociados a loci o segmentos cromosómicos (quantitative trait loci QTL) que confieran resistencia a MRC. Si bien los resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de trabajo señalan la presencia de posibles QTLs e informan que la reacción frente a la enfermedad tiene una moderada heredabilidad y una substancial variación debida a la interacción genotipo-ambiente, es necesario confirmar los resultados relativos a los parámetros poblacionales y obtener una mejor delimitación de las regiones genómicas identificadas. Con la finalidad de aumentar la eficiencia de los programas de mejoramiento en el desarrollo de genotipos tolerantes mediante la selección asistida por marcadores utilizando una población de mapeo F2 con un fondo genético diferente y líneas endocriadas recombinantes evaluadas en ensayos multiambientales, se proponen los siguientes objetivos (i) estudiar la forma de herencia de la reacción frente a MRC, (ii) identificar nuevos QTLs asociados a este carácter y (iii) verificar la consistencia de los QTLs identificados previamente.

Supresión oral de la Encefalomielitis autoinmune experimental por antígenos sinaptosomales. Oral suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by sinaptosomal antigens.

La inducción de las manifestaciones clínicas de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) involucra una reacción inmune celular contra determinantes antigénicos del sistema nervioso central (SNC), principalmente contra la proteína básica de mielina (PBM). Atento a la reactividad inmunológica cruzada previamente descrita entre la PBM y la proteína neuronal Sinapsina I, estudiaremos el efecto de la administración oral de moléculas híbridas (LTBSC, LTBSABC) entre la subunidad B de la toxina lábil al calor de Escherichia coli (LTB) con péptidos de Sinapsina (dominios C y ABC de la molécula) sobre el desarrollo de la EAE en ratas Wistar. Se administrarán oralmente los antígenos híbridos de LTB, LTB y péptidos de sinapsina no acoplados previa o posteriormente a la inducción activa de la EAE. Se estudiará la aparición de las manifestaciones clínicas de la enfermedad y se caracterizará la respuesta histopatológica e inmunológica (reacción de DTH, activación de linfocitos T, respuesta inmune humoral, vías de activación de macrófagos, patrón de citocinas) y los eventos celulares e inmunes desencadenados a nivel local luego de administrar los antígenos recombinantes en sistemas in vivo e in vitro. Estos estudios acerca de la respuesta autoinmune contra componentes de mielina y sinaptosomales en EAE tienen como objetivo poder comprender los diferentes mecanismos subyacentes involucrados en el desarrollo y regulación de esta enfermedad experimental. Específicamente este proyecto relacionado a la supresión de los síntomas clínicos como así también las alteraciones neuropatológicas del SNC de la EAE a través de un proceso de supresión oral de la enfermedad no invasivo utilizando tanto antígenos mielínicos como sinaptosomales fusionados a subunidades B (atóxicas) de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), es de suma importancia para un estudio posterior en las patologías humanas relacionadas y su uso en el diagnóstico, pronóstico y/o terapia de las mismas.

VACUNAS: estudio de un sistema portador (nanoestructura) del adyuvante CpG-ODN para la inducción de una respuesta inmune

Numerosas sustancias fueron ensayadas como adyuvantes de vacunas pero sólo un número reducido se utiliza en veterinaria y humanos (1) (2). El “aluminio” es el único aprobado por la FDA para humano (3). Es seguro pero débil cuando se utiliza como inmunógeno proteínas recombinantes (4) y no genera Th1 y CTL (5-7). Las vacunas de nueva generación trajeron aparejado el advenimiento de una nueva generación de adyuvantes, entre ellos los CpG-ODN. Este adyuvante induce respuesta humoral, Th1 y CTL (8). CpG-ODN se utiliza en humanos, en muchos casos con éxito (“trials” clínicos en fase I-III). Un beneficio adicional es su habilidad de desarrollar una respuesta inmune efectiva en grupos que responden poco a la vacunación (neonatos, ancianos e inmunosuprimidos) (9-12). Sin embargo, a pesar de que existe plena evidencia que CpG-ODN tienen potente actividad como adyuvante, se visualizan varios problemas (vida media corta, biodistribución y farmacocinética no favorable, alta unión a proteínas plasmáticas, baja internalización celular y efectos independientes de la secuencia CpG (13)) que hacen que su biodisponibilidad sea reducida, hecho que representa una limitación para su uso clínico. Debido a esto, se han estudiado diferentes estrategias para formular CpG-ODN (liposomas, nano/micropartículas de lípidos catiónicos o polímeros biodegradables y emulsiones) (14-19). Estos sistemas han mejorado la actividad inmunoestimulatoria de CpG-ODN, sin embargo adolecen de problemas como son la imposibilidad de síntesis en escala comercial y la toxicidad observada sobre todo con las matrices catiónicas (20). Nosotros proponemos utilizar sistemas nanoestructurados de cristales líquidos formados a partir de ésteres del ácido ascórbico (coageles) como vehículo de CpG-ODN con el fin de promover un aumento de su actividad biológica. Utilizaremos la nanoestructura del ester formado entre el ácido ascórbico y ácido palmítico (coagel ASC16). Nuestros estudios previos indican que el coagel ASC16 aumenta la actividad adyuvante de CpG-ODN ya que ratones inmunizados con OVA/CpG-ODN/coagel ASC16 desarrollaron mayores títulos de anticuerpos (IgG, IgG1 e IgG2a) e IFNg que aquellos animales tratados con OVA/CpG-ODN. El coagel ASC16 ofrece varias ventajas como biomaterial para la preparación de vehículo: a)sus componentes son biodegradables (vitamina C, ácido graso esencial), b)la vitamina C conserva sus propiedades antioxidantes y es clasificada por la FDA como un antioxidante natural y seguro, c)es bien tolerado fisiológicamente y d)es posible desde el punto de vista técnico producirlo en gran escala. Hipótesis: creemos que con esta estrategia de vehiculización lograríamos la/s siguientes ventajas: a)aumentar la vida media de CpG-ODN aumentando la resistencia a nucleasas y/o logrando que CpG-ODN permanezca mayor tiempo tanto en el sitio de inyección como en los tejidos donde se induce la respuesta inmune, b)aumentar la internalización celular de CpG-ODN y del antígeno por células presentadoras de antígeno, c)crear un efecto “depot” (liberación sostenida en el tiempo) en el sitio de inyección. Objetivos: 1)evaluar la capacidad adyuvante de CpG-ODN vehiculizado en el coagel ASC16 2)estudiar el mecanismo por el cual el coagel ASC16 mejora la actividad adyuvante de CpG-ODN. Estudiaremos la influencia del coagel sobre CpG-ODN en la farmacocinética, biodistribución, “up-take” y activación celular, protección de nucleasas y liberación sostenida en el tiempo (“depot”). Además se evaluará si el coagel tiene actividad inflamatoria “per se”. Si bien aquí contemplamos el estudio de CpG-ODN en animales, hay que tener en cuenta que CpG-ODN tiene una alta posibilidad de ser aprobado para uso humano en un tiempo cercano. Esperamos establecer que CpG-ODN está apropiadamente formulado en el coagel, punto de partida para el desarrollo de un nuevo sistema portador de adyuvantes. Asi, la información obtenida podría constituir una plataforma para nuevos desarrollos biotecnológicos.

Pneumonia por Influenza A(H1N1) em paciente imunossuprimido após transplante cardíaco

O papel da resposta imunológica durante a infecção pelo vírus Influenza H1N1 não está totalmente estabelecido, mas acredita-se que atue de forma decisiva no agravamento do quadro e no aparecimento da síndrome de desconforto respiratório agudo. O papel de terapias imunomoduladoras no controle de infecções virais também não é consensual e faltam dados de literatura para se definir as indicações de seu uso. Neste relato de caso, apresentamos, segundo nosso conhecimento, pela primeira vez, o relato de um paciente transplantado cardíaco que apresentou infecção pelo vírus H1N1 e evoluiu de forma favorável, trazendo um questionamento sobre o real papel da terapia imunossupressora como fator de risco para a forma grave da doença.

O diagnóstico da obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo na cardiomiopatia hipertrófica

A cardiomiopatia hipertrófica é uma doença genética prevalente caracterizada por hipertrofia ventricular esquerda, em que obstrução dinâmica da via de saída com geração de gradiente subaórtico incide em repouso em 30% dos casos. A obstrução é atribuida complexa interação entre o folheto anterior mitral, o septo interventricular e vetores anômalos de fluxo gerados no ventrículo esquerdo aliada a modificações na geometria da via de saída. Regurgitação mitral em grau variável é detectada associada ou não a deformidades estruturais do aparelho valvar. O ecocardiograma de esforço demonstra obstrução latente facilmente induzida por exercício em 60 a 75% das formas não obstrutivas. A determinação do gradiente nessas condições impõe-se na investigação de rotina dos pacientes com obstrução leve ou ausente em repouso. A avaliação da cardiomiopatia hipertrófica incorpora métodos de imagem baseados no ultrassom, os quais, adicionados ressonância magnética, possibilitam o reconhecimento de mecanismos geradores de obstrução ventricular, de modo a favorecer o diagnóstico e o manejo das formas obstrutivas e obstrutivas latentes.

Descrição de ovos e estádios ninfais de Triatoma carcavalloi (Hemiptera, Reduviidae) por meio de microscopia óptica

Triatoma carcavalloi Jurberg, Rocha & Lent 1998, foi descrita como espécie afim de T. rubrovaria (Blanchard, 1843) e T. circummaculata (Stäl, 1859) São descritos os ovos e ninfas de T. carcavalloi por meio de microscopia óptica para fornecer novos parâmetros a serem utilizados na taxonomia dos Triatomímeos. Os ovos apresentam semelhanças com T. rubrovaria, T. circummaculata e T. infestans Klug, 1834, com ornamentações tanto na superfície como no opérculo, com células pentagonais e hexagonais, com pequenas fraturas e pontuações distribuídas de forma aleatória. As ninfas se diferenciam de todas as espécies a ela relacionadas, principalmente pela coloração e tamanho. Cada um dos cinco estádios ninfais apresenta diferenças morfológicas, no entanto, o padrão de coloração da cabeça, tórax, pernas e abdômen se mantêm, em todos os estádios.

Estimativas de parâmetros populacionais e demográficos de Ozotoceros bezoarticus (Artiodactyla, Cervidae) em Piraí do Sul, Paraná, sul do Brasil

Este estudo foi realizado em duas propriedades particulares, situadas no município de Piraí do Sul, sul do Brasil. Foram realizadas 16 fases de campo mensais, com três dias de duração, no período compreendido entre fevereiro de 2001 e maio de 2002, com o objetivo de obter informações sobre a biologia do veado-campeiro (Ozotoceros bezoarticus Linnaeus, 1758) e identificar os principais fatores de impacto sobre o mesmo. Foram computadas 1.065 observações, estimando-se 71,45 indivíduos na população, sendo o tamanho médio dos grupos de 2,29 (DV ± 0,55), e a razão sexual de 0,83. Indivíduos isolados corresponderam a 40% das observações, sendo o maior grupo composto por 10 indivíduos. Registrou-se um pico de nascimentos entre setembro e novembro, embora esses tenham acontecido ao longo de todo o estudo. Foram registrados 34 óbitos, correspondendo a uma mortalidade de 47,6%, sendo as principais causas a predação por Puma concolor (Linnaeus, 1771), a caça e os atropelamentos. A população estudada encontra-se severamente ameaçada, e não sobreviverá por muito tempo a menos que políticas que garantam a sua conservação sejam adotadas. Estas políticas devem incluir o manejo adequado das áreas e o controle dos vetores de pressão.

Captura de mosquitos antropofílicos (Diptera, Culicidae) em uma área urbana da região oeste da Bahia, Brasil

A região oeste da Bahia passa por acelerado processo de desenvolvimento agrícola, o que tem gerado problemas de infraestrutura nos municípios. A falta de saneamento básico e de coleta dos resíduos são alguns desses problemas, os quais têm papel importante no aumento de criadouros disponíveis aos culicídeos. Assim, considerando as possibilidades de contato entre vetor e população humana, o objetivo deste trabalho foi estudar a fauna de culicíeos adultos em uma área urbana no oeste da Bahia e verificar a presença de espécies de interesse em saúde pública. As amostragens de mosquitos adultos foram realizadas no município de Barreiras, de fevereiro de 2009 a janeiro de 2010, das 17h30min às 21h00min. Ao total foram capturados 1.744 mosquitos e oito gêneros foram identificados: Aedes, Coquilletidia, Culex, Limatus, Mansonia, Ochlerotatus, Psorophora e Uranotaenia. Culex quinquefasciatus foi a espécie mais frequente e abundante. Outras espécies encontradas, e que apresentam importância epidemiológica, foram Aedes aegypti e Ochlerotatus scapularis. Considerando que muitas espécies coletadas em Barreiras possuem importância epidemiológica e ocorrem mesmo durante a estação seca devido à ausência de saneamento básico, é importante que os municípios da região oeste da Bahia sejam alvo constante das atividades de vigilância epidemiológica.

Inquérito sôbre a doença de Chagas no hospital da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte (Minas Gerais, Brasil)

São relatados os resultados de um inquérito sôbre doença de Chagas realizado na Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte (Minas Gerais, Brasil), com a finalidade de verificar a incidência desta moléstia e especialmente de sua forma cardíaca crônica entre os doentes ali internados. Foram examinados 181 pacientes adultos não selecionados, adotando-se os seguintes métodos: a) exame clínico geral e exame minucioso do aparelho circulatório; b) eletrocardiograma; c) reação de fixação do complemento para a doença de Chagas (antígeno de cultura do Schizotrypanum cruzi); d) reação de Wassermann; e) xenodiagnóstico e radiografia dos pacientes com reação de fixação do complemento (Guerreiro & Machado) positiva e de portadores de outras cardiopatias. Dos 181 pacientes examinados, 37 (20,44%) tinham provas de laboratório positivas para foença de Chagas. 49 (27,07%) eram portadores de cardiopatias, com as seguintes etiologias: doença de Chagas (18 casos); arteriosclerose (13 casos); hipertensão arterial (12 casos); sífilis (casos); febre reumática (3 casos); cardiopatia congênita (1 caso); cor pulmonale crônico (1 caso). De 34 pacientes com doença de Chagas, 18 (52,95%) apresentavam evidências eletrocardiográficas de comportamento miocárdico. As alterações eletrocardiográficas mais freqüentes foram: bloqueio do ramo direito, extra-sístoles ventriculares, alterações de QRS (isoladas ou associadas a alterações de T), bloqueios auriculo-ventriculares. Estes achados são semelhantes aos já descritos na cardiopatia chagásica crônica por Laranja e cols. (13,26). As alterações eletrocardiográficas mais frequentes no grupo de pacientes com provas de laboratório negativas para doença de Chagas foram: curvas de hipertrofia ventricular esquerda (strain) alteralçoes primárias de T e extra-sístoles vemtriculares. A idade de 50,0% dos pacientes com miocardite chagásica crônica não ultrapassou os 30 enquanto que 83,33% dos pacientes portafores de outras cardiopatias eram maiores de 30 anos. A reação de fixação do complemento (antígeno de cultura do Schizotrypanum cruzi), devido à sua especificidade e sensibilidade, mostrou ser muito util para o diagnóstico de laboratório da doença de Chagas em sua fase crônica. O xenodiagnóstico foi positivo em 8 casos (25,8%) de 31 pacientes com reação de Guerreiro & Machado positiva. Foi discutidoo problema da etiologia do megaesôfago e do megacolon, admitindo os Autores que adoença de Chagas possivelmente desempenhe, em determinadas zonas, papel significativo no desenvolvimento destas afecções. Foi brevemente relatada a distribuição geográfica dos triatomídeos no Estado de Minas Gerais. Os principais vetores são Panstrongylus megistus, Triatoma infestans e Triatoma sordida, se bem que outras 12 espécies ocorrem neste Estado. Estes triatomídeos existem em 204 (64,55%) dos 316 municípios do Estado de Minas. Vetores infetados foram encontrados em 143 municípios (70,09%). Foram assinaladas as áreas infetadas mais importantes. Os Autores salientaram a importância médica da doença de Chagas, acreditando ser esta infecção um dos mais importantes fatores de cardiopatia em amplas zonas rurais do Estado de Minas Gerais.

Broncopneumopatias a vírus: análise crítica de alterações histológicas encontradas no estudo de afecções respiratórias não bacterianas na infância

Os autores apresentam 69 casos de afecções respiratórias em crianças que atribuem a agentes não bacterianos, provavelmente virais. Usam para isto um critério clínico, outro morfológico, em uma revisão de 372 pneumopatias infecciosas em casos de autópsias. Caracterizaram morfologicamente a resposta à agressão viral pela presença de: infiltrado mononuclear intersticial, predominantemente peribronquilar; alterações degenerativas ou mesmo necrose e hiperplasia do epitélio respiratório; membrana hialina; descamação epitelial; células gigantes sinciciais alveolares e bronquiolares; inclusões nucleares e citoplasmáticas; edema proteináceo alveolar e septal, proliferação intersticial conjuntiva incipiente. Criticam o erro por excesso de diagnósticos de "pneumonia mononuclear intesticial" e o erro por falta quando o acometimento bacteriano dificulta o diagnóstico de lesão atribuível a vírus. Além disso realçam a importância de achado de bonquiolite aguda como fundamental para o diagnóstico. Estas lesões - ao lado de achados clínicos-radiológicos e epidemiológicos - cosntituem o que a experiência adquirida julga como reação do pulmão a vários vírus conhecidos (Adenovírus, Influenza, Parainfluenza, Vírus Sincicial Respiratório e Sarampo).

Efeitos morfogenicos de precoceno II em ninfas de Rhodnius prolixus (Stal, 1859) (Hemiptera - Triatominae)

Com o propósito de vir controlar os triatomíneos, vetores da doneça de Chgas, por substâncias não convencionais, analisamos a atuação e os efeitos de Precoceno II por tratamento tópico e oral em ninfas do 1º ao 4º estádio de Rhodnius prolixus. Com enfoque comparativo entre os dois tipos de aplicação, fizemos uma análise de deformações morfológicas externas, principalmente das estruturas genitais externas de ambos os sexos.

Estudo morfológico comparativo de ovos e ninfas de Triatoma maculata (Erichson, 1848) e Triatoma pseudomaculata Corrêa & Espínola, 1964 (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae)

Utilizando a microscopia ótica (MO) e eletrônica de varredura (MEV) procurou-se fornecer dados a taxionomia através da estrutura dos ovos e morfologia das ninfas, destes vetores da doença de Chagas. Os ovos em MO apresentam a superfície exocorial do opérculo e do corpo dividida em áreas poligonais com ornamentação própria; em T. maculata o exocório do corpo tem áreas indefinidas. Em MEV o exocório dos opérculos apresenta áreas poligonais de superfície estofada com pequena sulcos irregulares e perfurações distribuídas aleatoriamente nas duas espécies. O exocório do corpo apresenta: em T. maculata áreas acolchoadas com perfurações mais numerosas nos bordos, visualizando-se a borda corial, goteira espermática, aerópilas e micrópilas; em T. pseudomaculata as áreas são planas com numerosas perfurações. Nas ninfas o sulco estridulatório e o rostro apresentam diferenças significativas. O sulco estridulatórios em MO possibilitou diferenciar ninfas de 1º, 2º e 3º estádios, os 4º e 5º estádios apresentam-se semelhantes. Em MEV a diferenciação é acentuada. O rostro em MO apresenta pilosidade característica a partir do 3º estádio. T. maculata apresenta pêlos curtos e esparsos no 1º e 2º artículos e longos e numerosos no 3º, em T. pseudo-maculata semelhantes, porém mais curtos no 3º artículo.

Development of a bifunctional CD1d-anti-HER2 scFv fusion molecule to redirect the iNKT cell-mediated immune response to the tumor site

Abstract : Invariant natural killer T lymphocytes (iNKT) are a unique subpopulation of T lymphocytes recognizing glycolipid antigens in the context of the MHC class I-like molecule CD1d. Upon activation with the high affinity ligand α-galactosylceramide (αGalCer), iNKT cells rapidly produce large amounts of the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-γ) and potently activate cells of the innate and adaptive immune response, such as dendritic cells (DCs), NK and T cells. In this context, iNKT cells have been shown to efficiently mediate antitumor activity, and recent research has focused on the manipulation of these cells for antitumor therapies. However, a major drawback of αGalCer as a free drug is that a single injection of this ligand leads to a short-lived iNKT cell activation followed by a long-term anergy, limiting its therapeutic use. In contrast, we demonstrate here that when αGalCer is loaded on a recombinant soluble CD1d molecule (αGalCer/sCD1d), repeated injections lead to a sustained iNKT and NK cell activation associated with IFN-γ secretion as well as with DC maturation. Most importantly, when the αGalCer/sCD1d is fused to an anti-HER2 scFv antibody fragment, potent inhibition of experimental lung metastasis and established subcutaneous tumors is obtained when systemic treatment is started two to seven days after the injection of HER2-expressing B16 melanoma cells, whereas at this time free αGalCer has no effect. The antitumor activity of the sCD1d-anti-HER2 fusion protein is associated with HER2-specific tumor localization and accumulation of iNKT, NK and T cells at the tumor site. Importantly, active T cell immunization combined with the sCD1d-anti-HER2 treatment leads to the accumulation of antigen-specific CD8 T cells exclusively in HER2-expressing tumors, resulting in potent tumor inhibition. In conclusion, sustained activation and tumor targeting of iNKT cells by recombinant αGalCer/sCD1d molecules thus may promote a combined innate and adaptive immune response at the tumor site that may prove to be effective in cancer immunotherapy. RESUME : Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. En revanche, l'étude présentée ici démontre que, si l'αGalCer est chargé sur des molécules récombinantes soluble CD1d (αGalCer/sCDld), des injections répétées aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si on fusionne la molécule αGalCer/sCD1d avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. De plus, une immunisation active combinée avec le traitement sCD1d-anti-HER2 aboutit à une accumulation des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène d'immunisation, ceci exclusivement dans des tumeurs qui expriment l'antigène HER2. Cette combinaison résulte dans une activité anti-tumeur accrue. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules recombinantes αGalCer/sCDld conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC : Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Sur un total de 58 millions de décès enregistrés au niveau mondial en 2005, 7,6 millions (soit 13%) étaient dus au cancer. Les principaux traitements de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Néanmoins, ces traitements nuisent aussi aux cellules normales de notre corps et parfois, ils ne suffisent pas pour éliminer définitivement une tumeur. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches pour la lutte contre le cancer et elle vise à exploiter la spécificité du système immunitaire qui peut distinguer des cellules normales et tumorales. Une cellule exprimant un marqueur tumoral (antigène) peut être reconnue par le système immunitaire humoral (anticorps) et/ou cellulaire, induisant une réponse spécifique contre la tumeur. L'immunothérapie peut s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la prolifération des cellules tumorales exprimant l'antigène. Aujourd'hui, six anticorps monoclonaux non-conjugés sont approuvés en clinique. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements sont souvent combinés avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et exploiter par immunisation active le développement de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. De telles «vaccinations »sont actuellement testées en clinique, mais jusqu'à présent elles n'ont pas abouti aux résultats satisfaisants. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CHM I). Cependant les cellules tumorales sont peu efficace dans la présentation d'antigène, car souvent elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des molécules d'histocompatibilité de classe I, et expriment peu ou pas de molécules d'adhésion et de cytokines costimulatrices. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL spécifiquement dirigés contre des antigènes tumoraux, les régressions tumorales obtenus grâce à ces vaccinations sont relativement rares. Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines CMH I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. Notre groupe de recherche a donc eu l'idée de développer une nouvelle approche thérapeutique où la réponse immunitaire des cellules iNKT serait prolongée et redirigée vers la tumeur par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons produit des molécules récombinantes soluble CD1d (sCD1d) qui, si elles sont chargés avec l'αGalCer (αGalCer/sCDld), aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si la molécule αGalCer/sCD1d est fusionnée avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, la réponse immunitaire est redirigée à la tumeur pour autant que les cellules cancéreuses expriment l'antigène HER2. Les molécules αGalCer/sCDld ainsi présentées activent les lymphocytes iNKT. Avec cette stratégie, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées, même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules récombinantes αGalCer/sCD1d conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer.