Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.

Progrès vers la synthèse totale de l'hodgsonox

Ce mémoire présente une poursuite de l’étude vers la synthèse de l’hodgsonox, un sesquiterpénoïde naturel possédant des propriétés insecticides contre la mouche verte d’Australie, Lucilia cuprina. L’hodgsonox comporte six centres stéréogènes et trois cycles : un époxyde fusionné à un cycle à cinq chaînons et une fonction éther cyclique à six chaînons doublement allylique. La stratégie de synthèse de l’hodgsonox proposée comporte dix-neuf étapes linéaires. Elle s’appuie sur les travaux préliminaires de Lise Bréthous, étudiante au doctorat, de Nicolas Lévaray, étudiant à la maîtrise, ainsi que du Dr. Ying Dong Lu et de la Dr. Sonia Diab, qui ont tous travaillé précédemment dans le groupe de la Pr. Lebel. La première étape de cette synthèse consiste en une hydrogénation cinétique dynamique de Noyori permettant d’obtenir un seul diastéréoisomère à partir de l’α-acétylbutyrolactone. Une séquence de six étapes linéaires supplémentaires, comprenant l’ouverture de la lactone ainsi qu’une métathèse d’oléfine, permet d’obtenir le cycle à cinq chaînons avec un rendement global de 37%. L’unité isopropyle est par la suite installée par une addition conjuguée pour former un éther d’énol silylé, qui est directement oxydé en la cétone correspondante avec l’acétate de palladium(II). Une réaction d’hydrosilylation subséquente permet d’obtenir la stéréochimie syn attendue de l’unité isopropyle. Par la suite, la carbonylation d’un intermédiaire triflate permet d’obtenir le squelette de base pour la formation de l’éther cyclique. Enfin, le cycle à six chaînons est formé par insertion O−H intramoléculaire d’un diazo avec un rendement global de 2% sur 17 étapes. Les travaux spécifiques de l’auteure comprennent l’évaluation de conditions catalytiques pour l’oxydation de Saegusa de l’éther d’énol silylé. Les trois dernières étapes ont également été explorées par l’auteure. Il s’agit de l’époxydation de la double liaison endocyclique, de l’insertion dans un lien O−H catalysée par un dimère de rhodium, et de la méthylénation. Enfin, l’exploration d’une voie alternative a été entamée. Cette nouvelle voie consiste à former l’éther cyclique par une substitution nucléophile sur un époxyde. La double liaison exo-cyclique serait installée par une simple réaction de déshydratation.

Development of a Phase Separation Strategy in Macrocyclization Reactions

La réaction de macrocyclisation est une transformation fondamentale en chimie organique de synthèse. Le principal défi associcé à la formation de macrocycles est la compétition inhérente avec la réaction d’oligomérisation qui mène à la formation de sousproduits indésirables. De plus, l’utilisation de conditions de dilutions élevées qui sont nécessaires afin d’obtenir une cyclisation “sélective”, sont souvent décourageantes pour les applications à l’échelle industrielle. Malgré cet intérêt pour les macrocycles, la recherche visant à développer des stratégies environnementalement bénignes, qui permettent d’utiliser des concentrations normales pour leur synthèse, sont encore rares. Cette thèse décrit le développement d’une nouvelle approche générale visant à améliorer l’efficacité des réactions de macrocyclisation en utilisant le contrôle des effets de dilution. Une stratégie de “séparation de phase” qui permet de réaliser des réactions à des concentrations plus élevées a été developpée. Elle se base sur un mélange de solvant aggrégé contrôlé par les propriétés du poly(éthylène glycol) (PEG). Des études de tension de surface, spectroscopie UV et tagging chimique ont été réalisées afin d’élucider le mécanisme de “séparation de phase”. Il est proposé que celui-ci fonctionne par diffusion lente du substrat organique vers la phase ou le catalyseur est actif. La nature du polymère co-solvant joue donc un rôle crutial dans le contrôle de l’aggrégation et de la catalyse La stratégie de “séparation de phase” a initiallement été étudiée en utilisant le couplage oxidatif d’alcynes de type Glaser-Hay co-catalysé par un complexe de cuivre et de nickel puis a été transposée à la chimie en flux continu. Elle fut ensuite appliquée à la cycloaddition d’alcynes et d’azotures catalysée par un complexe de cuivre en “batch” ainsi qu’en flux continu.

Activation chimiosélective et dérivatisation d’amides et d'alcools : synthèse de plusieurs groupements fonctionnels et hétérocycles

Un objectif majeur en chimie organique est le développement de méthodes de synthèses générales, simples et peu coûteuses permettant la modification efficace des ressources naturelles en différents produits d’intérêt public. En particulier, la recherche de méthodes chimiosélectives et de méthodes dites « vertes » représente un intérêt croissant pour le secteur industriel (dont le domaine pharmaceutique). En fait, l’application en synthèse sur grande échelle de procédés catalytiques, sélectifs et utilisant des conditions douces permet de réduire le volume de déchets et la demande énergétique, minimisant ainsi les coûts de production et les effets néfastes sur l’environnement. Dans ce contexte, le groupe de recherche du Professeur André B. Charette de l’Université de Montréal s’intéresse au développement de méthodes générales et chimiosélectives permettant la transformation de fonctionnalités aisément accessibles tels que les amides et les alcools. La fonction amide, aussi appelée liaison peptidique dans les protéines, est présente dans diverses familles de molécules naturelles et est couramment employée comme intermédiaire synthétique dans la synthèse de produits d’intérêt pharmaceutique. Le groupement alcool est, quant à lui, l’une des fonctionnalités les plus abondantes dans la nature, intrinsèquement et largement utilisé en chimie de synthèse. Dans le cadre de cette thèse, des transformations simples, générales et chimiosélectives ont été réalisées sur des amides secondaires et tertiaires, ainsi que sur des alcools primaires et secondaires. La première partie de ce manuscrit se penche sur l’activation de la fonction amide par l’anhydride triflique (Tf2O), suivie de l’addition nucléophile de différents réactifs permettant ainsi la formation de plusieurs groupements fonctionnels versatiles, parfois indispensables, couramment employés en chimie organique tels que les aldimines, les aldéhydes, les amines, les cétones, les cétimines et des dérivés de la fonction amidrazone. Cette dernière fonctionnalité a également été utilisée dans des réactions successives vers la formation d’hétérocycles. De ce fait, des 1,2,4-triazoles ont été formés suite à une cyclodéshydratation initiée en conditions thermiques et faiblement acides. D’autre part, des 3-aminoindazoles ont été synthétisés par une fonctionnalisation C–H catalysée par un sel de palladium (II). La deuxième partie de la thèse est consacrée à la réaction de Mitsunobu en conditions acides, permettant ainsi la substitution nucléophile d’alcools en présence de carbamines (ou amines ne possédant pas de groupement électro-attracteurs). Ce type de nucléophile, basique lorsqu’utilisé comme base libre (avec un pKa se situant au-dessus de 13 dans le DMSO), n’est intrinsèquement pas compatible dans les conditions standards de la réaction de Mitsunobu. Contrairement aux conditions usuelles multi-étapes employant la réaction de Mitsunobu, la méthode développée au cours de cette étude permet la formation d’amines substituées en une seule étape et ne requiert pas l’emploi de groupements protecteurs.

Synthèse et étude de nouvelles molécules potentiellement polymérisables pour la fabrication de matériaux électroluminescents : analogues du 1,3,5 benzènetripyrrole, méthyle 3,5-bipyrrolebenzoate et 6,12-diméthyle-1,5-dipyrrolediazocane

Pyrroles are found in various natural products and in the chemical composition of certain drugs because of their interesting biological properties. Lipitor, Tolmetin and Amtolmetin are examples of drugs with 1,2,5-substituted pyrroles in their composition, in which biological activities have been certified. Moreover, pyrroles are used as precursors of semiconductor polymers, oligomers and dendrimers useful for the synthesis of electroluminescent materials used in devices, such as organic light-emitting diodes, field-effect transistors, solar and organic photovoltaic cells. We are interested in conjugated polymers based on pyrrole due to their optical properties, electrochemical and the conductivity produced by electron delocalization along their carbon chains. The overall objective of the work presented in this thesis is the synthesis of new molecules based on pyrrole for studying their electronic and electrochemical properties as well for the synthesis of conjugated polymers. Initially, we performed the synthesis of 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes, which may serve as precursors for the synthesis of conjugated dendrimers. Their synthesis was made in three steps starting from trimethyl 1,3,5-benzene-tricarboxylate which was converted to 1,3,5-tri-(pent-4-enoyl)benzene using vinylmagnesium bromide in a Grignard reaction catalyzed by copper cyanide. The olefins of 1,3,5-tri-(pent-4-enoyl)benzene were oxidized to produce 1,3,5-tri-(4-oxopentanoyl)benzene using a modified protocol of the Tsuji-Wacker reaction. Subsequent, Paal-Knorr condensation reactions on 1,3,5-tri-(4-oxopentanoyl)benzene with different amines were used to synthesize 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes with different N-substituents in yields between 44 and 60%. Incomplete reaction of vinylmagnesium bromide with trimethyl 1,3,5-benzenetricarboxylate gave the methyl-3,5-di(pent-4-enoyl)benzoate, which was converted to methyl-3,5-dipyrrolylbenzoate following the reaction of Tsuji- Wacker and Paal-Knorr with yields between 30 and 60%. The photochemical and electrochemical properties of the 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes and methyl-3,5-dipyrrolylbenzoates were studied in collaboration with the research group of professor William Skene. The results have shown that both types of pyrrole have potential for the synthesis of conjugated polymers and dendrimers used in the manufacture of electroluminescent materials. Following these encouraging results, we performed the synthesis of 6,12-dimethyl-1,5-dipyrrolediazocane. Methyl N-(Boc)-β-alaninate was converted to its corresponding homoallylic ketone, which was oxidized to N-(Boc)aminoheptan-3,6-dione. The Paal-Knorr condensation between N-(Boc)aminoheptan-3,6-dione and aminoheptan-3,6-dione hydrochloride gave 6,12-dimethyl-1,5-dipyrrolediazocane in 17% yield. In sum, we have synthesized and characterized seven new molecules, six of them having photochemical and electrochemical properties interesting for the synthesis of conjugated polymers and dendrimers. The latter offering potential as precursor for the conception of compounds of therapeutic interest.

Développement d’une méthode bio-informatique permettant de relier les gènes aux métabolites

L’objectif de ce projet était de faire le lien entre gènes et métabolites afin d’éventuellement proposer des métabolites à mesurer en lien avec la fonction de gènes. Plus particulièrement, nous nous sommes intéressés aux gènes codant pour des protéines ayant un impact sur le métabolisme, soit les enzymes qui catalysent les réactions faisant partie intégrante des voies métaboliques. Afin de quantifier ce lien, nous avons développé une méthode bio-informatique permettant de calculer la distance qui est définie comme le nombre de réactions entre l’enzyme encodée par le gène et le métabolite dans la carte globale du métabolisme de la base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Notre hypothèse était que les métabolites d’intérêt sont des substrats/produits se trouvant à proximité des réactions catalysées par l’enzyme encodée par le gène. Afin de tester cette hypothèse et de valider la méthode, nous avons utilisé les études d’association pangénomique combinées à la métabolomique (mGWAS) car elles rapportent des associations entre variants génétiques, annotés en gènes, et métabolites mesurés. Plus précisément, la méthode a été appliquée à l’étude mGWAS par Shin et al. Bien que la couverture des associations de Shin et al. était limitée (24/299), nous avons pu valider de façon significative la proximité entre gènes et métabolites associés (P<0,01). En somme, cette méthode et ses développements futurs permettront d’interpréter de façon quantitative les associations mGWAS, de prédire quels métabolites mesurer en lien avec la fonction d’un gène et, plus généralement, de permettre une meilleure compréhension du contrôle génétique sur le métabolisme.

Tailored Ion Imprinted Polymer Materials for the Preconcentrative Separation of Noble Metals

Tailored ion imprinted polymer materials for the preconcentrative separation of noble metals. This study deals with the synthesis, separation,characterization and analytical application of the noble metals especially palladium and platinum. Platinum group metals(PGM) are currently receiving world wide attention. This group include Palladium(Pt),rhodium(Rh), ruthenium(Ru), iridium(Ir) and osmium(Os).PGM are used as catalysts for a wide variety of hydrogenation, oxidation, isomerization,cyclization,dehydrogenation and dehalogenation reactions.The corrosion resistance of PGM enables them to use in jewellery,electrical and glass industries,extrusion of synthetic fibres,manufacture of laboratory utensils,dental and medical devices. This study clearly establishes selective recovery of platinum from other noble and transition elements.

Catalysis By Ferrites And Cobaltites For The Alkylation And Oxidation Of Organic Compounds

Catalysis is a very important process from an industrial point of view since the production of most industrially important chemicals involves catalysis.Solid acid catalysts are appealing since the nature of acid sites is known and their chemical behavior in acid catalyzed reactions can be rationalized by means of existing theories and models. Mixed oxides crystallizing in spinel structure are of special interest because the spinel lattice imparts extra stability to the catalyst under various reaction conditions so that theses systems have sustained activities for longer periods. The thesis entitled" Catalysis By Ferrites And Cobaltites For The Alkylation And Oxidation Of Organic Compounds " presents the preparation ,characterization ,and activity studies of the prepared spinels were modified by incorporating other ions and by changing the stoichiometry.The prepared spinels exhibiting better catalytic activity towards the studied reactions with good product selectivity.Acid-base properties and cation distribution of the spinels were found to control the catalytic activity.

Vanadia Supported on Rice Husk Silica Promoted Rare Earth Oxides

The selective oxidation of alkylaromatics is one of the main processes since the reaction products are important as intermediates in numerous industrial organic chemicals. Side-chain oxidation of alkyl aromatic compounds catalyzed by heterogeneous catalysts using cleaner peroxide oxidants is an especially attractive goal since classical synthetic laboratory procedures preferably use permanganate or acid dichromate as stoichiometric oxidants. In spite of many studies, there are very few which use hydrogen peroxide as a source of oxygen in the C-H activation of alkanes. Eflective utilization of ethylbenzene, available in the xylene stream of the petrochemical industry to more value added products is a promising one in chemical industry. The oxidation products of ethylbenzene are widely employed as intermediates in organic, steroid and resin synthesis.

β-glucosidases from Aspergillus unguis NII 08123: Molecular characterization, properties and applications

Lignocellulosic biomass is probably the best alternative resource for biofuel production and it is composed mainly of cellulose, hemicelluloses and lignin. Cellulose is the most abundant among the three and conversion of cellulose to glucose is catalyzed by the enzyme cellulase. Cellulases are groups of enzymes act synergistically upon cellulose to produce glucose and comprise of endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase. β -glucosidase assumes great importance due to the fact that it is the rate limiting enzyme. Endoglucanases (EG) produces nicks in the cellulose polymer exposing reducing and non reducing ends, cellobiohydrolases (CBH) acts upon the reducing or non reducing ends to liberate cellobiose units, and β - glucosidases (BGL) cleaves the cellobiose to liberate glucose completing the hydrolysis. . β -glucosidases undergo feedback inhibition by their own product- β glucose, and cellobiose which is their substrate. Few filamentous fungi produce glucose tolerant β - glucosidases which can overcome this inhibition by tolerating the product concentration to a particular threshold. The present study had targeted a filamentous fungus producing glucose tolerant β - glucosidase which was identified by morphological as well as molecular method. The fungus showed 99% similarity to Aspergillus unguis strain which comes under the Aspergillus nidulans group where most of the glucose tolerant β -glucosidase belongs. The culture was designated the strain number NII 08123 and was deposited in the NII culture collection at CSIR-NIIST. β -glucosidase multiplicity is a common occurrence in fungal world and in A.unguis this was demonstrated using zymogram analysis. A total 5 extracellular isoforms were detected in fungus and the expression levels of these five isoforms varied based on the carbon source available in the medium. Three of these 5 isoforms were expressed in higher levels as identified by the increased fluorescence (due to larger amounts of MUG breakdown by enzyme action) and was speculated to contribute significantly to the total _- β glucosidase activity. These isoforms were named as BGL 1, BGL3 and BGL 5. Among the three, BGL5 was demonstrated to be the glucose tolerant β -glucosidase and this was a low molecular weight protein. Major fraction was a high molecular weight protein but with lesser tolerance to glucose. BGL 3 was between the two in both activity and glucose tolerance.121 Glucose tolerant .β -glucosidase was purified and characterized and kinetic analysis showed that the glucose inhibition constant (Ki) of the protein is 800mM and Km and Vmax of the enzyme was found to be 4.854 mM and 2.946 mol min-1mg protein-1respectively. The optimumtemperature was 60°C and pH 6.0. The molecular weight of the purified protein was ~10kDa in both SDS as well as Native PAGE indicating that the glucose tolerant BGL is a monomeric protein.The major β -glucosidase, BGL1 had a pH and temperature optima of 5.0 and 60 °C respectively. The apparent molecular weight of the Native protein is 240kDa. The Vmax and Km was 78.8 mol min-1mg protein-1 and 0.326mM respectively. Degenerate primers were designed for glycosyl hydrolase families 1, 3 and 5 and the BGL genes were amplified from genomic DNA of Aspergillus unguis. The sequence analyses performed on the amplicons results confirmed the presence of all the three genes. Amplicon with a size of ~500bp was sequenced and which matched to a GH1 –BGL from Aspergillus oryzae. GH3 degenerate primers producing amplicons were sequenced and the sequences matched to β - glucosidase of GH3 family from Aspergillus nidulans and Aspergillus acculateus. GH5 degenerate primers also gave amplification and sequencing results indicated the presence of GH5 family BGL gene in the Aspergillus unguis genomic DNA.From the partial gene sequencing results, specific as well as degenerate primers were designed for TAIL PCR. Sequencing results of the 1.0 Kb amplicon matched Aspergillus nidulans β -glucosidase gene which belongs to the GH1 family. The sequence mainly covered the N-Terminal region of the matching peptide. All the three BGL proteins ie. BGL1, BGL3 and BGL5 were purified by chromatography an electro elution from Native PAGE gels and were subjected to MALDI-TOF mass spectrometric analysis. The results showed that BGL1 peptide mass matched to . β -glucosidase-I of Aspergillus flavus which is a 92kDa protein with 69% protein coverage. The glucose tolerant β -glucosidase BGL5 mass matched to the catalytic C-terminal domain of β -glucosidase-F from Emericella nidulans, but the protein coverage was very low compared to the size of the Emericella nidulans protein. While comparing the size of BGL5 from Aspergillus unguis, the protein sequence coverage is more than 80%. BGL F is a glycosyl hydrolase family 3 protein.The properties of BGL5 seem to be very unique, in that it is a GH3 β -glucosidase with a very low molecular weight of ~10kDa and at the same time having catalytic activity and glucose 122 tolerance which is as yet un-described in GH β -glucosidases. The occurrence of a fully functional 10kDA protein with glucose tolerant BGL activity has tremendous implications both from the points of understanding the structure function relationships as well as for applications of BGL enzymes. BGL-3 showed similarity to BGL1 of Aspergillus aculateus which was another GH3 β -glucosidase. It may be noted that though PCR could detect GH1, GH3 and GH5 β-glucosidases in the fungus, the major isoforms BGL1 BGL3 and BGL5 were all GH3 family enzymes. This would imply that β-glucosidases belonging to other families may also co-exist in the fungus and the other minor isoforms detected in zymograms may account for them. In biomass hydrolysis, GT-BGL containing BGL enzyme was supplemented to cellulase and the performances of blends were compared with a cocktail where commercial β- glucosidase was supplemented to the biomass hydrolyzing enzyme preparation. The cocktail supplemented with A unguis BGL preparation yielded 555mg/g sugar in 12h compared to the commercial enzyme preparation which gave only 333mg/g in the same period and the maximum sugar yield of 858 mg/g was attained in 36h by the cocktail containing A. unguis BGL. While the commercial enzyme achieved almost similar sugar yield in 24h, there was rapid drop in sugar concentration after that, indicating probably the conversion of glucose back to di-or oligosaccharides by the transglycosylation activity of the BGl in that preparation. Compared this, the A.unguis enzyme containing preparation supported peak yields for longer duration (upto 48h) which is important for biomass conversion to other products since the hydrolysate has to undergo certain unit operations before it goes into the next stage ie – fermentation in any bioprocesses for production of either fuels or chemicals.. Most importantly the Aspergillus unguis BGL preparation yields approximately 1.6 fold increase in the sugar release compared to the commercial BGL within 12h of time interval and 2.25 fold increase in the sugar release compared to the control ie. Cellulase without BGL supplementation. The current study therefore leads to the identification of a potent new isolate producing glucose tolerant β - glucosidase. The organism identified as Aspergillus unguis comes under the Aspergillus nidulans group where most of the GT-BGL producers belong and the detailed studies showed that the glucose tolerant β -glucosidase was a very low molecular weight protein which probably belongs to the glycosyl hydrolase family 3. Inhibition kinetic studies helped to understand the Ki and it is the second highest among the nidulans group of Aspergilli. This has promoted us for a detailed study regarding the mechanism of glucose tolerance. The proteomic 123 analyses clearly indicate the presence of GH3 catalytic domain in the protein. Since the size of the protein is very low and still its active and showed glucose tolerance it is speculated that this could be an entirely new protein or the modification of the existing β -glucosidase with only the catalytic domain present in it. Hydrolysis experiments also qualify this BGL, a suitable candidate for the enzyme cocktail development for biomass hydrolysis

Novel esterases from microbes through classical and metagenomics approach: Studies on the enzymes and their applications

Cochin University of Science And Technology

4,5-Dihydro-1,3-dioxepine als chirale Bausteine in der enantioselektiven organischen Synthese

Durch asymmetrische Doppelbindungsisomerisierung mittels Me-DuPHOS-modifizierter Dihalogen-Nickel-Komplexe als Katalysatorvorstufen lassen sich aus 2-Alkyl-4,7-dihydro-1,3-dioxepinen hochenantiomerenreine 2-Alkyl-4,5-dihydro-1,3-dioxepine erhalten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die bisher noch unbekannte Absolutkonfiguration dieses Verbindungstyps zu bestimmen und darüber hinaus ihre Einsatzfähigkeit in der enantioselektiven organischen Synthese zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden enantiomerenangereichertes 2-Isopropyl- und 2-tert-Butyl-4,5-dihydro-1,3-dioxepin mit m-Chlorperbenzoesäure epoxidiert. Dabei bildeten sich die entsprechenden 3-Chlorbenzoesäure-(2-alkyl-5-hydroxy-1,3-dioxepan-4yl)-ester in hohen Ausbeuten und Diastereoselektivitäten. Von den vier zu erwartenden Diastereomeren wurden jeweils nur zwei mit einer Selektivität von mehr als 95:5 gebildet. Im Fall des 3-Chlorbenzoesäure-(2-isopropyl-5-hydroxy-1,3-dioxepan-4yl)-esters konnte das Haupt-diastereomer kristallin erhalten werden. Durch röntgenspektroskopische Untersuchung war es möglich, die Relativ-Konfiguration dieser Verbindung zu bestimmen. Die Ester lassen sich unter Ringverengung in 2-Alkyl-1,3-dioxan-4-carbaldehyde umlagern. Ausgehend von diesen Carbaldehyden stehen zwei Synthesewege zur Verfügung, welche zu Verbindungen führen deren Absolutkonfiguration bereits bekannt ist. So erhält man durch Reduktion 2-Alkyl-1,3-dioxan-4-yl-methanole, welche sich in 1,2,4-Butantriol überführen lassen. Oxidation ergibt die 2-Alkyl-1,3-dioxan-4-carbonsäuren, aus denen 3-Hydroxytetrahydrofuran-2-on gewonnen werden kann. Messung des Drehwertes dieser beiden literaturbekannten Verbindungen liefert nicht nur Information über deren Enantiomerenreinheit sondern ebenfalls über die Konfiguration ihres Stereozentrums. In Kombination mit der Relativ-Konfiguration des Esters ist somit ein Rückschluss auf die Absolutkonfiguration der eingesetzten 4,5-Dihydro-1,3-dioxepine möglich. Die auf den beschriebenen Wegen gewonnenen Substanzen finden Anwendung in der stereoselektiven organischen Synthese. Löst man die Chlorbenzoesäureester in Dichlormethan und behandelt sie mit wässriger Salzsäure, so entstehen die bicyclischen 2-Alkyltetrahydrofuro[2,3-d][1,3]dioxole. Auch bei diesen Verbindungen konnten hohe Enantio- und Diastereoselektivitäten erzielt werden. Der intermolekular verlaufende Reaktionsmechanismus der Bicyclus-Bildung, welcher unter Abspaltung eines den Alkylrest tragenden Aldehyds und dessen Neuanlagerung unter Ausbildung eines Acetals verläuft, konnte in dieser Arbeit durch ein Kreuzungsexperiment bestätigt werden. Umacetalisierung der Bicyclen liefert 2-Methoxytetrahydrofuran-3-ol, aus dem durch Acetalspaltung Tetrahydrofuran-2,3-diol erhalten wird, das die Halbacetalform der entsprechenden Desoxytetrose darstellt, die auf diese Weise in einer de novo-Synthese hergestellt werden kann.

Zur Herstellung von chiralen α-Aminosäuren mit α-quartären Zentren und deren Verwendung als Synthone in der organischen Synthese

Ziel dieser Arbeit war, ausgehend von alpha-Aminoaldehyden eine kurze und effiziente Synthese zur Darstellung von Aminosäuren mit alpha-quartären Zentren in enantiomerenreiner Form und davon ableitbare wichtige Synthone in der organischen Synthese zu entwickeln. Der enantiomerenreine 2-tert-Butyl-4-methyl-1,3-oxazolidin-4-carbaldehyd ist via kupfer-katalysierter Aziridinierung des enantiomerenangereicherten 2-tert-Butyl-5-methyl-4H-1,3-dioxins mit der Nitrenquelle (N-Tosylimino)phenyliodinan zugänglich. Eine anschließende Oxidation mit Natriumhyperchlorid und Wasserstoffperoxid führt zur korrespondierenden Carbonsäure, die via sauer katalysierter Acetalspaltung und nachfolgender Abspaltung der Tosyl-Schutzgruppe in enantiomerenreines alpha-Methylserin in sehr guten Ausbeuten umgewandelt werden kann. Mit dem Einsatz von in C5-Position Ethyl-substituiertem 2-tert-Butyl-4H-1,3-dioxin ist analog das N-Tosyl geschützte alpha-Ethylserin darstellbar. Um die bestehende Lösungsmittelabhängigkeit in weniger polaren Losungsmitteln wie Dichlormethan oder Diethylether der Aziridinierung in Bezug auf ihre Diastereoselektivität und Reaktivität zu minimieren, wurden unterschiedliche Nitrenquellen untersucht. [N-(p-Methoxybenzolsulfonyl)imino]methoxyphenyliodinan stellte sich als die potenteste Nitrenquelle heraus und die Ausbeute konnte auf bis zu 70% gesteigert werden. Die Anwendbarkeit des N-Tosyl geschützten alpha-Methylserins konnte mit der Synthese des β-Lactons und 2-Carboxylethylether-2-aziridin unter Mitsunobu-Bedingungen gezeigt werden. Dabei ist die Reaktion durch einfache Variation des Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur zu beiden Produkten in sehr guten Ausbeuten hin steuerbar. Das β-Lacton konnte anschließend erfolgreich in das N-Tosyl- und S-Acetyl- geschützte alpha-Methylcystein überführt werden.

Capturing Emergent Semantics from Social Annotation Systems

The ongoing growth of the World Wide Web, catalyzed by the increasing possibility of ubiquitous access via a variety of devices, continues to strengthen its role as our prevalent information and commmunication medium. However, although tools like search engines facilitate retrieval, the task of finally making sense of Web content is still often left to human interpretation. The vision of supporting both humans and machines in such knowledge-based activities led to the development of different systems which allow to structure Web resources by metadata annotations. Interestingly, two major approaches which gained a considerable amount of attention are addressing the problem from nearly opposite directions: On the one hand, the idea of the Semantic Web suggests to formalize the knowledge within a particular domain by means of the "top-down" approach of defining ontologies. On the other hand, Social Annotation Systems as part of the so-called Web 2.0 movement implement a "bottom-up" style of categorization using arbitrary keywords. Experience as well as research in the characteristics of both systems has shown that their strengths and weaknesses seem to be inverse: While Social Annotation suffers from problems like, e. g., ambiguity or lack or precision, ontologies were especially designed to eliminate those. On the contrary, the latter suffer from a knowledge acquisition bottleneck, which is successfully overcome by the large user populations of Social Annotation Systems. Instead of being regarded as competing paradigms, the obvious potential synergies from a combination of both motivated approaches to "bridge the gap" between them. These were fostered by the evidence of emergent semantics, i. e., the self-organized evolution of implicit conceptual structures, within Social Annotation data. While several techniques to exploit the emergent patterns were proposed, a systematic analysis - especially regarding paradigms from the field of ontology learning - is still largely missing. This also includes a deeper understanding of the circumstances which affect the evolution processes. This work aims to address this gap by providing an in-depth study of methods and influencing factors to capture emergent semantics from Social Annotation Systems. We focus hereby on the acquisition of lexical semantics from the underlying networks of keywords, users and resources. Structured along different ontology learning tasks, we use a methodology of semantic grounding to characterize and evaluate the semantic relations captured by different methods. In all cases, our studies are based on datasets from several Social Annotation Systems. Specifically, we first analyze semantic relatedness among keywords, and identify measures which detect different notions of relatedness. These constitute the input of concept learning algorithms, which focus then on the discovery of synonymous and ambiguous keywords. Hereby, we assess the usefulness of various clustering techniques. As a prerequisite to induce hierarchical relationships, our next step is to study measures which quantify the level of generality of a particular keyword. We find that comparatively simple measures can approximate the generality information encoded in reference taxonomies. These insights are used to inform the final task, namely the creation of concept hierarchies. For this purpose, generality-based algorithms exhibit advantages compared to clustering approaches. In order to complement the identification of suitable methods to capture semantic structures, we analyze as a next step several factors which influence their emergence. Empirical evidence is provided that the amount of available data plays a crucial role for determining keyword meanings. From a different perspective, we examine pragmatic aspects by considering different annotation patterns among users. Based on a broad distinction between "categorizers" and "describers", we find that the latter produce more accurate results. This suggests a causal link between pragmatic and semantic aspects of keyword annotation. As a special kind of usage pattern, we then have a look at system abuse and spam. While observing a mixed picture, we suggest that an individual decision should be taken instead of disregarding spammers as a matter of principle. Finally, we discuss a set of applications which operationalize the results of our studies for enhancing both Social Annotation and semantic systems. These comprise on the one hand tools which foster the emergence of semantics, and on the one hand applications which exploit the socially induced relations to improve, e. g., searching, browsing, or user profiling facilities. In summary, the contributions of this work highlight viable methods and crucial aspects for designing enhanced knowledge-based services of a Social Semantic Web.

Unsymmetrisch substituierte N-heterocyclische Carbene mit einem 1,1 ʹ-Ferrocendiyl-Rückgrat und N-heterocyclische Carbene als Adsorbatspezies für selbstorganisierende Monolagen

Aufbauend auf den Arbeiten von Bielawski et al. und Siemeling et al. wurden im Rahmen dieser Arbeit unsymmetrisch substituierte N-heterocyclische Carbene mit einem 1,1ʹ-Ferrocendiyl-Rückgrat synthetisiert. Ausgehend von der literaturbekannten Verbindung 1,1’-Diaminoferrocen gelang die Einführung der exocyclischen Substituenten an den Stickstoffatomen lediglich durch die Anpassung der Stöchiometrie in den einzelnen Syntheseschritten. Es wurden die folgenden drei NHCs synthetisiert: N-(2-Adamantyl)-N’-neopentyldiaminocarben[3]ferrocenophan (Ad/Np), N-Neopentyl-N’-phenyldiaminocarben[3]ferrocenophan (Ph/Np) und N-(9-Anthracenylmethyl)-N’-neopentyldiaminocarben[3]ferrocenophan (Acm/Np). Das Carben Ad/Np konnte dabei erfolgreich isoliert werden, während die anderen zwei Carbene als Liganden in Komplexen des Typs [RhCl(COD)(NHC)] stabilisiert wurden. Von allen drei Carbenen wurden Rhodium-Carben-Komplexe des Typs [RhCl(COD)(NHC)] und cis-[RhCl(CO)2(NHC)] synthetisiert. Anhand der röntgenkristallographischen und NMR-spektroskopischen Untersuchungen dieser Rhodiumkomplexe konnten in allen sechs Komplexen anagostische Wechselwirkungen zwischen dem zentralen Rhodiumatom und den Wasserstoffatomen der exocyclischen Substituenten, die sich in α-Position zu den Stickstoffatomen befinden, nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden anhand der cis-[RhCl(CO)2(NHC)]-Komplexe die TEP-Werte der Carbene bestimmt. Gemessen in DCM betragen diese 2049 cm-1 (Ad/Np), 2049 cm-1 (Ph/Np) und 2051 cm-1 (Acm/Np). Unabhängig von den unsymmetrisch substituierten NHCs mit einem 1,1ʹ-Ferrocendiyl-Rückgrat wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung von NHCs als Adsorbatspezies für selbstorganisierende Monolagen überprüft. Hierzu wurden Tetraalkylimidazol-2-ylidene synthetisiert, welche als 0.01 mM Lösung auf Gold(111)-Substrate aufgebracht wurden. Die Goldsubstrate wurden anschließend mittels XPS untersucht. Die XPS-Analyse der modifizierten Goldsubstrate zeigte, dass eine Bindung der Carbene auf der Oberfläche stattgefunden hat. Es zeigte sich allerdings auch, dass keine SAM gebildet wurden, da die Oberfläche signifikant mit kohlen- und sauerstoffbasierten Verbindungen kontaminiert ist. Dabei kann vermutet werden, dass die Carbene nicht ausschließlich auf der Goldoberfläche selbst, sondern auch mit den auf der Oberfläche befindlichen Verbindungen reagiert haben.