Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen Differenzierungsmarker islet exprimieren.

Klonale Analysen im embryonalen Gehirn von Drosophila mit besonderem Fokus auf die Entwicklung der Pilzkörper

Eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis der Spezifizierungsmechanismen unterschiedlicher Zelltypen im embryonalen Gehirn ist die detaillierte Kenntnis des neuroektodermalen Ursprungs seiner neuralen Stammzellen (Neuroblasten, NB), sowie der Morphologie und zellulären Komposition der daraus hervorgehenden Zellstammbäume (ZSBe). In der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung und Topologie von 21 embryonalen ZSBen im anteriorsten Gehirnteil, dem Protocerebrum, charakterisiert, mit besonderem Fokus auf solche ZSBe, die den Pilzkörper konstituieren. Pilzkörper sind prominente, paarige Neuropilzentren, die eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung olfaktorischer Informationen, beim Lernen und bei der Gedächtnisbildung spielen. In dieser Arbeit konnte erstmalig die Embryonalentwicklung der Pilzkörper ab dem Zeitpunkt der Entstehung ihrer NBen im procephalen Neuroektoderm (pNE), bis hin zum funktionellen Gehirnzentrum in der frühen Larve auf Ebene individueller ZSBe bzw. einzelner Neurone beschrieben werden. Mittels der klonalen Di-Markierungstechnik konnte ich zeigen, dass die vier NBen der Pilzkörper (PKNBen) jeder Gehirnhemisphäre innerhalb des NE aus dem ventralen Bereich der mitotischen Domäne B (δB) hervorgehen. Ein in diesem Bereich liegendes proneurales Feld beherbergt etwa 10-12 Zellen, die alle das Potential haben sich zu PKNBen zu entwickeln. Des Weiteren zeigen diese Untersuchungen, dass die PKNBen (und weitere NBen der δB) aus benachbarten NE-Zellen hervorgehen. Dieser Befund impliziert, dass der Mechanismus der lateralen Inhibition in diesem Bereich des NE keine Rolle spielt. Weiterhin stellte sich heraus, dass jeder PKNB eine ihm eigene Position im sich entwickelnden Pilzkörperkortex besetzt und eine spezifische Kombination der Transkriptionsfaktoren Dachshund, Eyeless und Retinal homeobox exprimiert. Dadurch konnte jeder der vier PKNBen in den betreffenden frühembryonalen NB-Karten einem der ca. 105 NBen pro Gehirnhemisphäre zugeordnet werden. Die PKNBen bringen individuelle ZSBe hervor, die Pilzkörper-intrinsische γ-Neurone beinhalten, aber auch jeweils charakteristische Sets an Interneuronen, die nicht am Aufbau des Pilzkörpers beteiligt sind. Diese verschiedenen Neuronentypen entstehen in einer zeitlichen Abfolge, die für jeden PKNBen spezifisch ist. Ihre embryonalen ZSBe sind aber nicht nur durch individuelle Sets an frühgeborenen ni-Neuronen charakterisiert, sondern auch durch spezifische Unterschiede in der Anzahl ihrer γ-Neurone, welche jedoch, wie ich zeigen konnte, nicht durch Apoptose reguliert wird. Weiterhin konnte ich zeigen, dass γ-Neurone, in einer PKNB Klon-abhängigen Weise, spezifische Unterschiede in der räumlich-zeitlichen Innervation des Pedunkels, der Calyx und der Loben aufweisen. Im Weiteren wurde die Expression verschiedener molekularer Marker in diesen ZSBen charakterisiert, u.a. die Expression verschiedener Gal4-Fliegenstämme, und solcher Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der temporären Spezifizierung im VNS spielen. So werden hb, Kr, pdm1 auch in Nachkommenzellen der PKNBen exprimiert und haben möglicherweise eine Funktion bei ihrer temporären Spezifizierung. Diese Arbeit gibt auch erstmalig Einblick in die vollständige spätembryonale/frühlarvale Morphologie anderer protocerebraler Gehirnzellstammbäume aus δB und δ1. Die Beschreibungen dieser ZSBe beinhalten Angaben zu deren Zellzahl, Zelltypen, der Lage der ZSBe im Gehirn, axonalen/dendritischen Projektionsmustern sowie dem Entstehungsort des NBen.

Realizzazione di un'applicazione di Projection Mapping con OpenFrameworks

Il Projection Mapping è una tecnologia che permette di proiettare delle immagini sulla superficie di uno o più oggetti, anche di forma irregolare, trasformandoli in display interattivi. Il suo utilizzo, abbinato a suoni e musiche, permette di creare una narrazione audio-visuale. La suggestione e l’emozione scaturite dalla visione di una performance di Projection Mapping su di un monumento pubblico, hanno stimolato la mia curiosità e mi hanno spinto a cercare di capire se era possibile realizzare autonomamente qualcosa di analogo. Obiettivo di questa tesi è perciò spiegare cos’è il Projection Mapping e fornire una serie di indicazioni utili per realizzarne un’applicazione interattiva con OpenFrameworks (un framework open-source in C++) e hardware a basso costo (un computer, un videoproiettore e un sensore Kinect).

Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons

Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.

Image quality and dose evaluation of filtered back projection versus iterative reconstruction algorithm in multislice computed tomography.

Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso il servizio di Fisica Sanitaria del Policlinico Sant'Orsola-Malpighi di Bologna. Lo studio si è concentrato sul confronto tra le tecniche di ricostruzione standard (Filtered Back Projection, FBP) e quelle iterative in Tomografia Computerizzata. Il lavoro è stato diviso in due parti: nella prima è stata analizzata la qualità delle immagini acquisite con una CT multislice (iCT 128, sistema Philips) utilizzando sia l'algoritmo FBP sia quello iterativo (nel nostro caso iDose4). Per valutare la qualità delle immagini sono stati analizzati i seguenti parametri: il Noise Power Spectrum (NPS), la Modulation Transfer Function (MTF) e il rapporto contrasto-rumore (CNR). Le prime due grandezze sono state studiate effettuando misure su un fantoccio fornito dalla ditta costruttrice, che simulava la parte body e la parte head, con due cilindri di 32 e 20 cm rispettivamente. Le misure confermano la riduzione del rumore ma in maniera differente per i diversi filtri di convoluzione utilizzati. Lo studio dell'MTF invece ha rivelato che l'utilizzo delle tecniche standard e iterative non cambia la risoluzione spaziale; infatti gli andamenti ottenuti sono perfettamente identici (a parte le differenze intrinseche nei filtri di convoluzione), a differenza di quanto dichiarato dalla ditta. Per l'analisi del CNR sono stati utilizzati due fantocci; il primo, chiamato Catphan 600 è il fantoccio utilizzato per caratterizzare i sistemi CT. Il secondo, chiamato Cirs 061 ha al suo interno degli inserti che simulano la presenza di lesioni con densità tipiche del distretto addominale. Lo studio effettuato ha evidenziato che, per entrambi i fantocci, il rapporto contrasto-rumore aumenta se si utilizza la tecnica di ricostruzione iterativa. La seconda parte del lavoro di tesi è stata quella di effettuare una valutazione della riduzione della dose prendendo in considerazione diversi protocolli utilizzati nella pratica clinica, si sono analizzati un alto numero di esami e si sono calcolati i valori medi di CTDI e DLP su un campione di esame con FBP e con iDose4. I risultati mostrano che i valori ricavati con l'utilizzo dell'algoritmo iterativo sono al di sotto dei valori DLR nazionali di riferimento e di quelli che non usano i sistemi iterativi.

Implementazione dell'algoritmo filtered back-projection (FBP) per architetture low-power di tipo systems-on-chip

Il presente lavoro di tesi, svolto presso i laboratori dell'X-ray Imaging Group del Dipartimento di Fisica e Astronomia dell'Università di Bologna e all'interno del progetto della V Commissione Scientifica Nazionale dell'INFN, COSA (Computing on SoC Architectures), ha come obiettivo il porting e l’analisi di un codice di ricostruzione tomografica su architetture GPU installate su System-On-Chip low-power, al fine di sviluppare un metodo portatile, economico e relativamente veloce. Dall'analisi computazionale sono state sviluppate tre diverse versioni del porting in CUDA C: nella prima ci si è limitati a trasporre la parte più onerosa del calcolo sulla scheda grafica, nella seconda si sfrutta la velocità del calcolo matriciale propria del coprocessore (facendo coincidere ogni pixel con una singola unità di calcolo parallelo), mentre la terza è un miglioramento della precedente versione ottimizzata ulteriormente. La terza versione è quella definitiva scelta perché è la più performante sia dal punto di vista del tempo di ricostruzione della singola slice sia a livello di risparmio energetico. Il porting sviluppato è stato confrontato con altre due parallelizzazioni in OpenMP ed MPI. Si è studiato quindi, sia su cluster HPC, sia su cluster SoC low-power (utilizzando in particolare la scheda quad-core Tegra K1), l’efficienza di ogni paradigma in funzione della velocità di calcolo e dell’energia impiegata. La soluzione da noi proposta prevede la combinazione del porting in OpenMP e di quello in CUDA C. Tre core CPU vengono riservati per l'esecuzione del codice in OpenMP, il quarto per gestire la GPU usando il porting in CUDA C. Questa doppia parallelizzazione ha la massima efficienza in funzione della potenza e dell’energia, mentre il cluster HPC ha la massima efficienza in velocità di calcolo. Il metodo proposto quindi permetterebbe di sfruttare quasi completamente le potenzialità della CPU e GPU con un costo molto contenuto. Una possibile ottimizzazione futura potrebbe prevedere la ricostruzione di due slice contemporaneamente sulla GPU, raddoppiando circa la velocità totale e sfruttando al meglio l’hardware. Questo studio ha dato risultati molto soddisfacenti, infatti, è possibile con solo tre schede TK1 eguagliare e forse a superare, in seguito, la potenza di calcolo di un server tradizionale con il vantaggio aggiunto di avere un sistema portatile, a basso consumo e costo. Questa ricerca si va a porre nell’ambito del computing come uno tra i primi studi effettivi su architetture SoC low-power e sul loro impiego in ambito scientifico, con risultati molto promettenti.

Turning placenta into brain: placental mesenchymal stem cells differentiate into neurons and oligodendrocytes

We aimed to induce neural stem (NSC) and progenitor cells (NPC) from human placental tissues.

Angiotensinergic and noradrenergic neurons in the rat and human heart

Although the physiological and pharmacological evidences suggest a role for angiotensin II (Ang II) with the mammalian heart, the source and precise location of Ang II are unknown. To visualize and quantitate Ang II in atria, ventricular walls and interventricular septum of the rat and human heart and to explore the feasibility of local Ang II production and function, we investigated by different methods the expression of proteins involved in the generation and function of Ang II. We found mRNA of angiotensinogen (Ang-N), of angiotensin converting enzyme, of the angiotensin type receptors AT(1A) and AT(2) (AT(1B) not detected) as well as of cathepsin D in any part of the hearts. No renin mRNA was traceable. Ang-N mRNA was visualized by in situ hybridization in atrial ganglial neurons. Ang II and dopamine- -hydroxylase (D H) were either colocalized inside the same neuronal cell or the neurons were specialized for Ang II or D H. Within these neurons, the vesicular acetylcholine transporter (VAChT) was neither colocalized with Ang II nor D H, but VAChT-staining was found with synapses en passant encircle these neuronal cells. The fibers containing Ang II exhibited with blood vessels and with cardiomyocytes supposedly angiotensinergic synapses en passant. In rat heart, right atrial median Ang II concentration appeared higher than septal and ventricular Ang II. The distinct colocalization of neuronal Ang II with D H in the heart may indicate that Ang II participates together with norepinephrine in the regulation of cardiac functions: Produced as a cardiac neurotransmitter Ang II may have inotropic, chronotropic or dromotropic effects in atria and ventricles and contributes to blood pressure regulation.

A Portable Image Overlay Projection Device for Computer-Aided Open Liver Surgery

Image overlay projection is a form of augmented reality that allows surgeons to view underlying anatomical structures directly on the patient surface. It improves intuitiveness of computer-aided surgery by removing the need for sight diversion between the patient and a display screen and has been reported to assist in 3-D understanding of anatomical structures and the identification of target and critical structures. Challenges in the development of image overlay technologies for surgery remain in the projection setup. Calibration, patient registration, view direction, and projection obstruction remain unsolved limitations to image overlay techniques. In this paper, we propose a novel, portable, and handheld-navigated image overlay device based on miniature laser projection technology that allows images of 3-D patient-specific models to be projected directly onto the organ surface intraoperatively without the need for intrusive hardware around the surgical site. The device can be integrated into a navigation system, thereby exploiting existing patient registration and model generation solutions. The position of the device is tracked by the navigation system’s position sensor and used to project geometrically correct images from any position within the workspace of the navigation system. The projector was calibrated using modified camera calibration techniques and images for projection are rendered using a virtual camera defined by the projectors extrinsic parameters. Verification of the device’s projection accuracy concluded a mean projection error of 1.3 mm. Visibility testing of the projection performed on pig liver tissue found the device suitable for the display of anatomical structures on the organ surface. The feasibility of use within the surgical workflow was assessed during open liver surgery. We show that the device could be quickly and unobtrusively deployed within the sterile environment.