The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Die Leber als Latenzort des murinen Cytomegalovirus: Identifizierung und Charakterisierung des latent infizierten Zelltyps

Die Untersuchungen der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion im BALB/c Mausmodell konzentrierten sich bislang auf die Lunge, da diese einen Hauptort der mCMV Latenz darstellt. Da latentes CMV auch häufig durch Lebertransplantationen übertragen wird, wurde in dieser Arbeit die Leber als ein weiteres medizinisch relevantes Organ der CMV Latenz und Reaktivierung untersucht. Um zunächst die zellulären Orte der mCMV Latenz in der Leber zu ermitteln, wurden verschiedengeschlechtliche Knochenmarktransplantationen (KMT) mit männlichen tdy-positiven Spendern und weiblichen, tdy-negativen Empfängern, mit anschließender mCMV Infektion durchgeführt, um latent infizierte Mäuse mit geschlechtschromosomalem Chimärismus zu generieren. Diese Chimären erlaubten eine Unterscheidung zwischen tdy-positiven Zellen hämatopoetischen Ursprungs und tdy-negativen stromalen und parenchymalen Gewebszellen. Die Separation von Leberzellen der Chimären mittels zentrifugaler Elutriation und anschließender DNA Quantifizierung viraler und zellulärer Genome durch eine quantitative real-time PCR ergab einen ersten Hinweis, dass Endothelzellen ein zellulärer Ort der mCMV Latenz sind. Die darauf folgende immunomagnetische Zelltrennung lokalisierte latente virale DNA in der CD31-positiven Zellfraktion. Die Koexpression von CD31 mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenmarker ME-9F1 identifizierte die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als die Zellen, die latente virale DNA beherbergen. In den zytofluorometrisch aufgereinigten CD31+/ME-9F1+ LSEC waren bei gleichzeitigem Rückgang der männlichen tdy Markergene virale Genome angereichert, was darauf hinwies, dass Zellen, die virale DNA enthalten, vom Knochenmark-Empfänger stammen. Durch zytofluorometrische Analysen isolierter LSEC konnte eine vom Spender abstammende Subpopulation MHCII+/CD11b+ LSEC identifiziert werden. Anschließende Quantifizierungen viraler DNA aus latent infizierten Mäusen detektierten eine Abnahme viraler Genome mit zunehmender Menge an tdy-positiven Zellen, was beweist, dass MHCII+/CD11b+ LSEC keinen Ort der mCMV Latenz darstellen. Die limiting dilution Untersuchungen der isolierten latent infizierten LSEC ergaben eine Frequenz von einer latent infizierten Zelle unter ~1,9x104 LSEC und eine Anzahl von 7 bis 19 viralen Genomen pro latent infizierter Zelle. Nach 24 Stunden Kultivierung der LSEC konnte mittels quantitativer real-time RT-PCR mit Gesamt-RNA aus LSEC ein Anstieg der Genexpression der immediate early Gene ie1 und ie3 sowie eine Induktion des early Gens e1 gezeigt werden. Eine Erhöhung der transkriptionellen Reaktivierung durch die Inkubation der LSEC mit unterschiedlichen HDAC Inhibitoren konnte allerdings nicht erzielt werden, da sowohl die Menge der isolierten RNA aus behandelten Kulturen, als auch die Anzahl viraler Transkripte im Vergleich zu den unbehandelten Kulturen erniedrigt war. Aufgrund der kurzen Lebensdauer isolierter LSEC in vitro konnte durch Kokultivierungen latent infizierter LSEC zusammen mit murinen embryonalen Fibroblasten keine Virusreaktivierung induziert werden. Im Gegensatz dazu wurden durch den Transfer gereinigter ME-9F1+/CD31+ LSEC aus latent infizierten Spendern in immunsupprimierte Empfänger virale Rekurrenzen in Lungenexplantatkulturen des Rezipienten detektiert. Damit konnten LSEC eindeutig als zellulärer Ort von mCMV Latenz und Reaktivierung in der Leber identifiziert werden.

Entwicklung und Anwendung eines Beatmungssystems zur Untersuchung der Lungenfeinstruktur mittels He-3-Magnetresonanztomographie

Im Rahmen meiner Dissertation wurde ein 3He-Applikationssystem für die in-vivo 3He-Magnetresonanztomographie der Lunge von Ratten entwickelt. Im Gegensatz zu anderen bisher entwickelten MR-kompatiblen Beatmungsgeräten wurde in diesem Applikationssystem erstmals der polarisationserhaltende ³He-Langzeitspeicher im Streufeld des Tomographen integriert. Bei der 3He-Applikation wird das 3He-Gas automatisch aus dem Langzeitspeicher außerhalb des Magneten zum Tier in den Tomographen geleitet. Die Kernspin-Polarisationsverluste, die beim 3He-Transfer zum Tier in den Tomographen auftreten, betragen etwa 1% (rel.) und sind vernachlässigbar gering. Das Beatmungssystem wurde zusammen mit der MRT-Bildgebungssequenz COMSPIRA an mehr als 200 Tieren erfolgreich getestet. Die MRT-Aufnahmen fanden hauptsächlich an einem 0,47 T Niederfeldtomographen bei der Firma Boehringer-Ingelheim Pharma in Biberach statt. Es wurden sowohl morphologische Aufnahmen der Rattenlunge gemacht als auch der „Apparent Diffusion Coefficient“ (ADC) gemessen. Die relative Streuung der ADC-Werte innerhalb einer Gruppe von Tieren ähnlichen Alters und Gewichts betrug dabei 5%. Bei Wiederholungsmessungen an ein und demselben Tier verringerte sich die relative Streuung auf 1%. Diese Werte unterstreichen die hohe Reproduzierbarkeit des Beatmungssystems sowie des gesamten Messverfahrens. Weiterhin wurde ein Verfahren vorgestellt, das den experimentell bestimmten ADC unabhängig von dem Mischungsverhältnis zwischen dem applizierten 3He und der Atemluft in der Lunge macht. Dies kann erreicht werden, indem das hp 3He mit dem chemisch inerten und ungiftigen Gas SF6 in einem definierten Verhältnis gemischt wird und anschließend dem Tier appliziert wird. Zuletzt wurde der ADC von emphysematischen Rattenlungen und von gesunden Rattenlungen gemessen. Die Ergebnisse zeigten einen signifikant kleineren ADC innerhalb der Gruppe der erkrankten Tiere. Diese Dissertation wurde durch die Boehringer-Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG unterstützt.

Suppression des allergischen Asthmas durch regulatorische T-Zellen: Mechanismen und potenzielle therapeutische Ansätze

Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Prävalenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikamentöser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch für diese Erkrankung sind entzündliche Veränderungen in der Lunge, erhöhte Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen Fällen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anfälliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unschädlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im Körper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Großteil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erhöhter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaphänotypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erhöhte Mengen IFN-γ in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollständig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte natürlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- Mäuse konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erhöhte AHR induzieren. Während der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveolären Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschränkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentzündung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekundäre Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle übertragen und führt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die Störung des intrazellulären cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verstärkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entzündung, korrelierend mit erhöhten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen äußerst limitiert und die Übertragbarkeit größerer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko während mehrtägiger In vitro-Expansion fragwürdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazität der allergenspezifischen nTregs deutlich erhöhte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu unterstützen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.

In vivo konditionale Depletion von latentem murinen Cytomegalovirus

Die Lunge stellt einen Hauptort der CMV-Latenz dar. Die akute CMV-Infektion wird durch infiltrierende antivirale CD8 T-Zellen terminiert. Das virale Genom verbleibt jedoch im Lungengewebe in einem nicht replikativen Zustand, der Latenz, erhalten. Es konnte bereits gezeigt werden, dass während der Latenz die Major Immediate Early- (MIE) Gene ie1- und ie2 sporadisch transkribiert werden. Bisher konnte diese beginnende Reaktivierung latenter CMV-Genome nur in einer Momentaufnahme gezeigt werden (Kurz et al., 1999; Grzimek et al., 2001; Simon et al., 2005; zur Übersicht: Reddehase et al., 2008). Die sporadische Expression der MIE-Gene führt jedoch zur Präsentation eines antigenen IE1-Peptids und somit zur Stimulation antiviraler IE1-Peptid-spezifischer CD8 T-Zellen, die durch ihre Effektorfunktion die beginnende Reaktivierung wieder beenden. Dies führte uns zu der Hypothese, dass MIE-Genexpression über einen Zeitraum betrachtet (period prevalence) häufiger stattfindet als es in einer Momentaufnahme (point prevalence) beobachtet werden kann.rnrnUm die Häufigkeit der MIE-Genexpression in der Dynamik in einem definierten Zeitraum zu erfassen, sollte eine Methode entwickelt werden, welche es erstmals ermöglicht, selektiv und konditional transkriptionell aktive Zellen sowohl während der akuten Infektion als auch während der Latenz auszulöschen. Dazu wurde mit Hilfe der Zwei-Schritt BAC-Mutagenese ein rekombinantes death-tagged Virus hergestellt, welches das Gen für den Diphtherie Toxin Rezeptor (DTR) unter Kontrolle des ie2-Promotors (P2) enthält. Ist der P2 transkriptionell aktiv, wird der DTR an der Zelloberfläche präsentiert und die Zelle wird suszeptibel für den Liganden Diphtherie Toxin (DT). Durch Gabe von DT werden somit alle Zellen ausgelöscht, in denen virale Genome transkriptionell aktiv sind. Mit zunehmender Dauer der DT-Behandlung sollte also die Menge an latenten viralen Genomen abnehmen.rnrnIn Western Blot-Analysen konnte das DTR-Protein bereits 2h nach der Infektion nachgewiesen werden. Die Präsentation des DTR an der Zelloberfläche wurde indirekt durch dessen Funktionalität bewiesen. Das rekombinante Virus konnte in Fibroblasten in Gegenwart von DT nicht mehr replizieren. In akut infizierten Tieren konnte die virale DNA-Menge durch eine einmalige intravenöse (i.v.) DT-Gabe signifikant reduziert werden. Verstärkt wurde dieser Effekt durch eine repetitive i.v. DT-Gabe. Auch während der Latenz gelang es, die Zahl der latenten viralen Genome durch repetitive i.v. und anschließende intraperitoneale (i.p.) DT-Gabe zu reduzieren, wobei wir abhängig von der Dauer der DT-Gabe eine Reduktion um 60\% erreichen konnten. Korrespondierend zu der Reduktion der DNA-Menge sank auch die Reaktivierungshäufigkeit des rekombinanten Virus in Lungenexplantatkulturen. rnrnrnUm die Reaktivierungshäufigkeit während der Latenz berechnen zu können, wurde durch eine Grenzverdünnungsanalyse die Anzahl an latenten viralen Genomen pro Zelle bestimmt. Dabei ergab sich eine Kopienzahl von 9 (6 bis 13). Ausgehend von diesen Ergebnissen lässt sich berechnen, dass, bezogen auf die gesamte Lunge, in dem getesteten Zeitraum von 184h durch die DT-Behandlung 1.000 bis 2.500 Genome pro Stunde ausgelöscht wurden. Dies entspricht einer Auslöschung von 110 bis 280 MIE-Gen-exprimierenden Lungenzellen pro Stunde. Damit konnte in dieser Arbeit erstmals die Latenz-assoziierte Genexpression in ihrer Dynamik dargestellt werden.rn

Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn

Mechanismen der Antigenpräsentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abhängig von der effizienten MHC-Klasse-I-Präsentation viraler Peptide auf der Zelloberfläche. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdrücken, interferieren während der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellulären Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort primär auf der Cross-Präsentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabhängig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Präsentation viraler Peptide durch die zusätzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verstärkt zu unterdrücken. Wie erwartet reduzierte die verstärkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Präsentation in vitro. Dies führte überraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-Mäuse (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpräsentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zusätzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Präsentations-defizienten Mäusen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung bestätigt, dass durch direkte Antigenpräsentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verstärkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verstärkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdrückt. Dies konnte sowohl früh nach Infektion, als auch während der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zusätzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-hämatopoetischen Zellen, die das IE1-präsentierende MHC-I-Molekül Ld nicht auf den nicht-hämatopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpräsentation auf nicht-hämatopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpräsentation bestimmt wird.

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Etablierung eines Triple-Kultur-Modells der oberen Atemwege unter Einbeziehung immunkompetenter Zellen

Organophosphate können chronische Lungenerkrankungen und Vergiftungen hervorrufen. Bei der Vergiftung erfolgt eine Immunreaktion, welche noch nicht erforscht ist. In dieser Arbeit wurden Toxizitätsstudien an dendritischen Zellen und einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Dendritische Zellen spielen bei der ersten Immunabwehr in der Lunge eine große Rolle. Aus der Zell-Linie THP-1 und primären Monozyten wurden reife dendritische Zellen differenziert und mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz auf spezifische Zellmarker, wie zum Beispiel CD11c, CD83 oder auch CD209, charakterisiert und etabliert. Durch die Vergiftung der Zellen mit Dimethoat und Chlorpyrifos konnte eine Erhöhung des Zelltodes, die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren, Veränderungen in der Morphologie der Zellen und ein Effekt auf den Proteinkinase-Signalweg festgestellt werden. Spezifische dendritische Zellmarker (CD83, CD209) wurden inhibiert und die Dendriten der Dendritischen Zellen kürzer und beschädigt. Die Schädigung von Chlorpyrifos war erheblich größer, als die bei Dimethoat.rnDie weiteren Toxizitätsstudien wurden an einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Hierzu wurden auf Transwell-Filtermembranen bronchiale Epithelzellen, Fibroblastenzellen und Dendritische Zellen verwendet. Die bronchialen Epithelzellen und Fibroblastenzellen waren hier physiologisch voneinander getrennt, konnten aber durch Poren in der Membran miteinander interagieren. Die Etablierung des Triple-Kultur-Modells erfolgte durch die Untersuchung von Entzündungsprozessen, durch Stimulation mit LPS, TNF-alpha und Interferon-gamma. In der Ko-Kultur konnten Zell-Zell-Kontakt Schädigungen und Erhöhung von proinflammatorischen Markern, wie zum Beispiel IL-1ß, IL-6 oder auch IL-8 gemessen werden. Versuche in der Triple-Kultur zeigten den positiven Effekt von Dendritischen Zellen. Bei höheren Konzentrationsbereichen von Dimethoat und Chlorpyrifos konnte ein Wandern der Zellen zu den geschädigten Zell-Zell-Kontakten nachgewiesen werden. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Mediatoren wurde inhibiert, vor allem bei IL-10 war eine deutliche Reduktion, um mehr als 70% messbar. Ebenso konnten Veränderungen in dem Apoptose-Signalblick festgestellt werden. Vor allem anti-apoptotische Proteine wurden nach einer Vergiftung der Triple-Kultur induziert. Interventionsstudien mit Vitamin C zeigten allerdings keinen positiven Effekt.

Oxidative stress and inflammation response after nanoparticle exposure: differences between human lung cell monocultures and an advanced three-dimensional model of the human epithelial airways

Combustion-derived and manufactured nanoparticles (NPs) are known to provoke oxidative stress and inflammatory responses in human lung cells; therefore, they play an important role during the development of adverse health effects. As the lungs are composed of more than 40 different cell types, it is of particular interest to perform toxicological studies with co-cultures systems, rather than with monocultures of only one cell type, to gain a better understanding of complex cellular reactions upon exposure to toxic substances. Monocultures of A549 human epithelial lung cells, human monocyte-derived macrophages and monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) as well as triple cell co-cultures consisting of all three cell types were exposed to combustion-derived NPs (diesel exhaust particles) and to manufactured NPs (titanium dioxide and single-walled carbon nanotubes). The penetration of particles into cells was analysed by transmission electron microscopy. The amount of intracellular reactive oxygen species (ROS), the total antioxidant capacity (TAC) and the production of tumour necrosis factor (TNF)-alpha and interleukin (IL)-8 were quantified. The results of the monocultures were summed with an adjustment for the number of each single cell type in the triple cell co-culture. All three particle types were found in all cell and culture types. The production of ROS was induced by all particle types in all cell cultures except in monocultures of MDDCs. The TAC and the (pro-)inflammatory reactions were not statistically significantly increased by particle exposure in any of the cell cultures. Interestingly, in the triple cell co-cultures, the TAC and IL-8 concentrations were lower and the TNF-alpha concentrations were higher than the expected values calculated from the monocultures. The interplay of different lung cell types seems to substantially modulate the oxidative stress and the inflammatory responses after NP exposure.

Drug hypersensitivity reactions involving skin

Immune reactions to drugs can cause a variety of diseases involving the skin, liver, kidney, lungs, and other organs. Beside immediate, IgE-mediated reactions of varying degrees (urticaria to anaphylactic shock), many drug hypersensitivity reactions appear delayed, namely hours to days after starting drug treatment, showing a variety of clinical manifestations from solely skin involvement to fulminant systemic diseases which may be fatal. Immunohistochemical and functional studies of drug-specific T cells in patients with delayed reactions confirmed a predominant role for T cells in the onset and maintenance of immune-mediated delayed drug hypersensitivity reactions (type IV reactions). In these reactions, drug-specific CD4+ and CD8+ T cells are stimulated by drugs through their T cell receptors (TCR). Drugs can stimulate T cells in two ways: they can act as haptens and bind covalently to larger protein structures (hapten-carrier model), inducing a specific immune response. In addition, they may accidentally bind in a labile, noncovalent way to a particular TCR of the whole TCR repertoire and possibly also major histocompatibility complex (MHC)-molecules - similar to their pharmacologic action. This seems to be sufficient to reactivate certain, probably in vivo preactivated T cells, if an additional interaction of the drug-stimulated TCR with MHC molecules occurs. The mechanism was named pharmacological interaction of a drug with (immune) receptor and thus termed the p-i concept. This new concept may explain the frequent skin symptoms in drug hypersensitivity to oral or parenteral drugs. Furthermore, the various clinical manifestations of T cell-mediated drug hypersensitivity may be explained by distinct T cell functions leading to different clinical phenotypes. These data allowed a subclassification of the delayed hypersensitivity reactions (type IV) into T cell reactions which, by releasing certain cytokines and chemokines, preferentially activate and recruit monocytes (type IVa), eosinophils (type IVb), or neutrophils (type IVd).

Extensive extranodal metastases of basal-like breast cancer with predominant myoepithelial spindle cell differentiation

A differentiation towards myoepithelial cells has been demonstrated in several types of lesions in the breast. These include multifocal myoepitheliomatosis, the rare mixed tumor or pleomorphic adenoma, adenoid cystic carcinoma, adenomyoepithelioma and myoepithelial carcinoma (malignant myoepithelioma). Myoepithelial carcinoma is the only lesion purely composed of myoepithelial cells. All these tumors are benign and/or of low-grade malignancy, with the exception of malignant myoepithelioma. In contrast to the statement of the current World Health Organization (WHO), recent studies have reported that regional and distant metastases may occur in about 50% of pure myoepithelial carcinomas. The presented case of a breast carcinoma with dominant myoepithelial/spindle cell differentiation in a 58-year-old woman is an excellent example to document the highly aggressive biological behavior of this tumor phenotype. Despite an extensive chemotherapy and radiotherapy, the tumor was rapidly progressive, forming a finally exulcerating local tumor relapse and widespread metastases to the myocardium, lungs, liver, kidneys and skin. Similarities in morphology and biological behavior compared to patients with "triple-negative" (hormone receptor and Her2) monophasic sarcomatoid carcinomas and pure spindle cell sarcomas are discussed.

Diagnosis of fatal pulmonary fat embolism with minimally invasive virtual autopsy and post-mortem biopsy

We report a case of a 78-year-old female with a proximal femur fracture caused by an accidental fall who died suddenly 1h after orthopaedic prosthesis insertion. Post-mortem computed tomography (CT) scan and histological examination of samples obtained with post-mortem percutaneous needle biopsies of both lungs were performed. Analysis of the medical history and the clinical scenario immediately before death, imaging data, and biopsy histology established the cause of death without proceeding to traditional autopsy. It was determined to be acute right ventricular failure caused by massive pulmonary fat embolism. Although further research in post-mortem imaging and post-mortem tissue sampling by needle biopsies is necessary, we conclude that the use of CT techniques and percutaneous biopsy, as additional tools, can offer a viable alternative to traditional autopsy in selected cases and may increase the number of minimally invasive forensic examinations performed in the future.

Pulse or hyaline ring granuloma. Review of the literature on etiopathogenesis of oral and extraoral lesions

Since the late 1950s, reports on an unusual giant-cell granulomatous lesion affecting the jaws, lungs, stomach and intestines have been published. Histopathologically, the lesions showed the presence of structureless hyaline rings with multinucleated giant cells. The aim of this review was to summarize the literature on the etiopathogenesis of the so-called oral and extraoral pulse or hyaline ring granuloma. Literature was searched using PubMed and Medline. In addition, hand search was performed. Search words were oral and extraoral hyaline ring granuloma, giant-cell hyaline angiopathy, pulse granuloma and chronic periostitis. Numerous terms for hyaline ring granuloma have been introduced over time (1971-2008). One hundred seventy-three cases of oral hyaline ring granuloma have been retrieved from the literature. In the mandible, 72.3% occurred . Two theories for etiopathogenesis have been proposed: (1) the origin of the hyaline rings is due to a foreign material (pulse and legumes) having penetrated the oral mucosa or gastrointestinal tract and lungs (exogenous theory) and (2) the rings are due to hyaline degenerative changes in walls of blood vessels (endogenous theory). Experimental production of oral and extraoral hyaline ring granulomas is consistent with the exogenous origin. Particles or remains of leguminous cells having been implanted or aspirated into human tissues whether located to the oral cavity or throughout the entire digestive tract and respiratory system are thought to be causative. Pulse or hyaline ring granulomas are rare but are well-defined oral and extraoral lesions due to implantation of the cellulose moiety of plant foods in contrast to the starch components.

Effects of lung recruitment maneuvers on splanchnic organ perfusion during endotoxin-induced pulmonary arterial hypertension

Lung recruitment maneuvers (RMs), used to reopen atelectatic lung units and to improve oxygenation during mechanical ventilation, may result in hemodynamic impairment. We hypothesize that pulmonary arterial hypertension aggravates the consequences of RMs in the splanchnic circulation. Twelve anesthetized pigs underwent laparotomy and prolonged postoperative ventilation. Systemic, regional, and organ blood flows were monitored. After 6 h (= baseline), a recruitment maneuver was performed with sustained inflation of the lungs. Thereafter, the pigs were randomly assigned to group C (control, n = 6) or group E with endotoxin-induced pulmonary arterial hypertension (n = 6). Endotoxemia resulted in a normotensive and hyperdynamic state and a deterioration of the oxygenation index by 33%. The RM was then repeated in both groups. Pulmonary artery pressure increased during lipopolysaccharide infusion from 17 ± 2 mmHg (mean ± SD) to 31 ± 10 mmHg and remained unchanged in controls (P < 0.05). During endotoxemia, RM decreased aortic pulse pressure from 37 ± 14 mmHg to 27 ± 13 mmHg (mean ± SD, P = 0.024). The blood flows of the renal artery, hepatic artery, celiac trunk, superior mesenteric artery, and portal vein decreased to 71% ± 21%, 69% ± 20%, 76% ± 16%, 79% ± 18%, and 81% ± 12%, respectively, of baseline flows before RM (P < 0.05 all). Organ perfusion of kidney cortex, kidney medulla, liver, and jejunal mucosa in group E decreased to 65% ± 19%, 77% ± 13%, 66% ± 26%, and 71% ± 12%, respectively, of baseline flows (P < 0.05 all). The corresponding recovery to at least 90% of baseline regional blood flow and organ perfusion lasted 1 to 5 min. Importantly, the decreases in regional blood flows and organ perfusion and the time to recovery of these flows did not differ from the controls. In conclusion, lipopolysaccharide-induced pulmonary arterial hypertension does not aggravate the RM-induced significant but short-lasting decreases in systemic, regional, and organ blood flows.