Carga proviral do HTLV-1 e HTLV-2: um método simples através da PCR quantitativa em tempo real

Os vírus linfotrópicos de células T humanas, quando integrados ao genoma da célula hospedeira, provírus, têm como marcador de replicação seu DNA proviral. A carga proviral parece ser um importante fator no desenvolvimento de patologias associadas a estes retrovírus. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia para quantificação absoluta da carga proviral dos HTLV-1 e HTLV-2 através da PCR em tempo real. Cinqüenta e três amostras de doadores de sangue com teste de ELISA reagente foram submetidas à metodologia, que utilizou o sistema TaqMan® para três seqüências alvo: HTLV-1, HTLV-2 e albumina. A quantificação proviral absoluta foi determinada através da proporção relativa entre o genoma do HTLV e o genoma da célula hospedeira, levando em consideração o número de leucócitos. O método apresentado é sensível (215 cópias/mL), prático e simples para quantificação proviral, além de eficiente e adequado para confirmação e discriminação da infecção pelos tipos virais.

Breves pensamentos em torno dos Mirabilia Aqvarvm

Revista do IHA, N.5 (2008), pp.220-222

Alterações hematológicas, hemostáticas e bioquímicas induzidas pela clofazimina e claritromicina, em doses única e múltiplas, em ratos

Claritromicina e clofazimina têm sido utilizadas no tratamento da hanseníase, tuberculose e infecções causadas pelo complexo Mycobacterium avium. Como os dados sobre a toxicidade de esquemas terapêuticos que incluem estes fármacos são escassos, este estudo teve como objetivo determinar os efeitos adversos destas terapias, por meio da avaliação dos parâmetros hematológicos, hemostáticos e bioquímicos. Os fármacos foram administrados em ratos machos Wistar, em monoterapia, em regime de doses única e múltipla. Claritromicina provocou aumento de leucócitos mono e polimorfonucleares. Ambos os fármacos inverteram a proporção entre células mono e polimorfonucleares e provocaram aumento do número de células polimorfonucleares e células em degeneração. Clofazimina e claritromicina prolongaram o tempo de protrombina e claritromicina também prolongou o tempo de tromboplastina parcial ativa. Claritromicina causou aumento de bilirrubinas total e direta e, ambos os fármacos, elevaram os níveis plasmáticos de gama-glutamiltransferase. Portanto, clofazimina e claritromicina induzem alterações hematológicas, hemostáticas e hepáticas.

Alterações da função hepática de camundongos desnutridos e infectados pelo Schistosoma mansoni

Existem poucos estudos sobre as alterações da função hepática em camundongos com esquistossomose associada à desnutrição. Neste trabalho, os animais foram divididos em quatro grupos, de acordo com as dietas (normal ou hipoprotéica) e infectados ou não pelo Schistosoma mansoni. Todos os grupos desenvolveram-se menos que o grupo controle (p<0,0001). A mortalidade nos animais foi devida à infecção. Níveis altos de aminotransferases nos animais nutridos e infectados sugerem um processo inflamatório intenso (p<0,0001). Todos os grupos apresentaram elevação da fosfatase alcalina. Houve aumento da aspartato transferase e da fosfatase alcalina em animais nutridos infectados. As dietas modificaram os níveis de albumina (p>0,001), e das proteínas séricas. Os grupos, comparados ao controle, mostraram baixos níveis de glicose (p<0,001). Este estudo verificou que ambas, infecção e/ou desnutrição, interferiram nos níveis dos indicadores bioquímicos, mas as alterações mais importantes da função hepática ocorreram durante a inflamação intensa causada pela esquistossomose.

Perfil hematológico, bioquímico sérico e sorológico de Felis domesticus com lagochilascariose experimental

No presente trabalho, avaliou-se o hemograma, diversas proteínas e enzimas séricas ou plasmáticas e a produção de anticorpos específicos em Felis domesticus, experimentalmente infectados por Lagochilascaris minor. Verificou-se nos animais infectados aumento de leucócitos totais, principalmente eosinófilos; queda do número de plaquetas; aumento de aspartato-aminotransferase e alanina-aminotransferase; e principalmente a presença de anticorpos IgG específicos para antígenos do parasita. A reação com extrato bruto de parasitas adultos mostrou-se mais específica, permitindo a discriminação de soros de animais: não infectados, com infecção por outros parasitas, e com lagochilascariose. Esta é a primeira descrição da padronização de uma reação sorológica para diagnóstico da lagochilascariose em Felis domesticus.

Papel do óxido nítrico no desenvolvimento de lesões cardíacas na fase aguda da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e o coração é o órgão mais acometido. O óxido nítrico apresenta importante ação anti-Trypanosoma, porém, com pouca evidência de seu papel no mecanismo de lesão tecidual. O objetivo deste estudo foi analisar a contribuição do óxido nítrico no desenvolvimento da inflamação e da fibrose cardíaca na fase aguda da infecção experimental por cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi. A inflamação foi significativamente maior nos animais infectados pela cepa Colombiana, comparada com os infectados com a cepa Y, tanto nos animais C57BL/6 (3,98x1,87%; p=0,004) quanto nos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível (3,99x2,4%; p=0,013). O parasitismo cardíaco dos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível infectados pela cepa Colombiana foi significativamente maior que o destes mesmos animais infectados com a cepa Y (2,78x0,17 ninhos/mm²; p=0,004) assim como, os animais C57BL/6 infectados com a cepa Colombiana (2,78x1,33 ninhos/mm²; p=0,006) ou cepa Y (2,78x0,53 ninhos/mm²; p=0,005). Os dados reforçam o papel do óxido nítrico no controle do parasitismo e sugerem seu papel na proteção tecidual, controlando a inflamação e potencialmente diminuindo lesões cardíacas durante a fase aguda na doença de Chagas experimental.

Influência da resposta inflamatória de fase aguda nos níveis séricos de retinol e da proteína de ligação do retinol em pacientes com AIDS

INTRODUÇÃO: a hiporretinolemia constitui fator prognóstico independente em pacientes com AIDS, e a atividade inflamatória causa redução dos níveis séricos deste nutriente na população em geral. Entretanto, faltam estudos que avaliem o impacto da atividade inflamatória sobre o nível sérico do retinol em pacientes com AIDS. MÉTODOS: foram avaliados transversalmente 41 pacientes internados por complicações da AIDS, que tiveram quantificados alguns marcadores de inflamação (proteína C reativa e fator de necrose tumoral alfa) e concentrações séricas de retinol e da proteína de ligação do retinol. RESULTADOS: apesar da baixa (14,6%) prevalência de hiporretinolemia evidenciou-se correlação negativa dos marcadores de inflamação com os níveis séricos de retinol e de sua proteína de ligação nos pacientes com AIDS. CONCLUSÕES: a atividade inflamatória de fase aguda está associada a baixos níveis séricos de retinol em indivíduos com AIDS.

Avaliação longitudinal das concentrações solúveis de CD40L e de marcadores hemorreológicos na doença inflamatória aguda

Actualmente a sepsis continua a ser uma das principais causas de morte durante o internamento em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Apesar dos recentes avanços a nível terapêutico existem ainda lacunas por preencher nomeadamente ao nível da identificação de biomarcadores que permitam um melhoramento do prognóstico tendo em conta a necessidade de identificação de doentes de maior risco. Este estudo foi realizado com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da influência de alterações na microcirculação na sepsis. Para tal foram analisados diversos parâmetros hemorreológicos, como a deformabilidade e agregação eritrocitárias, NO e GSNO eritrocitário. Foi também avaliada a relação de tais parâmetros com a inflamação e trombose através da avaliação da concentração sérica de sCD40L. O estudo incidiu sobre doentes com choque séptico (n=22) e indivíduos saudáveis (n=34). Os doentes com sepsis foram monitorizados na admissão na UCI, 24 e 72 horas depois. Verificaram-se variações longitudinais nos valores de agregação eritrocitária, cujos valores aumentam ao longo do tempo de internamento, até atingirem às 72h valores significativamente diferentes do grupo controlo. Uma tendência inversa apresenta os valores de GSNO eritrocitário, os quais estão aumentados nos doentes em choque séptico aquando da admissão à UCI, diminuindo para valores semelhantes ao grupo controlo. Observaram-se também variações nas concentrações de sCD40L, tendo sido registada uma diminuição ao longo do tempo tornando-se evidente às 72 horas após o internamento. Apesar de preliminares, a comparação entre doentes sobreviventes e não-sobreviventes permitiu inferir uma possível relação do aumento de sCD40L e diminuição de NO e GSNO eritrocitários na admissão com um pior prognóstico. Estes resultados vêm fundamentar a ideia de que existe realmente uma relação entre as alterações a nível da microcirculação e a sepsis.

Unravelling the role of alpha 2,6 sialic acid on mouse dentritic cells functions

RESUMO: As células dendríticas (CDs) são fundamentais na imunomodulação e iniciação de respostas imunes adaptativas, enquanto os ácidos siálicos (Sias) são potenciais imunomoduladores. Estas células expressam níveis elevados da sialiltransferase ST6Gal-1, que transfere Sias para a posição terminal de oligossacáridos. De facto, a maturação de CDs está associada a uma diminuição da sialilação na sua superfície celular. Apesar de ter função biológica desconhecida, a forma solúvel, extracelular de ST6Gal-1 aumenta em cancros e inflamação. Ainda assim, esta foi recentemente identificada como moduladora da hematopoiese. Considerando o importante papel das CDs na iniciação de respostas anticancerígenas, uma ligação entre a sialilação extrínseca induzida por ST6Gal-1 extracelular e o seu papel na modulação de CDs deve ser identificada. Neste trabalho hipotetizou-se que a sialilação α2,6 extrínseca de CDs diminui o seu perfil de maturação mediante ativação por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo principal foi sialilar extrinsecamente em α2,6 CDs da medula óssea de murganhos, avaliando os seus perfis de maturação e de libertação de citocinas, após estimulação com LPS (por Citometria de Fluxo e ELISA, respetivamente). Ao contrário da hipótese, o perfil celular não foi modulado, usando várias abordagens. Por outro lado, a consequência da falta de α2,6 Sias na maturação de CDs foi avaliada analisando: 1) CDs da medula óssea de murganhos tratadas com sialidase, 2) CDs da medula óssea e 3) CDs das vias aéreas, ambas de murganhos deficientes em ST6Gal-1, comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que a perta total de α2,6 Sias se relaciona com o aumento da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II. Apesar de controverso, é provável existirem mecanismos inerentes à ativação por LPS, reduzindo a eficácia de ST6Gal-1 extracelular. Por outro lado, a modificação no perfil de CDs de murganhos deficientes em ST6Gal-1 poderá relacionar-se com uma predisposição para um estado inflamatório severo. Com isto, o trabalho desenvolvido abriu futuras linhas de investigação, nomeadamente explorar outros fatores envolvidos na (de)sialilação α2,6 de CDs, podendo ter impacto em imunoterapia com uso de CDs.--------------------------ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) are vital for immunomodulation and the initiation of adaptive immune responses, whereas sialic acids (Sias) are potential immunomodulators. These cells express high levels of sialyltransferase ST6Gal-1, responsible for transferring Sias to the terminal position of oligosaccharide chains. Indeed, DCs’ maturation is associated with decreased cell surface sialylation. Although its biological significance is unknown, the soluble, extracellular form of ST6Gal-1 increases in cancers and inflammation. However, extracellular ST6Gal-1 was recently identified as modulator of hematopoiesis. Considering that DCs play a crucial role in the initiation of a productive anti-cancer immune response, a link between extrinsic sialylation by the extracellular ST6Gal-1 on DC function needs to be investigated. We hypothesize that extrinsic α2,6 sialylation of DCs diminishes their maturation features upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The main goal was to extrinsically α2,6 sialylate mice bone marrow derived DCs (BMDCs) and to evaluate their maturation and cytokine profiles upon LPS stimulation (by Flow Cytometry and ELISA, respectively). Unlike the hypothesis, we observed that BMDCs’ profile is not modulated, even using several approaches. In contrast, the consequence of lacking cell surface α2,6 Sias in DC maturation was assessed by analysing: 1) sialidase treated BMDCs, 2) BMDCs from mice lacking ST6Gal-1 and 3) DCs from mice airways, comparing wild type with ST6Gal-1 knockout mice. These results suggest that overall lack in α2,6 Sias is related with increased expression of major histocompatibility class II (MHC-II). Although appearing to be controversial findings, other intracellular mechanisms might be occurring upon LPS-induced BMDC activation, probably reducing extracellular ST6Gal-1 effect. In opposite, the modification observed in DC profile of ST6Gal-1 knockout mice might be related to its predisposition to a more severe inflammatory status. With this, the developed work opened future lines of investigation, namely exploring other factors involved in α2,6 (de)sialylation of DC, which might have influence in immunotherapy using DCs.

Non-cell autonomous neuroprotective effect of carbon monoxide : microglia-to-neuron communication

RESUMO: A isquémia cerebral é uma das doenças mais predominantes a nivel mundial, sendo uma das principais causas de mortalidade e invalidez. Parte da propagação de dano no cérebro é causado por inflamação descontrolada, causada principalmente por disfunção da microglia. Desta forma, existe a necessidade de tentar desenvolver estratégias para melhor compreender e modular as acções destas células. O monóxido de carbono (CO), é uma molécula endógena com provas dadas como anti-neuroinflamatório em vários modelos. Assim, o principal objectivo do trabalho foi o estudo do CO como um modulador da acção da microglia, com principal foco dado à comunicação entre estas células e neurónios, tentando entender se existe um efeito neuroprotector por inibição da inflamação. Um protocolo de meio condicionado foi estabelecido usando as linhas celulares BV2 e SH-SY5Y, de microglia e neurónio. A molécula CORM-A1, que liberta expontaniamente CO, foi usada como método de entrega da molécula às celulas. Demonstrámos que o pre-tratamento de células BV2 com CORM-A1 gera neuroprotecção já que reduz a morte celular de neurónios SH-SY5Y quando são incubados com meio condicionado de microglia activada em conjunto com o pró-oxidante t-BHP (tert-butil hidroperóxido). Assim, considerámos que o CO promove neuroprotecção ao inibir as acções inflamatórias da microglia. O papel anti-inflamatório da molécula CORM-A1 foi confirmado quando se verificou que pré-tratamento desta molécula em microglia BV2 limita a secreção de TNF-α mas estimula a secreção de IL-10. Por último, a CORM-A1 induziu a expressão do receptor da microglia CD200R1, molécula que participa na comunicação neurónio-microglia e fundamental para a modulação das acções inflamatórias destas últimas. Em suma, o nosso trabalho reforçou as propriedades anti-neuroinflamatórias do CO e uma capacidade de modular viabilidade neuronal através do seu efeito a nível de comunicação célula-célula. ---------------------------- ABSTRACT: Brain ischemia is a widespread disease worldwide, being one of the main causes of mortality and permanent disability. A portion of the damage that ensues following the ischemic event is caused by unrestrained inflammation, which is mainly orchestrated by exacerbated microglial activity. Hence, developing strategies for modulating microglial inflammation is a major concern nowadays. The endogenous molecule carbon monoxide (CO) has been shown to possess anti-neuroinflammatory properties using in vitro and in vivo approaches. Thus, our objective was to study CO as modulator of microglial activity, in particular in what concerns their communication with neurons, by promoting neuronal viability and limiting inflammatory output of activated microglia. A conditioned media strategy was established with BV2 microglia and SH-SY5Y neurons as cell models. CO-releasing molecule A1 (CORM-A1), a compound that releases CO spontaneously, was used as method of CO delivery to cells. We found that CORM-A1 pre-treatment in BV2 cells yields neuroprotective results, as it limits cell death when SH-SY5Y neurons are challenged with conditioned media from LPS-activated microglia and the pro-oxidant t-BHP (tert-butyl-hydroperoxide). Thus, we assumed carbon monoxide promotes neuroprotection via inhibition of microglial inflammation, displaying a non-cell autonomous role. CORM-A1 pre-treatment limited inflammation by inhibiting BV2 secretion of TNF-α and stimulating IL-10 production. These results reinforce that CO’s anti-inflammatory role confers neuroprotection, as the alterations in these cytokines occur concurrently with the increase in SH-SY5Y viability. Finally, we showed for the first time that carbon monoxide promotes the expression of CD200R1, a microglial receptor involved in neuron-glia communication and modulation of microglia inflammation. Further studies are necessary to clarify this role. Altogether, other than just highlighting CO as an anti-inflammatory and neuroprotective molecule, this work set the foundation for disclosing its involvement in cell-to-cell communication.

Avaliação da influência do ferro e alumínio sobre o crescimento e produção de toxinas por cianobactérias em cultura mista

Na presente dissertação foram investigados os efeitos de dois metais, ferro e alumínio, sobre o crescimento e produção de toxinas por cianobactérias, em culturas mistas, ricas em Microcystis aeruginosa. Florescências tóxicas desta cianobactéria são conhecidas por ocorrer em lagos, albufeiras e rios por todo o mundo. As microcistinas, toxinas produzidas por esta espécie, são as mais comummente detectadas, e já mostraram ser tóxicas para mamíferos, peixes e invertebrados. O ferro é bem conhecido por ser um metal essencial ao metabolismo de cianobactérias, e ao alumínio, não lhe é atribuído nenhuma função biológica. A amostra foi recolhida na lagoa das Furnas (Açores). Foram testadas quatro doses de ferro (0, 10, 20 e 30 μM) e quatro doses de alumínio (0, 2, 4 e 8 μM). O crescimento foi monitorizado pela produção de biomassa, avaliado pelo conteúdo de clorofila a e carbono orgânico particulado. No ensaio com o ferro o crescimento da biomassa e produção de toxinas intracelulares foram favorecidos pelo aumento da concentração de ferro. A cultura com a maior dose de ferro testada (30 μM) foi a que apresentou maior crescimento ao longo do período experimental e maior concentração de toxinas intracelulares no final do mesmo. A cultura sem adição de ferro foi a que apresentou menores concentrações dos parâmetros avaliados. Ficou demonstrada a influência deste metal no crescimento, na produção de pigmentos e de toxinas pelas cianobactérias. No ensaio com o alumínio, houve um aumento de biomassa nas culturas, mas este nunca foi superior à cultura sem adição de alumínio. A produção de toxinas intracelulares foi decrescente com o aumento da concentração de alumínio nas culturas, e a produção de toxinas extracelulares foi crescente. Desta forma, foi possível constatar que o alumínio inibiu a produção de biomassa e de toxinas intracelulares e promoveu a libertação das mesmas. A realização de trabalhos experimentais com seres vivos resulta nalguma variabilidade e imprevisibilidade dos resultados. O facto de se ter realizado apenas uma réplica para cada ensaio constitui limitações a este trabalho.

Avaliação do potencial anti-inflamatório, antioxidante e antimicrobiano de extratos de segurelha, salsa e coentros

Recentemente tem-se observado um crescente interesse pelo uso de plantas aromáticas, devido às inúmeras propriedades benéficas que lhes têm sido associadas, e a sua aplicação em diversas indústrias, como a indústria alimentar e farmacêutica. Este estudo incidiu sob três ervas aromáticas utilizadas comummente em Portugal: coentros, salsa e segurelha. O objetivo do mesmo foi contribuir para um melhor conhecimento das propriedades bioativas das plantas estudadas, através da determinação do seu teor em compostos fenólicos totais e em flavonoides, e avaliação das suas atividades antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória. A atividade antioxidante foi determinada através de diferentes tipos de ensaios, nomeadamente avaliação da capacidade redutora, com os ensaios FRAP e CUPRAC, avaliação da capacidade de sequestro do radical DPPH• e avaliação da capacidade de sequestro do radical anião superóxido. A atividade antimicrobiana foi determinada utilizando três estirpes microbianas, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Por sua vez, a ação anti-inflamatória foi determinada através de ensaios in-vivo apenas para a segurelha, utilizando dois modelos, um para a inflamação aguda (modelo de edema da pata induzido pela carragenina) e outro para a inflamação crónica (modelo da colite ulcerativa). Os resultados demonstraram que todos os extratos de plantas aromáticas possuem atividade antioxidante, sendo que o extrato de segurelha foi aquele que apresentou um maior teor de compostos fenólicos e flavonoides, bem como o que demonstrou possuir uma maior atividade antioxidante relativamente aos restantes extratos estudados, o que sugere o envolvimento destes compostos neste tipo de atividade antioxidante. Entre o extrato de coentros e salsa, o extracto de coentros apresentou um teor em compostos fenólicos e uma actividade antioxidante significativamente superior relativamente ao extracto de salsa. O extrato de segurelha foi o único que apresentou ação antimicrobiana, o que poderá indicar que os compostos fenólicos se encontram também interligados com esta propriedade. A atividade anti-inflamatória foi determinada apenas para o extrato de segurelha, sendo que se observou que este possui efeitos benéficos para a inflamação aguda e crónica, o que poderá estar novamente relacionado com o seu teor em fenóis e flavonoides. O efeito anti-inflamatório observado com o extrato de segurelha no modelo de colite pode ser muito útil do ponto de vista de profilaxia pois o extrato foi administrado aos animais logo a seguir à indução da colite e os resultados demonstram haver uma diminuição significativa da extensão e violência dos sinais da inflamação crónica observados no grupo controlo positivo.

Osteoclastogenesis, inflammatory cytokines and biomarkers of bone metabolism in psoriatic arthritis

RESUMO:A artrite psoriática (AP) é uma doença inflamatória crónica caracterizada por várias manifestações nas articulações, nas enteses e na pele. A formação de novo osso após inflamação nas enteses é um dos aspetos mais intrigantes desta doença. Os mecanismos celulares e moleculares deste processo ainda não são completamente conhecidos. Este estudo tem como objetivo compreender melhor os mecanismos subjacentes à formação e reabsorção óssea, bem como o efeito de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) nestes processos. Para atingir este objetivo foram quantificados biomarcadores do metabolismo ósseo e citocinas inflamatórias em doentes AP, antes e após terapêutica com AINEs. Os biomarcadores selecionados foram marcadores de remodelação óssea como CTX-I e P1NP, fatores de diferenciação e ativação de osteoclastos como o RANKL e a OPG, inibidores da via de sinalização Wnt, nomeadamente o DKK-1 e a SOST e ainda citocinas pro-inflamatórias como a IL-22 e a IL-23 e a prostaglandina PGE2. Neste contexto foram também estabelecidas culturas celulares de monócitos, isoladas de doentes AP e de controlos saudáveis. Os monócitos foram cultivados in vitro em condições não estimuladas e estimuladas e realizados dois ensaios funcionais: coloração com TRAP e ensaio de reabsorção. Foi observada uma diminuição nos níveis séricos de CTX-I e OPG em doentes AP em relação aos controlos. De igual forma os níveis séricos de SOST encontram-se significativamente mais baixos, em comparação com os controlos saudáveis. Estes valores de SOST são semelhantes aos dos doentes com espondilite anquilosante (EA), documentados anteriormente. Os ensaios com osteoclastos confirmaram a necessidade da presença de RANKL para estimulação da osteoclastogénese e que o celecoxib parece ter um papel inibitório neste processo. Os resultados obtidos sugerem que a população de doentes com AP analisados têm baixos níveis de reabsorção óssea e alguma atividade na formação óssea. --------------------------- ABSTRACT: Psoriatic arthritis (PsA) is a chronic inflammatory disease characterized by several manifestations involving the joints, enthesis and the skin. New bone formation after inflammation at enthesis site has been one of the most intriguing aspects of the disease. Cellular and molecular mechanisms in this process are still not completely understood. This study aims to understand better the mechanisms underlying bone formation and resorption and the effect of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in these processes. To access that, biomarkers of bone metabolism and inflammatory cytokines were measured in PsA patients’ serum before and after NSAID therapy. These selected biomarkers were bone turnover markers such as CTX-I and P1NP, osteoclast differentiation and activation factors RANKL and OPG, Wnt pathway inhibitors DKK-1 and SOST and pro-inflammatory cytokines IL-22, IL-23 and prostaglandin PGE2. In this context monocyte cell culture was also established after PBMC isolation from PsA patients and healthy controls. Monocytes were cultured in vitro under unstimulated and stimulated conditions and two functional assays were performed: TRAP staining and resorption pit assay. It was demonstrated that CTX-I and OPG serum levels in PsA patients were lower than controls. SOST levels were extremely decreased in comparison with controls, resembling the ankylosing spondylitis patients results already documented. Osteoclast assays confirmed the need of RANKL in stimulating osteoclastogenesis and that celecoxib seems to have an inhibitor role in this process. The results obtained suggest that PsA patient population analyzed in this study have low bone resorption levels and some bone formation activity.

Perfil imunológico de grávidas atópicas versus grávidas saudáveis

RESUMO: A prevalência das doenças atópicas tem vindo a aumentar, em especial ao nível dos países ocidentalizados. Vários fatores têm sido apontados para justificar este aumento de prevalência,destacando-se o reduzido tamanho das famílias, o elevado uso de antibióticos, a melhoria das condições sanitárias, bem como a diminuição quer das infeções de helmintas, quer da contaminação orofecal. Alguns estudos têm também avaliado a influência do ambiente pré-natal no desenvolvimento de atopia e asma. Da análise da literatura, parece inegável a importância deste período para o desenvolvimento do sistema imunitário. Neste âmbito, a transmissão de atopia à descendência em mulheres atópicas, e concretamente com asma alérgica, poderá ser moldada desde este período. A possibilidade de identificar marcadores de risco precoces para o desenvolvimento de atopia poderá ser o primeiro passo para o desenvolvimento de estratégias de prevenção para os indivíduos em risco. Este trabalho pretendeu abordar o sistema imunitário materno de forma a enriquecer a sua caraterização desde o terceiro trimestre da gravidez até ao fim do puerpério. Para além da exploração de perfis celulares e citocínicos maternos (nos quais se incluiu sobretudo a avaliação de diferentes populações de células T e B, com funções efetoras e reguladoras), foi também considerada a sua eventual relação com o desenvolvimento de atopia nas crianças. Foram recrutadas 135 mulheres com critérios para serem incluídas num dos 4 grupos do estudo: grávidas atópicas – GA (n=24), não grávidas atópicas – NGA (n=32), grávidas saudáveis – GS (n=44) e não grávidas saudáveis – NGS (n=35). Foram caraterizadas por Citometria de Fluxo populações de leucócitos e linfócitos, com particular interesse nos perfis maturativos de linfócitos T e B, bem como nas subpopulações de células T e B reguladoras. Foi ainda efetuada uma análise funcional, para avaliar a capacidade de produção de citocinas pelos linfócitos T e B. Foram igualmente avaliadas as concentrações de citocinas séricas por ensaios imunoenzimáticos. Estes parâmetros imunológicos maternos foram acompanhados desde o terceiro trimestre de gestação, até depois do puerpério (primeiras 6 semanas pós parto), e aos seis meses de idade, foi efetuada uma avaliação clínica das crianças. As mulheres não grávidas atópicas apresentaram contagens celulares mais elevadas para a generalidade das populações leucocitárias e linfocitárias (em relação a mulheres não grávidas saudáveis). Destaca-se ainda uma maior presença de eosinófilos nas mulheres NGA (p=0,0009; teste de Mann-Whitney U), que tinham igualmente os seus compartimentos linfocitários T e B mais ricos em células de memória, em relação às mulheres NGS. Para os perfis de regulação, verificou-se que as células T reguladoras se encontravam percentualmente aumentadas (p≤0,003; teste de Mann-Whitney U), tal omo as células T produtoras de IL10 após estimulação (p≤0,03; teste de Mann-Whitney U) em mulheres NGA. Também se observou uma maior expressão de Foxp3 (p=0,0002; teste de Mann-Whitney U), e ainda a diminuição dos níveis séricos de IFN-γ nas mulheres NGA (p=0,0019; teste de Mann-Whitney U), em relação a mulheres NGS. De um modo geral, as alterações verificadas nos parâmetros imunológicos de mulheres grávidas atópicas no terceiro trimestre da gravidez foram semelhantes às observadas em mulheres grávidas saudáveis. Comparadas com mulheres NGA, nas mulheres grávidas atópicas ocorreu uma alteração substancial da fórmula leucocitária, com um importante incremento de neutrófilos (p<0,0001; teste de Mann-Whitney U) e diminuição dos valores das restantes populações leucocitárias. A diminuição nas contagens de linfócitos totais estendeu-se a grande parte das subpopulações linfocitárias caraterizadas. Nos compartimentos linfocitários T e B foi possível observar uma diminuição das subpopulações de células de memória. Verificou-se igualmente na gravidez uma menor expressão de Foxp3 em mulheres GA (p<0,0001; teste de Mann-Whitney U) e ainda menos células B CD24HiCD38Hi circulantes (p=0,0012; teste de Mann-Whitney U). Ocrreu ainda uma diminuição relativa das células T CD4 produtoras de IFN-γ em mulheres GA (p≤0,024; teste de Mann-Whitney U), e uma maior presença de células T CD8 produtoras de IL17 (p=0,0172; teste de Mann-Whitney U), em relação ao observado em mulheres NGA. Depois do puerpério, no compartimento T de mulheres do grupo GA, verificou-se um aumento das populações de células de memória. Em comparação com a gravidez, após o puerpério o compartimento B, apresentou nas mulheres GA um aumento significativo da subpopulação de células B de transição (p<0,0001; teste de Wilcoxon). Verificou-se, igualmente em mulheres GA após o puerpério, uma maior expressão de Foxp3 nas células T reguladoras (p<0,0001; teste de Wilcoxon) e o aumento das populações de células T circulantes produtoras de IFN-γ (p≤0,0234; teste de Wilcoxon). As modulações das populações T e B desde a gravidez até depois do puerpério ocorreram de forma semelhante nas mulheres dos grupos GA e GS. Apesar de as mulheres GA manterem um perfil imunológico próximo do das mulheres GS depois do puerpério, aconteceu também neste período um processo de reaproximação ao perfil observado nas mulheres NGA. As mulheres GA com manifestações de risco para atopia na descendência (comparadas com mulheres GA sem manifestações de risco para atopia na descendência até aos 6 meses de vida) apresentaram uma maior proporção de células T e menor proporção de células B, percentagens mais elevadas de células T CD8 de memória efetoras, de células B de transição e de células B CD24HiCD38Hi, e contagens mais baixas de células B de memória. Na avaliação destes parâmetros como marcadores de risco para o desenvolvimento de atopia verificou-se que o parâmetro com melhor desempenho foi a percentagem de células B de transição, com uma Odds-Ratio de 54,0 [IC 95%: 4,2-692,9; (p=0,0005)], sensibilidade de 90,0% [IC 95%: 55,5 – 99,8] e especificidade de 85,7% [IC 95%: 57,2 – 98,2]. Este estudo foi pioneiro em Portugal, e no mundo, no que se refere ao acompanhamento do compartimento linfocitário B circulante, abordando o seu perfil de maturação, e em particular as células B com funções reguladoras, desde a gravidez até ao fim do puerpério, em mulheres atópicas e não atópicas. A este nível, encontram-se estudos na literatura a documentar a alteração do compartimento B durante a gravidez. O presente trabalho reporta agora que alterações, como a diminuição do número de células B em circulação, são impostas também na mulher atópica. Em suma, demonstrou-se a existência de um perfil imunológico caraterístico em mulheres atópicas, que sofre alterações significativas durante a gravidez, tendendo os parâmetros imunológicos a normalizar após o puerpério. O compartimento T, para o qual a literatura é mais rica em estudos e abordagens, demonstrou também neste trabalho oscilações caraterísticas entre o período pré e pós-natal. Verificaram-se sobretudo variações nos compartimentos de células T de memória, sem grandes alterações ao nível das células Treg no que se refere à sua presença em circulação. Apenas a registar a menor expressão de Foxp3 nas células Treg durante a gestação observada em mulheres atópicas, tal como em mulheres saudáveis (como também já foi relatado em estudos anteriores). Apesar de muitos dos dados se encontrarem em concordância com a literatura, quer no que se refere às subpopulações de células de memória, quer no que se refere às células Treg, também se encontram resultados discordantes, por exemplo documentando variações numéricas nas células Treg em circulação em mulheres atópicas e mulheres atópicas grávidas. A importância de harmonizar protocolos e fenótipos, parece crucial na abordagem de estudos futuros. Ao nível do risco para a atopia na descendência de mulheres atópicas, acrescentou-se ainda a possibilidade de definir marcadores não invasivos para a criança, em particular as células B de transição. Estas células, cuja maior presença em circulação no recém-nascido foi recentemente associada com manifestações alérgicas subsequentes, são agora apontadas já na mulher atópica, grávida do terceiro trimestre, como um elemento de risco para o desenvolvimento de atopia. Os marcadores de risco descritos, para além de facilmente poderem vir a ser englobados no âmbito dos normais rastreios maternos durante a gravidez, apresentam ainda a vantagem da precocidade do diagnóstico, permitindo não só a possibilidade de prevenção pós-natal, mas estendendo esta possibilidade ao período gestacional.----------------------------ABSTRACT: The prevalence of atopic diseases has been increasing, especially in Westernized countries. Several factors have been suggested to justify this increase in prevalence, as the small size of families, the high use of antibiotics, the improvement in sanitation conditions, as well as the reduction of both helminth infections, and orofecal contamination. A few studies have adressed the influence of prenatal environment on the development of atopy and asthma. From literature, it seems undeniable the importance of the prenatal period for the development of the immune system. In this context, the transmission of atopy to the progeny in atopic women, and specifically in women with allergic asthma, can be modulated from this period on. The ability to detect early risk markers for the development of atopic diseases may be the first step in the development of prevention strategies for individuals at risk. This study aimed to approach the maternal immune system in order to enrich its characterization from the third trimester of pregnancy until the end of the puerperium period. In addition to the evaluation of the maternal cellular profiles (in which, mostly, diferente populations of T and B cells with effector and regulatory functions were included) and citokines, the relation between these profiles and the development of atopy in the progeny was also assessed. 135 women were recruited for this study, and fullfiled the inclusion criteria necessary to be included in one of the four groups preset: atopic pregnant women - GA (n = 24), atopic nonpregnant women - NGA (n = 32), healthy pregnant women - GS (n = 44) and healthy nonpregnant women - NGS (n = 35). Populations of leukocytes and lymphocytes, and particularty maturation profiles of T and B lymphocytes, as well as subpopulations of T and B cells with regulatory functions, were characterized by flow cytometry. Functional assays were also performed, to assess the ability of cytokine production by T and B lymphocytes. Serum cytokine concentrations were assessed as well by enzymatic immunoassays. These maternal imune parameters were monitored since the third trimester of pregnancy until the end of the puerperium period (first six weeks after delivery). A clinical evaluation of all the newborn children was performed at the age of six months. Non-atopic pregnant women presented higher cell counts for most leukocyte and lymphocyte populations (compared to healthy non-pregnant women). We should also highlight the increased presence of eosinophils in NGA women (p = 0,0009; Mann-Whitney U test). Again compared to NGS women, NGA women showed increased memory cells within the circulating T and B lymphocyte compartments. Considering the regulatory profiles, NGA women presented higher percentages of regulatory T cells (p≤0,003; Mann-Whitney U test) and IL10 producing T cells after stimulation (p≤0,03; Mann Whitney U), as well as increased expression of Foxp3 (p = 0,0002; Mann-Whitney U test), and also decreased serum levels of IFN-γ (p = 0,0019; test Mann-Whitney U test) compared to NGS women. In general, the changes observed in immune parameters of atopic pregnant women in the third trimester of gestation were similar to those observed in healthy pregnant women. Comparing pregnant and non-pregnant atopic women, an important change in leukocyte subsets was observed, with a significant increase of neutrophils (p <0,0001; Mann-Whitney U test) and the consequent diminution of the remaining leukocyte populations in the GA group. The decrease in total lymphocyte counts was extended to most of the lymphocyte subsets characterized. It was possible to detect a decrease in memory cell subsets within the T and B lymphocyte compartments, also. During pregnancy, a lower expression of Foxp3 was reported in GA women (p <0,0001; Mann-Whitney U test) and, besides, lesser CD24HiCD38Hi B cells were present in circulation in these women, compared to NGA women (p = 0,0012; Mann-Whitney U test). There was still a decrease in the percentages of IFN-γ-producing CD4 T cells in GA women (p≤0,024; Mann-Whitney U test) and a greater presence of IL17-producing CD8 T cells (p = 0,0172; Mann-Whitney U test), compared to the levels observed in NGA women. At the end of the puerperium, there was an increase in memory cell subpopulations within the T cell compartment of GA women. Compared with the pregnancy evaluation, after puerperium, the B cell compartment showed a significant increase in the transitional subpopulation (p<0,0001; Wilcoxon test), in GA women. Moreover, after puerperium, GA women exhibited a greater expression of Foxp3 in Treg cells (p <0,0001; Wilcoxon test) and there was an increase in circulating IFN-γ-producing T cells (p≤0,0234; Test Wilcoxon). The modulations of T and B cell subpopulations from pregnancy until the end of puerperium were similar in women of GA and GS groups. Although at the end of puerperium, GA women still kept an immune profile close the one observed in GS women, at this time point, there were also signs of rapprochement between the immune profiles observed in women of GA and NGA groups. GA women with atopic manifestations in the offspring (compared to GA women without atopic manifestations in the offspring at the age of 6 months) presented higher proportions of T cells and lower proportions of B cells, higher percentages of effector memory CD8 T cells, transitional B cells and CD24HiCD38Hi B cells, and, finally, lower absolute counts of memory B cells. In the evaluation of these parameters as risk markers for the development of atopy, the parameter which presented the best performance was the percentage of transitional B cells, with an Oddsratio of 54,0 [95% CI: 4,2 to 692,9; (p = 0,0005)], sensitivity of 90,0% [95% CI: 55,5 to 99,8] and a specificity of 85,7% [95% CI: 57,2 to 98,2]. This study was a pioneer in Portugal, and in the world, in what concerns the monitoring of the circulating B cell compartment, addressing not only the maturation profile, but, in particular, B cells with regulatory functions, from pregnancy untill after puerperium, in atopic and non-atopic women. Literature presents evidence of a typical change in circulating B cells during pregnancy. This study now reports that changes, such as the decrease in the number of circulating B cells,/ are also imposed by pregnancy in atopic woman. In brief, it demonstrated the existence of a characteristic immune profile in atopic women, which undergoes significant alterations during pregnancy, tending to normalize after the puerperium. As for the T cell compartment, for which the literature is richer in studies and approaches, this study also showed characteristic fluctuations between the pre- and postnatal periods. There were variations mostly in the memory subsets within the T cell compartment, without major changes in regulatory T cells regarding their presence in circulation. Only the expression of Foxp3 in Treg cells presented lower levels during pregnancy, in both atopic and healthy women (as previously reported in other studies). Although much of the data now reported are in agreement with literature, regarding either memory cell subsets or regulatory T cells, there are also conflicting results, for example documenting changes in the numbers of regulatory T cells circulating in atopic pregnant and atopic non-pregnant women. The importance of harmonizing protocols and phenotypes seems crucial for the establishement of future studies. Considering the risk for atopy in the offspring of atopic women, this study added the possibility to define non-invasive markers for the child, in particular transitional B cells. These cells, whose greater presence in circulation in newborns has recently been associated with subsequent allergy development, are here identified in atopic pregnant women in the third trimester of gestation as a risk factor in the development of atopy in their progeny. The risk factors described, besides having the capacity to easily become integrated within the normal maternal screening protocols during pregnancy, also have the advantage of an early diagnosis, allowing not only the possibility of postnatal prevention but extending this possibility to the prenatal period.

Identificação das fontes de contaminação fecal nas águas superficiais do Rio Tejo

As águas são potenciais vias de infeção, pois servem como veículos para disseminação de possíveis microrganismos patogénicos que podem levar a surtos. Por isso é importante manter os ambientes aquáticos livres de microrganismos. Para isso é necessário a constante monitorização desses ambientes. Isto é realizado através da utilização de microrganismos indicadores (FIB), que sugerem o nível de poluição fecal da água. Porém, tem sido demonstrado que os FIB possuem graves falhas na identificação de certos tipos de microrganismos, como por exemplo, os vírus, assim como na identificação da fonte de contaminação fecal. A partir disso surgiu o Microbial Source Tracking (MST), que tem como objetivo principal a identificação específica do hospedeiro ou ambiente causador da contaminação fecal. Neste estudo foram utilizadas uma combinação de diferentes métodos, sendo a maioria destas técnicas moleculares, para fornecer uma nova abordagem prática, viável e integrável a partir da utilização das amostras ambientais retiradas do Rio Tejo. Para isso foram efetuadas colheitas totalizando 73 amostras em quatro pontos diferentes no rio Tejo: VFX, MPN, ALC e Belém. Nestes pontos foram analisados quantitativamente os marcadores bacteriológicos E. coli e EF; os considerados potenciais indicadores de vírus, CS e Bacteriófagos de GB-124 e marcadores moleculares HAdV, mtDNA humano, bovino, suíno e de aves de consumo humano. Foram encontradas positividades para todos os pontos, com 99% para E. coli, 97% para EF, 99% para CS, 1% para Bacteriófagos de GB-124, 40% para HAdV, 90% para mtDNA humano, 92% mtDNA bovino, 58% mtDNA suíno, 37% mtDNA de aves de consumo humano. Estes marcadores foram também correlacionados, e devido à fraca correlação encontrada, os resultados indicam que as informações fornecidas pelos indicadores bacteriológicos e CS são diferentes das informações obtidas pelos indicadores moleculares.