Analysis of the intestinal bacterial microbiota in maize- or sorghum-fed broiler chickens using real-time PCR

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Metodologia microbiológica convencional e reação em cadeia pela polimerase (PCR) na detecção de Salmonellasp. a partir de caldos de enriquecimento – Tetrathionato e Rappaport-Vassiliadis

The progressive increase in consumption and production of poultry meat in later years comes forth with an increase of the occurrence of foodborne diseases, including salmonellosis. Salmonellosis is caused by the ingestion of contaminated products, mainly by the consumption of poultry meat which processing and preparation for consumption were not effective to eliminate pathogens. Thus, there is a need for the development of faster more sensitive methods of detection of pathogens as a way to ensure the quality of the food offered to consumers. The goal of this essay was to evaluate the effect of enrichment broths on naturally contaminated poultry meat samples. A total of 65 samples was collected, these samples were rinsed with 370 mL of buffered peptone water (BPS) 1% according with the traditional methodology. All of the samples were enriched with both Tetrathionate (TT) and Rappaport-Vassiliadis (RV) and all were analyzed by the convencional identification method and polimerasis chain reaction (PCR). Of the 65 analized samples, 34 (52%) were positive when analized by the conventional method, while 45 (69%) were positive when analized by the PCR. Amongst the 45 positive PCR samples, 44 samples were positive when enriched with TT, while just 32 samples were positive when enriched by RV. Of the 34 positive conventional samples, 29 samples were positive when enriched by TT and 31 were positive when enriched by RV

Diversidade gênica no gênero Astyanax (Teleostei : Characidae) através da análise de PCR-RFLP de DNA mitocondrial

O gênero Astyanax é um dos mais abundantes e diversificados da família Characidae (subfamília Tetragonopterinae), com mais de 100 espécies nominais, estando amplamente distribuído na bacia do Alto rio Paraná. Esse gênero é caracterizado pela similaridade quanto à forma do corpo, além da alta variabilidade citogenética intra e interpopulações, sendo comum a ocorrência de espécies crípticas ou complexos de espécies. Devido à escassez de dados sobre genética molecular referentes a esse gênero, e a dificuldade na identificação taxonômica, fazse necessário um estudo utilizando marcadores moleculares que visem desenvolver métodos rápidos e eficientes para caracterização de espécies de Astyanax com base em análises de DNA. Em vista dessa necessidade, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência da técnica de PCR-RFLP do gene mitocondrial Citocromo b na identificação e caracterização da variabilidade genética de cinco espécies do gênero Astyanax que ocorrem na bacia do Alto rio Paraná. O mtDNA das espécies alvo foi totalmente amplificado, num total de cerca de 1140 pares de bases (pb). As análises foram obtidas através dos haplótipos gerados com a digestão por três enzimas de restrição que clivam estes genes, sendo estas ALUI, BAMHI, e HPAII. Foram analisadas 2 populações de Astyanax paranae, A. altiparanae, A. fasciatus, A. bockmanni, e uma população de A. biotae, com amostragens variando entre 5 e 10 indivíduos de cada população. Como grupo externo foram analisadas duas populações de Astyanax ribeirae da bacia hidrográfica do rio Ribeira de Iguape. Ao final do trabalho foi possível a identificação de 4 das 6 espécies analisadas, sendo que as espécies mais divergentes são A. altiparanae e A. ribeirae, as espécies A. paranae + A. bockmanni e A. fasciatus + A. ribeirae são as mais fortemente relacionadas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Freqüência do parvovírus suíno em fetos mumificados, abortados e natimortos detectado através da reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Porcine parvovirus (PPV) is associated with reproductive failure and it has been found worldwide, including Brazil. Many diagnostic procedures are used for its detection, for example, immunofluorescence, HA, HI and PCR and this is an important technique because it is very specific and sensitive. In this work, the presence of PPV in fetuses from swine farms with reproductive problems was detected by PCR. All of 170 samples from aborted fetuses, mummies or stillborns were sampled by PCR with primers designed to VP2 region of PPV and c-myc (endogenous control). Only 142 samples (83,53%) were positive for c-myc and among them six samples (4,22%) were positive for PPV which were tested in HA. In this test, erythrocytes suspension 1% was used and three samples (50%) agglutinated but they presented low titer (4). For this work, porcine parvovirus was detected in the samples analyzed by PCR and HA. It is important to emphasize the use of endogenous control when material with elevated degree of autolysis is examined

Perfil sanitário e pesquisa de Salmonella em frangos e lingüiças pela metodologia tradicional e pela PCR

Novos hábitos alimentares da população e as mudanças nos sistemas de produção e distribuição dos alimentos podem estar fortemente relacionados aos casos de doenças transmitidas pelo consumo de alimentos contaminados por microorganismos. Isso faz com que a preocupação com a qualidade microbiológica dos alimentos aumente mundialmente. Dentre os principais patógenos, destaca-se a Salmonella sp, que pertence à microbiota gatrentestinal de animais silvestres e de animais domésticos criados para o consumo humano (aves, bovinos e suínos). Este fato torna o problema de grande relevância para as autoridades de saúde pública, pois esses microrganismos podem estar associados às infecções ou surtos provocados pela ingestão de alimentos contaminados. Foram coletadas 35 amostras de lingüiças e 25 cortes de frango, nos principais supermercados do município de Botucatu-SP e avaliados quanto à qualidade higiênico-sanitária através da determinação do número mais provável de coliformes termotolerantes (CT), além da presença de Salmonella sp. Os resultados obtidos mostram que 31% das lingüiças e 84% das amostras de frango estavam fora dos padrões higiênico-sanitários estabelecido pela ANVISA (RDC n° 12), que determina uma quantidade máxima de 5x103 CT/g em lingüiça e 104 /g em carne de aves. Em relação à Salmonella sp, estabeleceu-se a ausência dessa bactéria em 25g de lingüiça e não determina nenhum parâmetro para o frango. Entre as 25 amostras de frango analisadas, duas (8%) foram positivas pela metodologia tradicional. Esse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Comparação da sensibilidade da técnica parasitológica (OPG) e da PCR para o diagnóstico de Strongyloides venezuelensis em fezes de ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Lewis infectados experimentalmente

Espécies do gênero Strongyloides são importantes parasitas de humanos e animais domésticos e aquelas que parasitam roedores são freqüentemente utilizadas como modelos experimentais para o estudo da estrongiloidíase. S. venezuelensis parasita ratos (Rattus norvegicus) e seu estudo tem permitido o entendimento de mecanismos imunológicos envolvidos na relação parasita–hospedeiro da estrongiloidíase humana e animal. O diagnóstico parasitológico de S. venezuelensis pode ser realizado pela detecção de ovos embrionados nas fezes, com o uso do OPG (ovos por grama de fezes), também empregado no monitoramento da infecção. Entretanto, essa técnica se mostra pouco sensível quando a carga parasitária é leve. Os métodos moleculares aumentam a sensibilidade e a especificidade das análises. A PCR tem se mostrado como uma técnica sensível e precisa na detecção de parasitas em tecidos e fezes de hospedeiros infectados. A fim de comparar a sensibilidade das técnicas de OPG e PCR em ratos Lewis infectados por S. venezuelensis, foram realizados dois protocolos no presente estudo. No Protocolo I foi comparada a sensibilidade das duas técnicas em amostras de ratos Lewis com diferentes cargas parasitárias. A PCR com o emprego par de primers descrito por Dorris et al. (2002) obteve melhores resultados que o OPG nos grupos inoculados com 40 L3, considerada como infecção leve. Entretanto, não foi verificada diferença estatística significativa entre as técnicas (P>0,05), provavelmente por terem sido utilizados poucos animais (n=10). O outro par de primers utilizado foi desenhado a partir de uma seqüência parcial do gene do rDNA de S. venezuelensis e não foi capaz de detectar a presença do DNA do helminto em nenhuma amostra desse grupo. Já nos grupos inoculados com 400 e 4000 L3, tanto a PCR com...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Metodologia Microbiológica Convencional e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) na detecção de Salmonella spp em carcaças de frango

Salmonella is the etiological agent responsible for one of the most important Food Borne Disease (FBD), Salmonellosis, which generates significant economic consequences in several countries, including Brazil. Poultry meat is one of the most important disseminators of the pathogen. Accordingly, several countries have developed programs trying to reduce the prevalence of Salmonella in poultry meat. Such programs are based on the research of the pathogen in the carcasses, establishing a maximum limit of positive samples at each set of analysis. The Salmonella scans are usually made using the conventional microbiological methods, which tend to be expensive and time consuming. In recent years were developed rapid methods such as polymerase chain reaction (PCR), which can greatly shorten the results time, showing greater sensitivity and specificity than conventional methodology

Variabilidade e diversidade genética de populações de Ocotea notata (Nees & Mart.) Mez (Lauraceae)

O presente trabalho analisou os parâmetros genéticos populacionais de variabilidade e diversidade genética de diferentes populações de Ocotea notata (Nees & Mart.) Mez, através de marcadores de DNA do tipo ISSR (Inter Single Sequence Repeats). Para tanto, foram amostrados 243 indivíduos de 12 populações selecionadas na Bahia e Espírito Santo, que ocorrem em campos rupestres e vegetações de restinga, a saber, morfotipos de Ocotea glaucina (Meisn.) Mez: Morro do Chapéu: populações do Tabuleiro dos Guaribas, Ferro Doido, Cria Bode e Lajes; Umburanas; Jacobina; Lençóis: população da Serra das Paridas, e os morfotipos de O. notata, Esplanada: população de Baixios; Salvador: população das Dunas do Abaeté, Alcobaça, Mucuri, e Vila Velha, ES: população de Jacarenema. O DNA total já se encontrava extraído e quantificado em gel de agarose. Foram testados 20 primers de ISSR (University of British Columbia), dos quais quatro apresentaram resultados adequados para as análises, a saber: Manny, Mao, John e UBC 844. A otimização dos protocolos de reações de PCR foi feita no Laboratório de Evolução Molecular, da UNESP de Rio Claro, com a execução das reações de PCR para cada um dos primers, para cada população, e subsequentemente foram feitas as análises dos resultados sob o arcabouço teóricometodológico da genética de populações. A Análise de Variância Molecular (AMOVA) indicou que 23% da variabilidade ocorre entre populações dentro de regiões e 76% entre indivíduos dentro de populações, com variação significativa de 1% ocorrendo entre regiões (populações de Restinga vs. Campos Rupestres)

Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Padronização da técnica de PCR em tempo-real na avaliação da pluripotência de células-tronco mesequimais caninas

Este relatório final tem como objetivo apresentar as atividades desenvolvidas no período de janeiro/2009 a março/2010, pela aluna Thaila Isabel Wodewotzky, relativas ao projeto de conclusão de curso intitulado “Padronização da Técnica de PCR em tempo-real na Avaliação da Pluripotência de Células-tronco Mesenquimais Caninas”, para fins de obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. O referido projeto objetiva avaliar a quantificação e relevância dos níveis de expressão gênica do fator de transcrição Oct4 em CTM´s, por meio da padronização da técnica de PCR em tempo-real. Para tanto, o RNA total das CTM´s obtidas, isoladas e cultivadas a partir da medula óssea de cães foi extraído a partir da medula óssea de cães a fim de avaliar a quantificação e relevância dos níveis de expressão gênica do Oct4 por meio da utilização da técnica de PCR em tempo-real com transcrição reversa (RT-qPCR). O RNA total foi extraído e submetido à reação de transcriptase reversa, para a obtenção do cDNA. Posteriormente esse cDNA foi utilizado na padronização da técnica de qPCR utilizando primers desenhados a partir de sequências obtidas no genebank. . Como normalizador utilizou-se o RNA codificante de GAPDH.Verificou-se desempenho satisfatório dos primers para Otc4 na avaliação de CTM´s de cães. Também o RNAm do GAPDH foi adequado como normalizador. Dessa forma, esse sistema pode ser utilizado na realização de testes quantitativos utilizando amostras de células-tronco embrionárias caninas

Caracterização molecular de Colletotrichum acutatum e C. gloeosporioides associados a citros, por marcadores ISSR

Pós-graduação em Agronomia (Produção Vegetal) - FCAV

Patógenos periodontais: comparação entre cultura bacteriana e PCR em tempo real para teste diagnóstico

The correct distinguishment of microorganisms involved in the periodontal disease pathogen, it is important in the understanding of its progression and adequate treatment planning. Considering this fact, some molecular methods of identification and quantification were developed and are extremely sensitive and precise in the characterization of different bacteria species. The present study aimed to realize a literature review, including studies that realized a comparative analysis between bacterial culture and real time PCR methods in the identification of pathogens. The bacterial culture method can possibly identify new microorganisms and realize antibiotics sensitivity tests. The real time PCR is a microbiologic test that identifies and quantifies bacterial species, through gene amplification of predetermined DNA fragments, with high sensitivity and specificity, and need a shorter operation time of the operator when compared to the bacterial culture method. In this way, to determine a specific diagnostic test, should be considered not only its precision in the identification of microorganisms, but the cost-benefit relationship as well.

DDRT-PCR approaches applied for preeminent results in the isolation of DETs from fish brain tissues

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização das espécies de leishmania em sangue periférico de cães por PCR-RFLP NA área endêmica de Bauru/SP

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Detecção do herpes vírus felino tipo 1 (HVF-1) pela técnica de PCR em tempo real e sua associação com sinais oculares em uma poipulação de gatos domésticos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)