Diversidade patogênica e molecular de Ralstonia solanacearum da região amazônica brasileira

Foi avaliada a diversidade de isolados de Ralstonia solanacearum obtidos de tomateiro e de outras hospedeiras com sintomas de murcha bacteriana na região amazônica. Os isolados foram identificados quanto à biovar e separados em graus de virulência em plantas de tomate, pimentão e chicória da Amazônia (Eryngium foetidum). Dos 70 isolados, 53 pertenciam à biovar 1, quatro à biovar N2 e 13 à biovar 3, confirmando a predominância da biovar 1 em tomateiro no Estado do Amazonas. O agrupamento dos isolados mostrou três classes distintas de virulência em tomate, sendo 44,3% dos isolados altamente virulentos, 37,1% medianamente virulentos e 18,6% fracamente virulentos. O agrupamento em pimentão classificou 20% de isolados como altamente virulentos, 27,1% como medianamente virulentos e 52,9% como fracamente virulentos. Quando inoculados em chicória da Amazônia, somente o isolado de chicória provocou murcha nesta hospedeira, sugerindo uma especificidade pouco comum para R. solanacearum. Na caracterização molecular, 46 isolados de tomateiro e 18 de outras 10 hospedeiras, coletados em áreas de terra-firme e de várzea, foram comparados por BOX-PCR. Os perfis genômicos revelaram alto grau de polimorfismo entre os isolados, divididos em cinco grupos, sem correlação entre hospedeira de origem, biovar, ecossistema ou local de coleta. O isolado de chicória da Amazônia foi o mais divergente, com apenas 6,4% de similaridade em relação aos demais. Os isolados de tomateiro estavam representados em três grupos. Os quatro isolados de tomateiro da biovar N2 formaram um agrupamento distinto dos isolados das demais biovares presentes na Amazônia.

Gramíneas hospedeiras de Xanthomonas sp., agente causal da falsa estria vermelha da cana-de-açúcar

Falsa estria vermelha (FEV), uma nova doença causada por Xanthomonas sp., é diferente diferente de todas as outras doenças já descritas em cana-de-açúcar. Ela está distribuída por toda as principais regiões canavieiras do centro-sul do Brasil, mas ainda não foi detectada no norte e nordeste do Brasil nem em qualquer outro país. O presente estudo determinou a gama de culturas e plantas daninhas hospedeiras da bactéria dentre espécies pertencentes às gramíneas, através de inoculação por injeção e pulverização de suspensão bacteriana. Além da cana-de-açúcar, entre as 31 diferentes espécies estudadas, apenas sorgo, milho e aveia apresentaram sintomas, 15 dias após a inoculação. Em sorgo, no ponto de inoculação, apareceram estrias avermelhadas coalescentes. As folhas apresentaram típicas estrias vermelhas finas (1 mm), longas e paralelas às nervuras, com presença de exsudato bacteriano. Até mesmo as inflorescências apresentaram pontuações avermelhadas. Plantas de milho inoculadas com seringa apresentaram sintomas de anasarca e descoloração de tecidos ao redor do ponto de inoculação e estrias cloróticas (2-3 mm) no limbo foliar; porém, sem exsudato de bactéria. Apenas folhas de cevada apresentaram sintomas quando inoculadas por pulverização. As lesões iniciais eram estrias e manchas de cor palha, evoluindo para uma necrose total das folhas, causando a morte das plantas. A partir de folhas sintomáticas de cana-de-açúcar, sorgo, milho e aveia, realizaram-se re-isolamentos, obtendo-se culturas puras de Xanthomonas sp. cuja identidade foi comprovada através de testes sorológicos e por Rep-PCR. Diante desses resultados, surge a necessidade de realização de inspeções e campos de cultivo de sorgo, milho e aveia para verificar a presença da bactéria da FEV e determinar se o patógeno pode infectar essas culturas naturalmente.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Tumorogênese em plantas causadas por espécies de Agrobacterium

Tumores - sintomas hiperplásicos em plantas - incitados por espécies de Agrobacterium sp. sempre exerceram fascínio sobre fitopatologistas desde o início do Século XX, quando Erwin Smith e colaboradores demonstraram serem eles de etiologia bacteriana. No início, imaginava-se que os tumores eram decorrentes de alterações hormonais na planta provocadas pela bactéria. Contudo, até recentemente, a microbiologia e a biologia molecular não eram suficientemente avançadas para que os cientistas pudessem compreender e deduzir a forma através da qual o patógeno incitava os tumores. Demorou quase um século para que se deslindassem os complexos mecanismos bioquímicos, genéticos e fi­siológicos através dos quais o patógeno transforma a planta, inserindo no genoma desta uma região de seu megaplasmídeo de modo a criar para si mesmo um nicho ecológico espe­cífico. Neste trabalho é apresentada uma súmula histórica da evolução do conhecimento a respeito, das características genômicas do plasmídeo Ti, dos eventos e requerimentos ati­nentes ao processo infectivo bem como é discutida a dinâmica da transformação da planta pelo patógeno.

Podridão-mole em pós-colheita de batata (Solanum tuberosum) incitada por Pseudomonas viridiflava

Isolou-se uma bactéria incitadora de podridão-mole em batata e procurou-se identificá-la em nível de espécie. Testes biológicos, bioquímicos e tintoriais permitiram posicionar o microrganismo em questão com pertencente à espécie Pseudomonas viridiflava. Procurou-se também investigar a suscetibilidade de diferentes órgãos de reserva de distintas espécies botânicas à espécie bacteriana. Este trabalho mostra e confirma que outras espécies que não as de Pectobacterium spp. são capazes de incitar podridões-moles em órgãos de reserva.

Reação de híbridos de brócolis 'tipo cabeça única' à podridão negra

Conduziu-se simultaneamente dois experimentos, em casa de vegetação, com o objetivo de avaliar a resistência de híbridos de brócolis 'tipo cabeça única' (AF 649, Titleist, Centenário, Green Power, BR068, Magestic Crown, Marathon, Laguna, Legacy, Green Parasol, Packman e Mônaco) à podridão negra, causada por Xanthomonas campestris pv. campestris. Foram utilizados os métodos de inoculação no ápice das folhas por cortes com tesoura embebida na suspensão bacteriana e por ferimento provocado no caule com palito de dente umedecido na suspensão bacteriana. A inoculação foi realizada aos 25 dias após transplante (6 a 8 folhas definitivas). Avaliou-se no experimento de inoculação com tesoura, as áreas abaixo da curva de progresso da doença nas folhas inoculadas. No experimento de inoculação por palito de dente, avaliou-se a proporção de altura necrosada do caule, aos 26 dias após inoculação. Verificou-se que, em ambos os experimentos, o híbrido BRO68 apresentou-se mais suscetível à podridão negra e os híbridos Marathon, Legacy e Green Power foram os que apresentaram os maiores níveis de resistência à podridão negra.

Indução de resistência em plantas de berinjela por Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum: aspectos bioquímicos e biomassa vegetal

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é considerada uma doença de importância para a cultura da berinjela, sendo de difícil controle. O controle de doenças através de indução de resistência é um método que vêm se revelando como promissor. Basidiomas de Agaricus blazei e Lentinula edodes possuem substâncias do tipo antibiótico e outras substâncias capazes de atuarem como elicitoras da resposta de resistência em plantas, mostrando-se assim promissores no controle alternativo de fitopatógenos. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de estudar o efeito de extratos aquosos dos fungos e do indutor químico acibenzolar-S-metil (aSm) sobre o crescimento da bactéria in vitro e o controle da murcha bacteriana, bem como investigar seu efeito sobre a atividade de determinadas enzimas da planta. O efeito inibitório sobre o patógeno foi avaliado usando diferentes concentrações dos extratos aquosos. A indução de resistência foi estudada em plantas tratadas com o indutor biológico e químico, medindo-se a intensidade de murcha e determinando-se as alterações de algumas enzimas. Os resultados revelaram que os isolados de A. blazei e L. edodes, utilizados em diversas diluições, não exerceram efeito inibitório in vitro. Em relação à indução de resistência, extratos dos isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei (15%, v/v) e o aSm (0,05 g/L) promoveram redução significativa na ocorrência de folhas murchas, quando aplicados dois dias antes da inoculação. O aumento na atividade de peroxidase foi verificado em plantas tratadas com extratos de Abl-11, Abl-28 e com suspensão de aSm. A atividade de quitinase, fenilalanina amônia-liase e polifenoloxidase não foi alterada nas plantas tratadas com extrato de Abl-28 e com o aSm. No entanto, plantas de berinjela tratadas com Abl-11 exibiram uma aumento na atividade de fenilalaniana amônia-liase e de polifenoloxidase, enquanto que a atividade de quitinase não foi alterada. Com base nos resultados, ficou evidenciado que o aSm e os isolados Abl-11 e Abl-28 de A. blazei apresentam potencial para induzir resistência em berinjela contra R. solanacearum.

Método rápido de extração de DNA de bactérias

Desenvolveu-se um método rápido para extração de DNA de bactérias, que ao contrário de outros métodos, não requer o uso de enzimas, como lisozima e proteinase K, previamente, utilizado-se o carbonato de silício (carborundum) como agente físico para efetuar a quebrar da parede celular da bactéria. Com este método conseguiu-se extrair DNA bacteriano num menor tempo, além de mais rápido, ele mostrou-se mais simples e econômico, quando comparado aos métodos convencionais. O DNA obtido pode ser utilizado para diversas finalidades relacionadas ao DNA de bactérias, obtendo-se uma quantidade razoável de DNA, que varia de 725 µg/mL a 1170 µg/mL por cada 0,1 g de célula bacteriana, com ótima qualidade.

Variabilidade genética de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae

A mancha bacteriana, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é uma das mais importantes doenças do maracujazeiro, podendo limitar a produção dessa frutífera em algumas regiões do País. O uso de resistência genética e controle químico, juntamente com o emprego de medidas de exclusão, são as práticas de controle da doença mais recomendadas. Para o desenvolvimento de variedades resistentes é necessário conhecer tanto a variabilidade genética do hospedeiro quanto do patógeno. Nesse trabalho foi estudada a variabilidade de cinqüenta isolados patogênicos de Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, coletados em quatro diferentes locais no estado de São Paulo. No estudo da variabilidade genética foram usados dados de marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), os quais foram usados para o cálculo do coeficiente de similaridade de Dice entre os isolados, análise de variância molecular (AMOVA) entre e dentro das populações e agrupamento dos isolados pelo método UPGMA. Para análise da agressividade foram usados cinco isolados, mais divergentes, baseado no dendrograma. O coeficiente de similaridade variou entre 0,6887 e 0,9688. Na análise de agrupamento, os isolados foram separados em sete grupos e não houve relação evidente entre local de coleta com a composição dos grupos. Na análise da variância molecular (AMOVA) verificou-se que a maior parte da variabilidade genética está dentro das populações (89,4%) e apenas 10,6%, entre populações. Os resultados da análise de agrupamento e da AMOVA indicam que existe grande fluxo gênico entre isolados bacterianos nas regiões analisadas. No teste de patogenicidade verificou-se diferença significativa de agressividade entre os isolados. Os resultados demonstram a importância do conhecimento da variabilidade genética e da agressividade na seleção dos isolados para serem utilizados em testes de resistência genética no desenvolvimento de variedades resistentes.

Gama de hospedeiros e reação de genótipos de tomateiro a Pseudomonas cichorii

Em 2005, foi constatada em dois campos comerciais de tomate no Estado de São Paulo, a ocorrência da queima bacteriana, causada por Pseudomonas cichorii. Em vista disso, foram desenvolvidos estudos visando a determinação da gama de hospedeiros de isolados de Pseudomonas cichorii (IBSBF 2309 e IBSBF 2323), obtidos de tomateiro, provenientes de campos comerciais localizados nos municípios de Bragança Paulista e Mogi Guaçú, SP. Plantas de abobrinha, alface, beldroega, berinjela, beterraba, cenoura, couvebrócolo, datura, fumo, girassol, jiló, melão, pepino, petúnia, pimentão, rabanete, repolho, rúcula, salsa e tomateiro foram inoculadas por pulverização, separadamente, com os dois isolados de P. cichorii de tomateiro e um isolado de girassol (GIR-1). Os isolados IBSBF 2309 e IBSBF 2323 foram patogênicos à beldroega, datura, girassol, pimentão e tomate; GIR-1 foi patogênico apenas à beldroega, datura e girassol, não sendo patogênico ao pimentão e ao tomateiro. No Brasil não se conhecem fontes de resistência dentro do gênero Lycopersicon ou a reação de cultivares de tomateiros a esta bactéria. Vinte e oito genótipos de tomateiro provenientes do Banco de Germoplasma da empresa Sakata Seed Sudamerica Ltda., foram avaliados quanto a reação aos isolados IBSBF 2309 e IBSBF 2323 de P. cichorii, pelo método de inoculação nas folhas. Os maiores níveis de resistência foram observados em AF 11768, AF 2521, AF 11766, AF 11772, AF 229, AF 5719-1 e AF 8162. O genótipo AF 5719-1, que possui o gene Pto, que confere resistência a P. syringae pv. tomato, apresentou um bom nível de resistência a P. cichorii. A identificação de genótipos que apresentem bons níveis de resistência a este patógeno é importante para utilização em programas de melhoramento genético do tomateiro, visando a incorporação de genes de resistência a P. cichorii.

Ocorrência de Doenças em Bananeiras no Estado de Alagoas

O cultivo da banana é uma importante fonte de renda para pequenos e médios produtores no estado de Alagoas. A maioria dos plantios está localizado em região de mata e próximo a costa, com condição apropriada para a ocorrência e desenvolvimento de doenças. Este trabalho teve como objetivo fazer o levantamento das doenças da bananeira que ocorrem em áreas de plantio localizadas no estado de Alagoas. O trabalho foi conduzido durante os anos de 2006 e 2007, por meio de visitas às propriedades e coleta de materiais de plantas infectadas em 60 áreas produtoras de banana, em quatorze municípios do estado de Alagoas. As amostras coletadas foram analisadas em laboratório para identificação dos patógenos associados com as doenças. Neste levantamento muitas doenças causadas por fungos e nematóides foram observadas, tais como: sigatoca amarela (Pseudocercospora musae) (Zimm.) Deighton; mancha de Deightoniella (Deightoniella torulosa) (Syd.) Ellis e mancha de Cordana (Cordana musae Zimm), que ocorreram em todas as áreas analisadas; mancha de Chloridium (Chloridium musae Stahel), ocorrendo somente em áreas úmidas e associada a outras manchas foliares; mancha de Exosporella, que foi observada somente em Santana do Mundaú; fitonematoses causadas por Rhadophulus similis, Helicotylenchus multicinctus e Pratylenchus sp., detectados apenas em alguns municípios; mal-do-panamá (Fusarium oxysporum f.sp. cubense) encontrado somente em quatro áreas no Sul do Estado e Murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum) (Smith) Yabuuchi et al. (raça 2), encontrada em três áreas. Apesar de mal-do-panamá e moko (Ralstonia solanacearum raça 2) terem sido encontradas em baixa incidência, estas doenças ainda são consideradas como principais problemas em plantações de bananeiras no estado de Alagoas.

Detecção de Pseudomonas viridiflava em sementes importadas de couve chinesa (Brassica rapa var. pekinensis)

A ocorrência de Pseudomonas viridiflava é descrita em sementes de couve chinesa (Brassica rapa var. pekinensis) importadas do Japão. Do ponto de vista epidemiológico, a detecção dessa bactéria é de extrema importância. Embora já existam, em nosso país, relatos desse patógeno nas culturas de alface, alho, cebola, cenoura, feijão e mandioca, sua presença em sementes de couve chinesa pode se constituir num risco potencial para outras espécies de brássicas aqui cultivadas.

Especificidade de hospedeiro nas interações Xanthomonas campestris pv. campestris - brássicas

Face às escassas informações acerca da variabilidade patogênica de isolados brasileiros de Xanthomonas campestris pv. campestris, realizou-se um estudo para avaliar a especificidade patogênica de trinta e três isolados do patógeno, provenientes de várias regiões do Brasil e do exterior, a oito espécies de brássicas, através de inoculação por meio de injeção da suspensão bacteriana nas folhas. Desse total, 12 isolados foram obtidos de couve-comum (Brassica oleracea var. acephala), nove de repolho (B. oleracea var. capitata), cinco de couve-flor (B. oleracea var. botrytis), dois de canola (B. napus), um de brócolos (B. oleracea var. italica), um de couve-chinesa (B. chinensis), um de couve-rábano (B. oleracea var. gongylodes) e dois de rabanete (Raphanus sativus). A avaliação da patogenicidade dos isolados da bactéria, frente aos hospedeiros em estudo, demonstrou que 14 deles não apresentaram especificidade, originando sintomas em todas as diferentes plantas inoculadas. Os 19 isolados restantes, entretanto, apresentaram relativo grau de especificidade, não causando doença em uma ou mais das plantas inoculadas.

Substratos alternativos e tratamentos pré-germinativos na germinação in vitro de sementes de Pinus taeda L.

Os objetivos deste trabalho foram desenvolver protocolos para a obtenção de plântulas in vitro de P. taeda, avaliar o uso de substratos alternativos e analisar o efeito de tratamentos pré-germinativos na otimização da germinação. Foram testados tratamentos de desinfestação à base de etanol e hipoclorito de sódio (NaOCl), a influência do fotoperíodo, de tratamentos pré-germinativos e a possibilidade de uso de substratos alternativos (amido de milho, papel-filtro, algodão hidrófilo, vermicultita, ágar-água e adição de carvão ativado ao meio nutritivo) na germinação. Foram avaliadas a germinação in vitro e a contaminação fúngica e bacteriana. O melhor tratamento para a desinfestação das sementes foi etanol 70% por 30 s, seguido de imersão em hipoclorito de sódio a 3% por 5 min, no entanto apresentou efeito tóxico. Os substratos alternativos conferem condições físicas adequadas à cultura de tecidos, mas não favorecem a germinação. Contudo, o uso de algodão hidrófilo associado à embebição das sementes por 72 h, na ausência de desinfestação, otimiza a germinação e possibilita a obtenção de plântulas in vitro com baixa contaminação.

Trocas gasosas influenciam na morfogênese in vitro de duas cultivares de oliveira (Olea europaea L.)

Os objetivos deste trabalho foram estabelecer in vitro as cultivares de oliveira 'Arbequina' e 'Maria da Fé' e avaliar a influência das tampas com membranas permeáveis a gases na morfogênese in vitro dessas cultivares. Inocularam-se segmentos nodais com gemas previamente descontaminadas pelo protocolo aqui desenvolvido. Utilizaram-se o delineamento inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial 2³, duas cultivares; dois meios de cultura OM (Olive medium) (OM + 20 µM de zeatina [1]; e OM + 20 µM de zeatina + 10 µM de GA3 [2]); dois tipos de vedação (tampa rígida sem orifício e com membrana porosa) com cinco repetições/ tratamento; e a unidade experimental constituída por quatro tubos de ensaio. Avaliaram-se: a porcentagem de contaminação total; a porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana; o número de gemas intumescidas; o número de brotos; e a porcentagem de oxidação. Aos 30 dias de cultivo, constatou-se a contaminação de 15% e 8,8% dos explantes de 'Arbequina' e 'Maria da Fé', respectivamente. Em 'Arbequina', 33,3% e 66,7% ocorreram por contaminação fúngica e bacteriana, respectivamente. Em 'Maria da Fé', 28,6% e 71,4% decorreram de contaminação fúngica e bacteriana, respectivamente. O número de gemas foi superior (p<0,05) em 'Arbequina', comparativamente à 'Maria da Fé', quando se utilizou tampa com membrana porosa para vedar os frascos. Em tampa rígida não houve diferença entre cultivares. O número de brotos no meio 1 foi superior estatisticamente (p<0,05) ao no meio 2. Não houve diferença estatística em porcentagem de oxidação. Sugere-se a utilização do protocolo de desinfestação aqui desenvolvido, como também do meio 1 e tampas com membranas porosas, pois isso favorecerá o desenvolvimento das gemas e a posterior formação de plantas.