Análise do polímero PHA em Saccharomyces cerevisiae recombinante : superexpressão de phaG, e a contribuição in vivo das enzimas auxiliares envolvidas na beta-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos

Os polímeros do tipo poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres bacterianos que apresentam as propriedades de termoplásticos e elastômeros biodegradáveis. A síntese deste polímero em plantas de interesse agroindustrial tem sido vista como uma área promissora dentro da biotecnologia de polímeros para a produção em grande escala com baixos custos. Contudo, esta tarefa requer o aprimoramento de diferentes metodologias bioquímicas e moleculares, além de maximizar os processos de extração destes polímeros biológicos. A produção de PHAs em peroxissomos ou no citoplasma de Saccharomyces cerevisiae, por meio da expressão de uma PHA-sintase bacteriana, pode servir como indicador e modulador do fluxo de carbonos que percorre vias biossintéticas como a síntese de novo de ácidos graxos e a β-oxidação. Esta levedura tem sido usada como eucarioto modelo para manipular as rotas envolvidas na síntese de PHAs do tipo MCL (PHA com um número médio de carbonos), um polímero menos cristalino e com menor ponto de fusão quando comparado ao PHA-SCL (PHA com um número pequeno de carbonos). A enzima PhaG (3-hidroxidecanoil-ACP-CoA transacilase) é responsável pela conexão entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em bactérias do gênero Pseudomonas, em meios de cultura contendo uma fonte de carbono nãorelacionada como gliconato, etanol ou acetato. Para tentar estabelecer esta rota metabólica em S. cerevisiae, o presente trabalho avaliou a coexpressão de PhaGPa e PhaC1Pa (PHA-sintase) de P. aeruginosa para a síntese de PHA-MCL a partir de uma fonte de carbono não-relacionada em leveduras. Contudo, a presença de PhaGPa não alterou a composição ou a quantidade de PHA-MCL em relação à cepa controle contendo apenas PhaC1Pa citoplasmática ou direcionada ao peroxissomo, independentemente da fonte de carbono utilizada (rafinose ou ácido oléico). Este resultado permite sugerir que a ligação entre a síntese de ácidos graxos e a produção de PHA-MCL em S. cerevisiae não foi estabelecida, provavelmente devido à ausência de algum passo enzimático que limita o desvio de substratos da síntese de ácidos graxos para a produção de PHA-MCL em organismos que não são capazes de acumular naturalmente este polímero quando cultivados em fontes de carbono não-relacionadas.A levedura S. cerevisiae tem sido usada como um sistema modelo para estudar a β-oxidação de ácidos graxos insaturados em peroxissomos. A produção de PHA-MCL pela expressão de PhaC1Pa em peroxissomos de cepas selvagens e mutantes nulos de S. cerevisiae para as enzimas auxiliares da β-oxidação (Eci1p, Sps19p e Dci1p), multiplicadas em meio de cultivo contendo um ácido graxo insaturado como fonte de carbono, permitiu monitorar o fluxo de carbonos que percorre as vias dependente de isomerase, redutase e di-isomerase. Desta forma, o presente estudo permitiu avaliar a β- oxidação in vivo dos ácidos graxos linoléico conjugado, 9-cis,11-trans-CLA (ácido rumênico) ou 10-cis,13-cis-nonadecadienóico, para determinar a contribuição das vias alternativas na degradação destes substratos pela utilização de cepas selvagens, mutantes nulos e linhagens contendo um plasmídio multicópia para os genes ECI1 (Δ3- Δ2-enoil-CoA isomerase), SPS19 (2,4-dienoil-CoA redutase) e DCI1 (Δ3,5-Δ2,4-dienoil- CoA isomerase). As linhagens selvagens foram capazes de sintetizar PHA-MCL quando cultivadas em ácido rumênico, mas a atividade da enzima Eci1p foi essencial para a degradação deste CLA, indicando que a via dependente de isomerase é a única rota in vivo necessária para a β-oxidação do ácido rumênico em peroxissomos de S. cerevisiae. A contribuição da enzima di-isomerase (Dci1p) para a degradação do ácido 10- cis,13-cis-nonadecadienóico foi avaliada em cepas selvagens, mutantes nulos dci1Δ e linhagens de S. cerevisiae contendo os plasmídeos multicópia. De acordo com o conteúdo e a quantidade de PHA formado, a β-oxidação de ácidos graxos cisinsaturados em um carbono ímpar é, in vivo, independente da di-isomerase. Embora este resultado possa indicar o mesmo padrão de envolvimento de Dci1p na degradação de ácidos graxos cis-insaturados em um carbono ímpar em mitocôndrias de mamíferos, esta via alternativa deve ser mais bem investigada em eucariotos superiores.

Bactérias diazotróficas associadas a raízes e colmos de cultivares de sorgo

Os danos ao ambiente, bem como os custos econômicos relacionados à adubação nitrogenada têm estimulado a busca por alternativas que possam diminuir a utilização deste fertilizante sem que haja diminuição na produtividade. Uma das possibilidades é a utilização de bactérias diazotróficas que podem se associar a plantas de sorgo para fixar nitrogênio gasoso (N2) e/ou produzir substâncias promotoras de crescimento de plantas (PCPs). Outra possibilidade é a seleção de genótipos eficientes na associação com bactérias diazotróficas, já que a eficiência na associação depende de características específicas das plantas. Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a ocorrência e a localização de bactérias diazotróficas associadas ao sorgo, selecionar cultivares eficientes na associação com bactérias diazotróficas, bem como identificar os isolados mais eficientes em fixar nitrogênio e produzir PCPs. A atividade experimental foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa foram utilizados 14 cultivares de sorgo forrageiro em vasos e, na segunda, seis cultivares de sorgo granífero em campo. A seleção dos cultivares de sorgo foi baseada na eficiência de absorção de nitrogênio, através da quantificação de matéria seca e do teor de nitrogênio total da parte aérea das plantas. Para o isolamento das bactérias diazotróficas foi utilizado meio de enriquecimento semi-sólido. Após, quantificou-se a produção de PCPs e os níveis de N2 fixados pelos isolados, a fim de selecionar os mais eficientes. A matéria seca e o teor de N no tecido dos cultivares avaliados foram influenciados pela adubação nitrogenada. A presença de bactérias diazotróficas foi constatada em todos os cultivares de sorgo avaliados. Através da análise de similaridade, verificou-se que, em ambos experimentos, foram formados quatro grupos de isolados, sendo que três se agruparam com 100% de similaridade com as estirpes padrões Burkholderia tropica Ppe8 (ATCC BAA-831), Herbaspirillum seropedicae Z67 (ATCC 35892) e Azospirillum. brasilense Sp7 (ATCC 29145). A distribuição das bactérias isoladas em ambos experimentos foi influenciada pelo genótipo da planta. Além do genótipo, a localização das bactérias isoladas das plantas de sorgo granífero foi influenciada pela adubação nitrogenada, sendo que as raízes foram o sítio preferencial de colonização das bactérias nestes cultivares. Todos os isolados foram aptos em fixar nitrogênio e produzir ácido indol-acético in vitro.

Uma memória dos pomeranos sob as lentes de Ervin Kerckhoff: produção, guarda e circulação de imagens

A presente dissertação tem por objetivo analisar como se constituiu uma memória sobre a colonização pomerana no estado do Espírito Santo a partir da produção fotográfica do imigrante alemão Ervin Kerckhoff, que conviveu e realizou trabalhos junto às famílias de colonos dos assentamentos de Santa Leopoldina e Santa Maria de Jetibá. A pesquisa procura construir uma biografia desse arquivo fotográfico, que hoje integra o acervo de duas instituições de guarda de distintas naturezas: uma pública - o Museu da Imigração Pomerana, que se localiza no município de Santa Maria de Jetibá -, e uma privada - a Agência Porã, cuja sede se encontra em Vitória. Nesse sentido, o trabalho se volta para o exame de como, por quem e para quem essas fotos foram produzidas, suas características, chegando à discussão sobre a circulação dessas imagens e sobre sua guarda.

Persistência e riqueza de mamíferos focais em sistemas agropecuários no planalto meridional brasileiro

A demanda pela produção comercial de madeira exótica e criação de gado é uma fonte comum de conflitos que pode produzir um efeito negativo na conservação da vida silvestre. Este conflito é particularmente evidente no sul do Brasil, onde as áreas protegidas não são grandes suficientes para garantir as necessidades de ocupação de espécies com grandes exigências territoriais, e onde a densidade humana é elevada. Desta maneira, a conservação destas espécies precisa ser assegurada com a manutenção de habitats fora das reservas oficiais. O objetivo desta tese foi identificar os padrões de perda de integridade ambiental na paisagem, buscando os limites nos quais a estabilidade de uma comunidade e de sua estrutura trófica podem ser severamente afetados (capítulo 2 e 3), de maneira que estes resultados possam ser utilizados como procedimentos para escolha de áreas a serem protegidas, recuperação ambiental, e seleção de modelos ecologicamente sustentáveis de manejo comercial. Vários características de grupos indicadores baseados na presençaausência de mamíferos florestais (>1kg) foram verificados para este propósito, incluindo a persistência, riqueza, e composição das comunidades, além da riqueza trófica e presença do maior predador da área, o puma Puma concolor. Explorou-se, também, as limitações do uso de estimativas de riqueza de espécies como diretriz exclusiva de ações de conservação. Os resultados mostraram que RE não estava necessariamente relacionada com a melhor integridade ambiental pressuposta, e corroborada através dos outros indicadores (capítulo 3). Adicionalmente, a RE variou com método amostral, resultado que emerge como impecilho para o uso exclusivo deste parâmetro como indicador (capítulo 4). Esta variação implica que inferências de RE baseadas em múltiplos estudos pode resultar em erro se os mesmos métodos amostrais não forem usados em todos eles. A maior parte das espécies amostradas são dependentes da floresta, sendo que a abordagem por indicadores confirmou esta relação, revelando que as comunidades de mamíferos florestais sofreram as maiores perdas em áreas menos florestadas. A configuração da paisagem poderia ser resumida em propriedades particulares de 600 ha, com florestas restritas a menos de 38% na escala de paisagem. Espécies extintas or quase extintas na configuração observada foram a ariranha Pteronura brasiliensis, tamanduá-bandeira Myrmecophaga tridactyla, onça-pintada Panthera onca, anta Tapirus terrestris. Espécies severamente ameaçadas foram o loboguará Chrysocyon brachyurus e queixada Tayassu pecari. Mesmo assim, informações da distribuição histórica destas espécies em ambientes de floresta-savana, antes da colonização completa por causasianos, indicam que a extensão naturalmente reduzida da floresta nestes ambientes não constituía-se em obstáculo para sua existência, a partir do que é possível inferir que a extinção das espécies foi provocada pelo padrão de ocupação rural e atitudes humanas incompatíveis com a existência destas. Atualmente, exceto pelas espécies com maior demanda florestal, muitas demostram uma surpreendente persistência em condições de cobertura florestal nativa de aproximadamente 10% na paisagem rural não urbanizada.

Caracterização de fungos micorrízicos arbusculares autóctones de parreirais da Serra Gaúcha e otimização de métodos de multiplicação em espécies aromáticas para aplicação na fruticultura

Este estudo teve por objetivos realizar a caracterização morfológica e molecular dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA) autóctones de parreirais da Serra Gaúcha; a otimização do método de produção de inóculos de FMA em plantas aromáticas; além de verificar a eficiência destes inóculos em porta-enxertos de plantas frutíferas. Coletouse solo rizosférico e raízes secundárias de videira em vinte parreirais distribuídos em cinco cidades da Serra Gaúcha (Bento Gonçalves, Caxias, Garibaldi, Nova Pádua e Farroupilha), amostrando-se quatro parreirais por município. A identificação morfológica dos esporos presentes nas amostras foi realizada através de microscopia óptica. A caracterizarão molecular foi realizada por PCR-TTG e seqüenciamento da região rDNA 18S dos esporos previamente identificados pela microscopia. Para a PCR foi utilizado DNA oriundo dos esporos isolados e também de macerado de raízes. Pelo método morfológico, identificaram-se 33 espécies distribuídas em 8 gêneros distintos de FMA. Obtiveram-se quatro perfis moleculares por PCR -TTGE do rDNA 18S de raízes e cinco perfis moleculares por PCR -TTGE do rDNA 18S de esporos das espécies. Através do alinhamento de seqüências obtidas da região de rDNA 18S com as seqüências depositadas no banco de dados NCBI foi possível identificar 7 espécies de FMA. Foram testadas três espécies de plantas aromáticas, hortelã pimenta (Mentha piperita L.), orégano (Origanum vulgare L.) e melissa (Melissa officinalis L.) como multiplicadoras de três espécies de FMA (Glomus clarum Nicol. & Schenck, Glomus etunicatum Becker & Gerd. e Acaulospora sp.) em dois volumes de recipiente (bandeja de isopor com alvéolo de 40 ml e bandeja de isopor com alvéolo de 100 ml). Verificouse a eficiência das plantas aromáticas para produzirem os inóculos destas três espécies de FMA, na colonização do sistema radicular e no desenvolvimento vegetativo de portaenxertos de videira (cv. SO4), citros (cv. Citrange Troyer) e, como dados complementares, em pessegueiro (cv. Okinawa). As plantas aromáticas estudadas multiplicaram com sucesso as espécies de FMA, sendo o inóculo gerado pelas mesmas eficiente em colonizar os porta-enxertos Citrange Troyer, SO4 e Okinawa, propiciando, inclusive, melhor desenvolvimento vegetativo aos dois últimos.

A Expedição Roncador-Xingu e a tarefa de ocupar, civilizar e urbanizar o Brasil Central

Essa dissertação de Mestrado trata do projeto de ocupação do Brasil Central durante o período do Estado Novo através da experiência da Expedição Roncador-Xingu. Nosso interesse é investigar o que envolveu a política de civilizar e urbanizar o interior do País, na busca de uma maior integração entre as diversas regiões. As contradições entre os projetos oficiais e a realidade cotidiana são analisadas com o objetivo de compreender, na dialética que envolveu a campanha desbravadora, de que forma o ideal de progresso promovido pela agência estatal foi apropriado pelas populações locais.

As ações de improbidade administrativa, o foro por prerrogativa de função e o alcance ao agente político

A improbidade administrativa é um fenômeno antigo na história do Brasil, tendo suas raízes estranhadas na própria colonização do país. Nesse sentido, tornou-se indispensável a implementação de medidas para o combate à corrupção lato sensu1, mobilizando as diversas áreas do direito para tal finalidade. A promulgação da Constituição Federal da Republica de 1988 (CRFB/1988) conferiu rigidez constitucional aos meios de coibição à improbidade administrativa, estabelecendo peremptoriamente princípios e normas pertinentes ao tema, evidenciando a importância do controle dos atos praticados pelos agentes públicos. Todavia, ficou a cargo do legislador infraconstitucional regulamentar as ações de improbidade administrativa, o que ocorreu com a promulgação da Lei nº 8429/1992 (Lei de Improbidade Administrativa – LIA). A Lei regulou seus aspectos materiais, quais sejam: seus sujeitos (art. 1º e 2º), atos (art. 9, 10 e 11) e sanções (art. 12); como também seus aspectos procedimentais (art. 17). O tema central do estudo refere-se ao juízo competente para julgamento e processamento dos agentes públicos nas ações de improbidade administrativa, por eles gozarem de foro por prerrogativa de função no julgamento dos crimes comuns (responsabilidade penal) e de responsabilidade (responsabilidade política), e este ser um benefício relacionado exclusivamente com o cargo ocupado pelo agente. Neste sentido, por a ação de improbidade ser essencialmente sancionatória e dotada de aspectos políticos-administrativos, possuindo peculiaridades das duas esferas, muitos questionam a extensão da aplicação do benefício em questão levando em consideração o silêncio da lei. Visto isso, aprofundarei a discussão especificamente no que se refere aos agentes públicos, dividindo-a em dois aspectos: (1) os agentes políticos respondem por improbidade administrativa, visto já responderam no âmbito político-administrativo por crimes de responsabilidade? (2) em caso positivo, aplica-se foro de prerrogativa de função? Essas questões levantadas são alvo de bastante divergência na doutrina e, principalmente, na jurisprudência. Desta forma, o trabalho objetiva analisar se se estenderia a prerrogativa de foro às ações de improbidade administrativa visto que, mesmo constitucionalmente consagrada como ação civil, é uma ação dotada de peculiaridades relevantes, seja pelo forte conteúdo sancionatório, principalmente no que tange às penas previstas que ultrapassam as reparações pecuniárias do direito civil, seja por envolver interesses político e posições hierárquicas. Ultrapassada a questão, ainda busca analisar o ajuizamento destas ações em face dos agentes políticos, tanto em razão de sua possibilidade (visto já responderem por crimes de responsabilidade) quanto ao órgão jurisdicional competente para julgá-los (esbarrando novamente na questão da aplicação ou não da prerrogativa de foro).

O controle da administração pública e o Ministério Público: uma análise da atuação no combate à improbidade administrativa

O presente trabalho visa analisar como ocorre a atuação do Ministério Público na Lei de Improbidade Administrativa. Para isso será feita uma análise sobre o atual perfil da Instituição (de defensor dos direitos da sociedade), além de uma demonstração sobre como a corrupção ocorre no Brasil desde a época da colonização e alguns meios que o legislador pátrio encontrou para combatê-la (como a responsabilização do agente público e os princípios constitucionais da Administração Pública). O foco do trabalho será a análise da Lei 8.429, que regula a improbidade administrativa, para que se possa, então, estudar os meios de atuação do Parquet previstos no diploma legal. Também serão demonstrados alguns dados levantados pelo próprio Ministério Público que demonstram a relevância de sua atuação no combate à improbidade administrativa, de modo a promover a defesa dos direitos da sociedade.

Filogeografia e sistemática molecular de répteis de alguns arquipélagos africanos do Atlântico oriental

Os répteis, nomeadamente os lagartos, lagartixas e osgas, constituem um dos grupos de vertebrados com maior sucesso de colonização das ilhas oceânicas. Juntamente com as aves, devem constituir o grupo que naturalmente melhor se disseminou pelas ilhas oceânicas. Os mamíferos e anfíbios que aí possam existir são na sua maioria de introdução antropogénica. Como são bons colonizadores constituem bons modelos para o estudo de fenómenos e padrões de colonização das ilhas sobretudo tendo em conta que possuem ainda baixa dispersão dentro de cada ilha. Neste trabalho utilizamos marcadores do DNA mitocondrial (12S rRNA, 16S rRNA, citocromo b), marcadores do DNA nuclear (c-mos e enolase) assim como marcadores enzimáticos, para estudar os padrões de colonização, as relações entre espécies, a detecção de espécies introduzidas, a importância dos dados moleculares em relação a outro tipo de dados, nos répteis terrestres dos Arquipélagos da Madeira, Selvagens e Cabo Verde, e ilhas do Golfo da Guiné (São Tomé, Príncipe e Annobon). As sequências de DNA quer mitocondrial quer nuclear permitiram revelar a existência de uma estrutura geográfica em Mabuya spp. de São Tomé (de natureza intraespecífica) e de Cabo Verde (interespecífica) bem como em Lacerta dugesii (intraespecífica) do Arquipélago da Madeira. Esta estrutura é mais evidente em Lacerta dugesii, que apresenta haplótipos típicos e exclusivos de cada um dos quatro grupos principais de ilhas (Madeira, Porto Santo, Desertas e Selvagens), sem que se tivessem observado haplótipos comuns a mais do que um grupo de ilhas. Os dados moleculares obtidos permitem ainda inferir os casos de expansões demográficas recentes como no caso das populações de Lacerta dugesii da Madeira e Porto Santo ou pelo contrário indicativas de subdivisão geográfica da população como no Arquipélago das Selvagens. Nesta espécie apenas terá ocorrido um evento de colonização, e os nossos dados não corroboram a possibilidade de introdução nas Ilhas Selvagens mediada pelo homem. Mabuya spp. de Cabo Verde também forma um grupo monofilético, subentendendo a exemplo de L.dugesii um evento de colonização mas bem mais antigo, dando origem a eventos de radiação evolutiva, tendo-se formado novas espécies que por sua vez terão sido actores na colonização entre ilhas. Usando como modelo os Arquipélagos das Canárias e Cabo Verde, o número de eventos de colonização é menor nos escincídeos do que nos geconídeos. As ilhas do Golfo da Guiné parecem introduzir uma excepção à regra. Assim Mabuya spp. do Golfo da Guiné (São Tomé, Príncipe e Annobon) serão resultantes de 4 eventos de colonização, sendo dois responsáveis pelo aparecimento de M. maculilabris (uma forma no Príncipe e outra em São Tomé), M. ozorii (Annobon) e M. affinis (Príncipe). A exemplo de Lacerta dugesii, Mabuya maculilabris apresenta uma forte estruturação geográfica. Fazendo recurso a sequências já publicadas no GenBank, podemos propor um novo arranjo taxonómico no género Mabuya, não se devendo considerar quatro grupos (sensu Mausfeld), mas sim cinco, em que se adiciona um novo grupo que contempla as espécies do Norte de África e Turquia. As osgas em Cabo Verde, a exemplo das Canárias, apresentam grande variabilidade e terão sido resultado de maior número de eventos de colonização do que os Escincídeos. A nossa análise revela que existem em Cabo Verde maior número de grupos geneticamente distintos do género Tarentola, do que havia sido registado anteriormente. Os Hemidactylus também devem ter sido resultantes de mais do que um evento de colonização: um para Hemidactylus bouvieri e um para Hemidactylus brooki da Ilha do Sal. Hemidactylus brooki existente nas restantes ilhas bem como Hemidactylus mabouia são muito provavelmente de introdução antropogénica. No Golfo da Guiné o número de eventos de colonização não é maior nas osgas do que nos Escincídeos, constituindo assim uma excepção à regra, sendo os Hemidactylus resultantes de pelo menos dois eventos de colonização (quatro em Mabuya). Utilizando Lacerta dugesii como modelo, não encontramos qualquer congruência entre dados enzimáticos, morfológicos e moleculares. Com a aplicação de técnicas moleculares foi possível identificar espécies introduzidas como Hemidactylus mabouia na Madeira, Cabo Verde, São Tomé e Príncipe e Annobon bem como Ramphotyphlops braminus em Annobon. Estas espécies caracterizam-se por serem geneticamente homogéneas. Foi ainda possível verificar o estatuto taxonómico das várias espécies. Em Lacerta dugesii as três subespécies não deverão ser omitidas. Em Mabuya de Cabo Verde dever-se–ão manter as espécies consideradas e as relações estabelecidas. Em Tarentola spp. uma nova subespécie de Tarentola gigas deverá ser considerada e alvo de novas investigações. Os restantes grupos obtidos, geneticamente distintos, são em maior número do que havia sido registado, e deverão ser alvo dum estudo exaustivo.Confirmou-se a presença duma Mabuya em Annobon, muito provavelmente Mabuya ozorii, espécie esquecida ou omitida em muitas listas de espécies como na “EMBL Reptile database”. Duas formas de M. maculilabris em São Tomé e Príncipe, deixam transparecer a possibilidade da existência dum complexo de espécies. A análise de dados moleculares permitiu também referir que M. maculilabris não parece ter sido introduzida pelo homem nestas ilhas. Do ponto de vista conservacionista é fundamental monitorizar as espécies introduzidas pois podem levar à extinção de espécies indígenas, e monitorizar a manutenção dos vários grupos geneticamente distintos encontrados, muitos deles com distribuições restritas. Por fim, ao testar o c-mos na filogenia de Lacerta dugesii, podemos dizer que este gene nuclear pode também ser utilizado sob determinadas condições, ao nível intraespecífico. A região controle do DNA mitocondrial revelou-se também adequada na estimativa das relações filogenéticas. Verificou-se que esta estrutura é em Lacerta dugesii, bem menos variável que o gene do citocromo b (também mitocondrial). Mostra ainda uma variação entre populações e apresenta aspectos curiosos relacionados com a sua estrutura no contexto do que é conhecido actualmente dentro dos vertebrados.