994 resultados para signalisation cellulaire
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La consultation de bases de donnes publiques en bio-informatique est essentielle pour quiconque a un intrt pour la biologie cellulaire, la gntique ou la biologie des systmes. Les notices de ces bases contiennent surtout des donnes spcialises: squences de nuclotides ou dacides amins, structures de protines en trois dimensions, ou encore composantes de sentiers biologiques. Cependant, il peut tre difficile de localiser linformation souhaite parmi les centaines de bases de donnes disponibles. La Bibliothque de la sant de lUniversit de Montral offre depuis janvier 2010 une activit de dcouverte des bases de donnes du National Center for Biotechnology Information; on y explore une vingtaine de bases et doutils laide dexercices pratiques. Les moyens utiliss pour raliser, publiciser et valuer cette nouvelle activit de formation seront prsents.
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Plusieurs tudes ont montr que la perturbation des fonctions du systme cardiovasculaire constitue un risque majeur de dveloppement du trouble dpressif chez l'homme. De plus, suite un infarctus du myocarde, 15-30% de la population dveloppe la dpression majeure dans les 6 8 mois suivant cet vnement suggrant un lien entre les maladies cardiovasculaires et la dpression. Cette dpression est caractrise par une srie de troubles du sommeil. Approximativement 80% des patients hospitaliss et 70% des malades en consultation externe avec une dpression majeure rapportent des difficults dinitiation et de maintient du sommeil. Les travaux effectus dans les laboratoires de Roger Godbout et Guy Rousseau ont montr que suite un infarctus aigu du myocarde chez le rat, on observait de l'anhdonie, de la dtresse comportementale et de la mort cellulaire par apoptose dans le systme limbique. Cette apoptose suivait un dcours spatial et temporel et avait t prvenue par ladministration dantidpresseurs. De plus, le facteur de ncrose tumorale alpha (TNF-) serait un composant majeur dans lactivation de la voie extrinsque conduisant la mort cellulaire observe dans le systme limbique. Les rsultats de cette thse montrent que les rats ayant subi un infarctus du myocarde (IM) prsentaient la fois des troubles du sommeil, de l'anhdonie et de la dtresse comportementale comparables ceux des autres modles animaux de dpression. Les symptmes de dpression ont t prvenus par l'administration la fois d'un antidpresseur (escitalopram) et d'un inhibiteur de la synthse des cytokines proinflammatoires (pentoxifylline). Les troubles du sommeil et l'apoptose avaient aussi t prvenus par l'admistration respective de l'escitalopram et de la pentoxifylline. De plus, les animaux ayant subi un IM prsentaient une diminution du nombre de cellules cholinergiques dans le gnrateur du sommeil paradoxal expliquant en partie la rduction de la dure du sommeil paradoxal observe dans cette thse. Les animaux ayant subi un IM montraient une augmentation systmique du TNF-, l'interleukine-1 (IL-1), et la prostaglandine E2 (PGE2). Le traitement par l'escitalopram bloquait l'augmentation des niveaux plasmatiques du TNF-, de l'IL-1, et de la PGE2 sans affecter celui de la corticostrone et de l'IL-6. Finalement, pour la premire fois, nous avons mis vidence qu'un traitement autre qu'un antidpresseur (pentoxifylline) pouvait rduire le comportement dpressif dans la dpression post-infarctus du myocarde lorsqu'il est administr quelques minutes avant la priode ischmique. Il apparait donc important dintervenir rapidement chez les patients la suite d'un IM et ce ds les premiers jours et avant mme lapparition des premiers signes dinsomnie et de dpression. Une combinaison de traitements pharmacologique et comportemental serait une voie intressante considrer dans la prise en charge de ces patients.
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Limmunothrapie tumorale mdiation cellulaire est un traitement qui utilise le systme immunitaire des patients afin dinduire une rponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette rponse est produite suite la reconnaissance des antignes par les T CD8+. Ces cibles sont appeles antignes tumoraux (TAA) et dfinies comme des protines exprimes par les cellules cancreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifi Dickkopf-1 (DKK1), une protine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothrapie mdiation cellulaire efficace requiert lidentification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothrapie pourrait galement tre amliores par laugmentation de la puissance daction anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spcifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractrisation de lexpression de DKK1 dans les cancers communs et la dtermination de son immunognicit afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints dun cancer commun, vers un phnotype moins diffrenti afin daugmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractris lexpression de DKK1 dans le cancer du sein et dans dautres cancers communs. Le profil dexpression de DKK1 a t tudi par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignes cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. Lexpression de DKK1 a aussi t tudie dans des chantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant dun cancer du sein exprimaient DKK1. La moiti des tumeurs DKK1(+) tait triple ngative, donc pas de rcepteurs dstrogne et de progestrone et tait Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilits de traitements trs restreintes). De plus, 50% des chantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectues dans le cancer du poumon ont t, par la suite, corrobores par d'autres groupes qui ont montr une corrlation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Aprs avoir confirme lexpression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons valu limmunognicit de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectu des stimulations in vitro de cellules mononucles du sang priphrique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s dun cancer du sein ou du poumon avec des peptides drivs de DKK1 pouvant tre prsents par les complexes majeurs dhistocompatibilit (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont t identifis et isols. Par essai multiplex et cytomtrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalit dun ces clones T CD8+ spcifiques DKK1 a t tudie et a rvle un profil effecteur, renforant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans lensemble, les rsultats obtenus dans cette premire partie de thse suggrent une possible utilisation de DKK1 en immunothrapie contre les cancers communs, attribuable son expression dans ces cancers et la possibilit de faire prolifrer des T CD8+ effecteurs spcifiques DKK1 partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thse, je dcrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints dun cancer commun, afin daugmenter la force et la dure de leurs fonctions anti-tumorales. Il a t dmontr que des lymphocytes moins diffrentis sont capables dune rponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons bas ce projet sur lutilisation dun inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur confrer un phnotype moins diffrenti, partageant des caractristiques de la cellule nave et de la cellule mmoire. Des cultures de T CD8+, spcifiques des antignes viraux, en prsence de linhibiteur ont permis daugmenter la scrtion dinterfron (IFN)- et leur activit cytotoxique. Ces rsultats indiquent un effet de lactivation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportes pour la premire fois chez les T CD8+ humains et suggrent une nouvelle stratgie, applicables limmunothrapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activit anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont men la ralisation dune tape trs importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la dmonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux drivs dorganes importants. Ces travaux ont galement men la dmonstration de limmunognicit de DKK1, par lidentification dun peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, ltude de la polyfonctionnalit des T CD8+ spcifiques DKK1 a rvle un profil effecteur favorable pour lobtention dune rponse anti-tumorale efficace. Ces dcouvertes pourraient servir llaboration dune stratgie dimmunothrapie mdiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, ltude phnotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donn lieu lobservation dun phnotype encore jamais rapport chez lhumain, confrant aux T CD8+ un aspect moins diffrenti avec des caractristiques propre un phnotype mmoire. Ces rsultats sont pertinents dans lamlioration de limmunothrapie du cancer, passant par laugmentation de la persistance des lymphocytes. En rsum, les rsultats prsents dans cette thse de doctorat fournissent des vidences indniables quant la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothrapie mdiation cellulaire des cancers communs. Ces rsultats fournissent galement des preuves quant la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par lactivation de la voie de la voie de Wnt, afin de gnrer des lymphocytes mdiateurs plus efficaces pour ce type de thrapie.
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Limmunit adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertbrs mchoire reposent sur la prsentation de peptides par les rcepteurs dhistocompatibilit majeur de classe I. Les peptides antigniques, prsents par les molcules du complexe dhistocompatibilit (CMH), sont scruts par les lymphocytes T CD8 pour une rponse immunitaire approprie. Le rpertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appel immunopeptidome, est gnr par la dgradation protosomale des protines endognes, et a un rle essentiel dans la rgulation de limmunit cellulaire. La composition de limmunopeptidome dpend du type de cellule et peut prsenter des caractristiques lies des maladies comme le cancer. Les peptides antigniques peuvent tre utiliss des fins immunothrapeutiques notamment dans le traitement voire la prvention de certains cancers. La spectromtrie de masse est un outil de choix pour lidentification, le squenage et la caractrisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides amins, la faible abondance et la diversit de ces peptides compliquent leur dtection et leur squenage. Nous avons dvelopp un programme appel StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives la fragmentation des peptides. laide de ce programme, nous montrons sans quivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent trs diffremment des peptides trypsiques communment utiliss en protomique. Nanmoins, la fragmentation par dcomposition induite par collision plus haute nergie (HCD) propose par le spectromtre LTQ-Orbitrap Velos amliore la fragmentation et fournit une haute rsolution qui permet dobtenir une meilleure confiance dans lidentification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet deffectuer le squenage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifis par les recherches utilisant des bases de donnes. La comparaison des programmes de squenage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en vidence que le dernier permet didentifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intgr dans une chane de traitement de recherche dantignes mineurs dhistocompatibilit. Enfin, une base de donnes contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a t dveloppe.
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Les habitudes de consommation de substances psychoactives, le stress, lobsit et les traits cardiovasculaires associs seraient en partie relis aux mmes facteurs gntiques. Afin dexplorer cette hypothse, nous avons effectu, chez 119 familles multi-gnrationnelles qubcoises de la rgion du Saguenay-Lac-St-Jean, des tudes dassociation et de liaison pangnomiques pour les composantes gntiques : de la consommation usuelle dalcool, de tabac et de caf, de la rponse au stress physique et psychologique, des traits anthropomtriques relis lobsit, ainsi que des mesures du rythme cardiaque (RC) et de la pression artrielle (PA). 58000 SNPs et 437 marqueurs microsatellites ont t utiliss et lannotation fonctionnelle des gnes candidats identifis a ensuite t ralise. Nous avons dtect des corrlations phnotypiques significatives entre les substances psychoactives, le stress, lobsit et les traits hmodynamiques. Par exemple, les consommateurs dalcool et de tabac ont montr un RC significativement diminu en rponse au stress psychologique. De plus, les consommateurs de tabac avaient des PA plus basses que les non-consommateurs. Aussi, les hypertendus prsentaient des RC et PA systoliques accrus en rponse au stress psychologique et un indice de masse corporelle (IMC) lev, comparativement aux normotendus. Dautre part, lutilisation de tabac augmenterait les taux corporels dpinphrine, et des niveaux levs dpinphrine ont t associs des IMC diminus. Ainsi, en accord avec les corrlations inter-phnotypiques, nous avons identifi plusieurs gnes associs/lis la consommation de substances psychoactives, la rponse au stress physique et psychologique, aux traits relis lobsit et aux traits hmodynamiques incluant CAMK4, CNTN4, DLG2, DAG1, FHIT, GRID2, ITPR2, NOVA1, NRG3 et PRKCE. Ces gnes codent pour des protines constituant un rseau dinteractions, impliques dans la plasticit synaptique, et hautement exprimes dans le cerveau et ses tissus associs. De plus, lanalyse des sentiers de signalisation pour les gnes identifis (P = 0,03) a rvl une induction de mcanismes de Potentialisation Long Terme. Les variations des traits tudis seraient en grande partie lies au sexe et au statut dhypertension. Pour la consommation de tabac, nous avons not que le degr et le sens des corrlations avec lobsit, les traits hmodynamiques et le stress sont spcifiques au sexe et la pression artrielle. Par exemple, si des variations ont t dtectes entre les hommes fumeurs et non-fumeurs (anciens et jamais), aucune diffrence na t observe chez les femmes. Nous avons aussi identifi de nombreux traits relis lobsit dont la corrlation avec la consommation de tabac apparat essentiellement plus lie des facteurs gntiques quau fait de fumer en lui-mme. Pour le sexe et lhypertension, des diffrences dans lhritabilit de nombreux traits ont galement t observes. En effet, des analyses gntiques sur des sous-groupes spcifiques ont rvl des gnes additionnels partageant des fonctions synaptiques : CAMK4, CNTN5, DNM3, KCNAB1 (spcifique lhypertension), CNTN4, DNM3, FHIT, ITPR1 and NRXN3 (spcifique au sexe). Ces gnes codent pour des protines interagissant avec les protines de gnes dtects dans lanalyse gnrale. De plus, pour les gnes des sous-groupes, les rsultats des analyses des sentiers de signalisation et des profils dexpression des gnes ont montr des caractristiques similaires celles de lanalyse gnrale. La convergence substantielle entre les dterminants gntiques des substances psychoactives, du stress, de lobsit et des traits hmodynamiques soutiennent la notion selon laquelle les variations gntiques des voies de plasticit synaptique constitueraient une interface commune avec les diffrences gntiques lies au sexe et lhypertension. Nous pensons, galement, que la plasticit synaptique interviendrait dans de nombreux phnotypes complexes influencs par le mode de vie. En dfinitive, ces rsultats indiquent que des approches bases sur des sous-groupes et des rseaux amlioreraient la comprhension de la nature polygnique des phnotypes complexes, et des processus molculaires communs qui les dfinissent.
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La mmoire et lapprentissage sont des phnomnes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et molculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticit synaptique, pourraient dterminer la base cellulaire de la formation de la mmoire. Alors que la potentialisation long-terme (LTP) reprsente un renforcement de lefficacit de transmission synaptique, la dpression long-terme (LTD) constitue une diminution de lefficacit des connexions synaptiques. Des tudes ont mis jour certains mcanismes qui participent ce phnomne de plasticit synaptique, notamment, les mcanismes dinduction et dexpression, ainsi que les changements morphologiques des pines dendritiques. La grande majorit des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des pines dendritiques et la prsence de la machinerie traductionnelle prs de ces protubrances suggre fortement lexistence dune traduction locale dARNm. Ces ARNm seraient dailleurs achemins dans les dendrites par des protines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusquaux synapses actives. Le rle des protines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la rgulation de la traduction de certains ARNm est bien tabli. Toutefois, leur rle prcis dans la plasticit synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thse de doctorat value limportance des protines Staufen pour le transport et la rgulation dARNm dans la plasticit synaptique. Nous avons identifi des fonctions spcifiques chaque isoforme; Stau1 et Stau2 tant respectivement impliques dans la late-LTP et la LTD dpendante des rcepteurs mGluR. Cette spcificit sapplique galement au rle que chaque isoforme joue dans la morphogense des pines dendritiques, puisque Stau1 semble ncessaire au maintien des pines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage implique dans le dveloppement des pines. Dautre part, nos travaux ont permis de dterminer que la morphogense des pines dendritiques dpendante de Stau1 tait rgule par une plasticit synaptique endogne dpendante des rcepteurs NMDA. Finalement, nous avons prcis les mcanismes de rgulation de lARNm de la Map1b par Stau2 et dmontr limportance de Stau2 pour la production et lassemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b ncessaires pour la LTD dpendante des mGluR. Les travaux de cette thse dmontrent les rles spcifiques des protines Stau1 et Stau2 dans la rgulation de la plasticit synaptique par les protines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis dapprofondir les connaissances actuelles sur les mcanismes de rgulation des ARNm par les protines Staufen dans la plasticit synaptique. MOTS-CLS EN FRANAIS: Staufen, hippocampe, plasticit synaptique, granules dARN, traduction, pines dendritiques.
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Les cellules souches embryonnaires (ES) sont porteuses de grands espoirs en recherche biomdicale dans le but dapporter un traitement dfinitif lostoarthrose. Parce que certaines articulations des chevaux sont similaires celles des humains, cet animal reprsente un modle important dans lvaluation de stratgies de rgnration du cartilage. Cependant, pour exprimenter un traitement par les cellules ES chez le cheval, des cellules ES quines (eES) nont toujours pas pu tre drives. Dans ce contexte, lobjectif principal de cette tude est de driver des lignes de cellules eES. Le premier objectif de notre tude consiste optimiser la technique de drivation des cellules eES. Nous dmontrons que la ligne de cellules nourricires et le stade de dveloppement des embryons influencent lefficacit de la technique de drivation tandis que linhibition de voies de signalisation menant la diffrenciation des cellules ES ne linfluence pas sous nos conditions. Le deuxime objectif de notre tude est de caractriser de faon plus approfondie les lignes de cellules eES obtenues. Nous dmontrons que les cellules eES drives expriment autant des marqueurs associs aux cellules pluripotentes quaux cellules diffrencies et que linhibition de voies de signalisation menant la diffrenciation ninfluence pas lexpression de ces marqueurs. Pour conclure, nous confirmons avoir driv des lignes de cellules semblables au cellules eES (eES-like) ne correspondant pas compltement aux critres des cellules ES.
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Les changements volutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire appropri, telles que les caractristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mcanismes sensoriels y rpondant. L'haplode de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprtant le gradient de la concentration d'une phromone scrte par les partenaires potentiels grce un rseau de protines signaltiques de type kinase actives par la mitose (MAPK). La dcision de la liaison sexuelle chez la levure est un vnement en "toutourien", la manire d'un interrupteur. Les cellules haplodes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phromones quil produit. Seul le partenaire proximit scrtant des concentrations de phromones gales ou suprieures une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phromones sont attribus des partenaires pouvant mener des accouplements infructueux. Notre comprhension du mcanisme molculaire contrlant cet interrupteur de la dcision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la prsente thse, je dmontre que le mcanisme de dcision de la liaison sexuelle provient de la comptition pour le contrle de l'tat de phosphorylation de quatre sites sur la protine d'chafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette comptition rsulte en la dissociation de type intrupteur entre Fus3 et Ste5, ncessaire la prise de dcision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la dcision de la liaison sexuelle s'effectue une tape prcoce de la voie de rponse aux phromones et se produit rapidement, peut-tre dans le but de prvenir la perte dun partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 gnre un mcanisme indit d'ultrasensibilit, ressemblant "l'ultrasensibilit d'ordre zro", qui rsiste aux variations de concentration de ces protines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dpit de la stochasticit cellulaire ou de variations gntiques entre individus.Je dmontre, par la suite, qu'un vnement prcoce en rponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 la membrane plasmique est galement ultrasensible l'augmentation de la concentration de phromones et que cette ultrasensibilit est engendre par la dphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associe Ste5 via la protine polarisante, Bem1. L'interfrence dans ce mcanisme provoque une perte de l'ultrasensibilit et rduit, du mme coup, l'amplitude et la fidlit de la voie de rponse aux phromones la stimulation. Ces changements se refltent en une rduction de la fidlit et de la prcision de la morphologie attribuable la rponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protique la surface de la membrane plasmique est un thme gnral persistant dans tous les organismes, de la bactrie l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accrotre l'efficacit, la fidlit et la spcificit de la transmission du signal. L'ensemble de nos dcouvertes dmontre que l'ultrasensibilit, la prcision et la robustesse de la rponse aux phromones dcoulent de la rgulation de la phosphorylation stoichiomtrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rle modulateur de Ste5 dans la dcision de la destine cellulaire tend le rpertoire fonctionnel des protines d'chafaudage bien au-del de l'accessoire dans la spcificit et l'efficacit des traitements de l'information. La rgulation de la dynamique des caractres signal-rponse travers une telle rgulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protines d'chafaudage combines l'assemblage la membrane peut tre un moyen gnral par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mcanismes similaires peuvent contrler les dcisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent tre compromis dans des drglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thme reli, je prsente la dcouverte d'un nouveau mcanisme o le seuil de la concentration de phromones est contrl par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manire, le point prdtermin dans lequel la quantit et la qualit des nutriments accessibles dans l'environnement dterminent le seuil partir duquel la levure s'accouple. La sous-unit rgulatrice de la kinase protine A (PKA),Bcy1, une composante cl du rseau signaltique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unit des petites protines G, Gpa1, le premier effecteur dans le rseau de rponse aux phromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en prsence d'un sucre idal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la dcision d'accouplement est active. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accrot la concentration seuil ncessaire une rponse aux phromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilit, les levures peuvent intgrer le stimulus provenant des phromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la dcision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.
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Il y a 4 isoforme de p38 : , , , and . MK5, l'origine identifi comme tant un rgulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour tre active par la protine kinase p38 (qui est un mitogne activ par la protine kinase, MAPK). Cette dernire est implique dans les mcanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est galement active par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien quelles soient fortement exprimes dans le coeur, le rle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par consquent, nous avons tudi l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) induisant un surcharge chronique de pression chez les souris htrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a t augment chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'chocardiographie de la trans-thoracique dmontre que la surcharge de pression a altr la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observ moins de dpt de collagne, valu par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Paralllement, le niveau de lARNm de collagne type1 alpha-1 a t significativement diminu dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De mme, ERK3, mais pas ERK5 ni p38, co-IP avec MK5 dans les 2 modles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, lajout exognique de GST-MK5 a abaiss ERK4 et p38, mais pas ERK3 dans les lystes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38 ne dmontrent aucune co-IP avec MK5. Ces donnes suggrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38, est capable dinteragir avec, et rguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entirement avec ERK3 et par consquent MK5 nest pas disponible pour lier les protines exogniques. Les souris htrozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont galement dmontr une rduction ou une absence de collagne et une faible expression dARNm du collagne type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces rsultats dmontrent un important rle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons galement dmontr 5 variant d'pissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une dltion de 6 paires de base dans lexon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des diffrents variant d'pissage a t vrifie par PCR en temps rel (qPCR). Bien que lexpression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant tait tissu-spcifique (coeur, rein, pancras, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant dpissage varie pendant la surcharge de pression et le dveloppement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqu que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situ au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimules. Suite une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors quune petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'pissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rle exact oblige des recherches supplmentaires. Except lisoforme , toutes les isoformes de p38 sont exprimes dans le coeur et la forme est considre comme tant l'isoforme dominante. Lanalyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont dmontr que p38 et p38 sont les deux isoformes prdominantes alors que p38 et p38 sont exprimes aux mmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a dmontr que p38 et p38 se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite la surcharge par TAC, p38 s'est accumul dans noyau tandis que la distribution de p38 est demeure inchange. Ainsi, l'abondance de p38 et sa translocalisation nuclaire suite la surcharge de pression indique un rle potentiel dans l'expression gnique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en vidence pour la premire fois un rle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38 avec p38, et la localisation diffrentielle de p38 pendant la surcharge aigu ou chronique de pression suggrent diffrents rles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque.
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Linfection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le systme immunitaire et conduit une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par consquent, entrane un tat dimmunodficience. Cette immunodficience permet l'tablissement dinfections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associes au Sida. Ces patients peuvent aussi dvelopper des lymphomes, lsions du systme nerveux central et une atteinte rnale. L'ampleur et la svrit des conditions associes observes chez les patients infects par le VIH-1 ne peuvent tre imputes seulement au processus infectieux et la dpltion des cellules T CD4+. Ceci suggre que les produits des gnes de rgulation pourraient avoir des effets cytopathognes. Cependant, les tudes sur la physiopathogense induite par le VIH ou ses diffrents gnes ont t difficiles mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infects par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider dissquer le rle des diffrents composants du gnome viral et les mcanismes pathogntiques impliqus. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modle de souris transgniques pour le gne vpu. Vpu code pour une phosphoprotine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions la surface cellulaire, induit la dgradation des CD4, induit la rgulation ngative des CMH-1, augmente la susceptibilit la mort cellulaire des lymphocytes T infects par le VIH et favorise la rplication virale en empchant les mcanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractris pathologiquement un modle de souris transgniques porteuses du gne vpu du VIH-1. Nos rsultats dmontrent que lexpression de vpu chez les souris transgniques induit le dveloppement spontan dune hyperplasie lymphode pansystmique, une splnomgalie avec une hyperplasie lymphode folliculaire voluant en lsions prmalignes et malignes qui prsentent certaines similarits avec la maladie de Castleman et une iv glomrulonphrite mesangioprolifrative qui rappelle certaines altrations de nphropathie associe au VIH chez les patients infects. Lensemble des altrations dmontre que les souris Tg/vpu dveloppent une activation chronique et non spcifique du systme immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une drgulation de lIL-6 et une hyperplasie du rseau de cellules mtallophiliques pourraient tre impliques. Dautres rsultats obtenus sur les valuations du fonctionnement du systme immunitaire de la rate et du thymus mettent en vidence une susceptibilit augmente des lymphocytes des tissus lymphodes aux effets apoptotiques de la dexamthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules dorganes lymphodes ainsi quune raction inflammatoire (Schwartzman) exacerbe et des anomalies dans la raction dhypersensibilit retarde exprimentale. Ce modle transgnique reproduit plusieurs anomalies rencontres chez les patients infects par le VIH et ouvre de nouvelles hypothses sur la pathogense de linfection par le VIH.
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Quelques vidences suggrent que Bcl-xL, un membre anti-apoptotique de la famille Bcl-2, possde galement des fonctions au niveau du cycle cellulaire et de ses points-contrle. Pour tudier la rgulation et fonction de Bcl-xL au cours du cycle cellulaire, nous avons gnr et exprim dans des cellules humaines une srie de mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser49Ala, Ser56Ala, Ser62Ala et Thr115Ala. L'analyse de cette srie de mutants rvle que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser62Ala) sont moins stables au point-contrle G2 du cycle cellulaire compares aux cellules exprimant le type sauvage ou les autres mutants de phosphorylation incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala et Thr115Ala. Les tudes de cintiques de phosphorylation et de localisation de phospho-Bcl-xL(Ser62) dans des cellules synchronises et suite l'activation du point-contrle en G2 mdi par l'toposide (VP16), nous indiquent que phospho-Bcl-xL(Ser62) migre dans les corps nuclolaires durant l'arrt en G2 dans les cellules exposes au VP16. Une srie d'expriences incluant des essais kinase in vitro, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et d'ARN interfrant, nous rvlent que Polo kinase 1 (PLK1) et MAPK9/JNK2 sont les protines kinase impliques dans la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62), et pour son accumulation dans les corps nuclolaires pendant le point-contrle en G2. Nos rsultats indiquent que durant le point-contrle en G2, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie et se co-localise avec CDK1(CDC2), le complexe cycline-kinase qui contrle l'entre en mitose. Nos rsultats suggrent que dans les corps nuclolaires, phospho-Bcl-xL(Ser62) stabilise l'arrt en G2 en squestrant CDK1(CDC2) pour retarder l'entre en mitose. Ces rsultats soulignent galement que les dommages l'ADN influencent la composition des corps nuclolaires, structure nuclaire qui merge maintenant comme une composante importante de la rponse aux dommages l'ADN. Dans une deuxime tude, nous dcrivons que les cellules exprimant le mutant de phosphorylation Bcl-xL(Ser62Ala) sont galement plus stables au point-contrle de l'assemblage du fuseau de la chromatine (SAC) suite une exposition au taxol, compares aux cellules exprimant le type sauvage ou d'autres mutants de phosphorylation de Bcl-xL, incluant Thr41Ala, Ser43Ala, Thr47Ala, Ser56Ala. Cet effet est indpendent de la fonction anti-apoptotique de Bcl-xL. Bcl-xL(Ser62) est fortement phosphoryl par PLK1 et MAPK14/SAPKp38 la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et dphosphoryl la tlophase et la cytokinse. Phospho-Bcl-xL(Ser62) se trouve dans les centrosomes avec -tubuline, le long du fuseau mitotique avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique avec des composantes du SAC. Dans des cellules exposes au taxol, phospho-Bcl-xL(Ser62) se lie au complexe inhibiteur CDC20/MAD2/BUBR1/BUB3, alors que le mutant Bcl-xL(Ser62Ala) ne se lie pas ce complexe. Ces rsultats indiquent que durant le SAC, la phosphorylation de Bcl-xL(Ser62) acclre la rsolution du SAC et l'entre des cellules en anaphase. Des expriences bloquant l'expression de Bcl-xL rvlent galement un taux trs lev de cellules ttraplodes et binucles aprs un traitement au nocodazole, consistant avec une fonction de Bcl-xL durant la mitose et dans la stabilit gnomique. Dans la troisime tude, l'analyse fonctionnelle de cette srie de mutants de phosphorylation indique galement que les cellules exprimant Bcl-xL(Ser49Ala) sont moins stables durant le point-contrle G2 et entre en cytokinse plus lentement dans des cellules exposes aux inhibiteurs de la polymrisation/dpolymrisation des tubulines, composantes des microtubules. Ces effets de Bcl-xL(Ser49Ala) sont indpendents de sa fonction anti-apoptotique. La phosphorylation de Bcl-xL(Ser49) est dynamique au cours du cycle cellulaire. Dans des cellules synchronises, Bcl-xL(Ser49) est phosphoryl en phase S et G2, dphosphoryl la promtaphase, la mtaphase et la frontire de l'anaphase, et re-phosphoryl durant la tlophase et la cytokinse. Au cours du point-contrle G2 induit par les dommages l'ADN, un pool important de phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve aux centrosomes, un site important pour la rgulation de l'entre en mitose. Durant la tlophase et la cytokinse, phospho-Bcl-xL(Ser49) se trouve le long des microtubules avec la protine moteure dynine et dans le cytosol mitotique. Finalement, nos rsultats suggrent que PLK3 est responsable de la phosphorylation de Bcl-xL(Ser49), une protine kinase implique pour l'entre des cellules en mitose et pour la progression de la mitose jusqu' la division cellulaire.
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La dcouverte du systme des peptides natriurtiques (NP), au dbut des annes 80, fut une dcouverte majeure qui rvla le rle endocrinien du cur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurse et la natriurse provoques par ce systme ont volu vers un niveau de complexit insouponn cette poque. Nous savons prsent que les NP sont impliqus dans plusieurs autres mcanismes dont la prolifration cellulaire, lapoptose, linhibition du systme rnine-angiotensine-aldostrone (RAAS) et le mtabolisme des adipocytes. Le mtabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre lobsit. Cette condition aux proportions pandmiques est un facteur de risque majeur dans lapparition de lhypertension et du syndrome mtabolique (MetS). La comprhension des mcanismes et des dfauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrle du MetS et de lhypertension. Lexpression du rcepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrle par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurtique de loreillette (ANP). La dcouverte dune boucle de retro-inhibition, dans les annes 90, a t un vnement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite une stimulation lANP, le NPR1/GCA peut inhiber lactivit transcriptionnelle de son propre gne par un mcanisme dpendant du cGMP. Notre groupe a identifi un lment cis-rgulateur responsable de cette sensibilit au cGMP et mon projet consistait identifier la ou les protine(s) liant cet lment de rponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifi un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque dADN complmentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient dun ADNc de 1083-bp dont le gne est localis sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protine dont la fonction tait inconnue jusquici. Nous avons nomm cette nouvelle protine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison lADN ont montr que cette protine possde une affinit 18 fois plus leve pour le cGMP-RE que le contrle, tandis que des expriences de retard sur gel (EMSA) ont confirm la spcificit des interactions protine-ADN. De plus, limmuno-prcipitation de la chromatine (ChIP) a prouv que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe lexpression du gne rapporteur lucifrase sous contrle du promoteur de npr1/gca. Linhibition de GREBP laide dARN interfrant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, lANP stimule lexpression de grebp de 60% aprs seulement 3 heures et inhibe lexpression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protine nuclaire surtout exprime dans le cur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nuclotidiques du gne sont plus frquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici lexistence dun gne spcifique lhumain qui agit comme rpresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqu dans le dveloppement de lhypertension.
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Linflammation est un procd complexe qui vise llimination de lagent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la rparation du tissu affect. La persistance de lagent causal ou lincapacit rsoudre linflammation mne un drglement homostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidit et la mortalit. Lathrosclrose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont lorigine est multifactorielle. Lhypertension et ltat infectieux reprsentent respectivement des facteurs de risque classiques et mergents du dveloppement de cette maladie. Les fondements initiaux de linflammation font intervenir limmunit inne, la premire ligne de dfense dont disposent les cellules pour rpondre un signal de danger. Le but de cette thse est dexaminer le rle pro-inflammatoire dune famille de kinases essentielles limmunit inne, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molcule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est charg deffectuer la phosphorylation de linhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mne sa dgradation et la libration du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit lactivit phosphotransfrase dIKKbeta dans les VSMC par immunoprcipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grce une approche ARN interfrence (ARNi) dirige contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mcanisme dinduction de NF-kappaB par lAngII est atypique, puisquil ne module pas IkappaBalpha, et montrons laide dinhibiteurs pharmacologiques que lactivation de p65 est indpendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du rcepteur de lEGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant elles principalement actives suite une infection bactrienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomgalovirus humain, un pathogne associ lathrosclrose, a la capacit dinduire lactivation de TBK1 dans les VSMC. Lusage dARNi dirig contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliques dans lactivation dIRF-3. De plus, nous montrons laide dune ligne de VSMC exprimant une version dominante ngative dIRF-3 que ce dernier est essentiel la synthse des chimiokines RANTES et IP-10, tel quanalys par RT-PCR. Par ailleurs, il a rcemment t montr que les kinases IKK-related taient troitement lies la transformation oncognique, et que TBK1 tait pro-angiognique. Or, langiogense est le plus souvent module par la rponse hypoxique qui est dailleurs commune la majorit des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module langiogense, linflammation et la survie cellulaire. Nous montrons laide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et dune approche lentivirale que TBK1 est spcifiquement implique dans linduction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. Lexpression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les rsultats originaux prsents dans cette thse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mcanismes distincts.
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Les virus exploitent la machinerie cellulaire de lhte de faon trs varie et plusieurs types vont mme jusqu incorporer certaines protines cellulaires. Nous avons rcemment effectu la premire analyse protomique du virion mature de lHerps simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de dterminer que jusqu 49 protines cellulaires diffrentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de dterminer leur importance dans le cycle de rplication dHSV-1, nous avons mis au point un systme de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relch dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqu la GFP ainsi que des petits ARN interfrents (pARNi) ciblant spcifiquement ces protines cellulaires. Cette approche nous a permis de dmontrer que 17 des protines identifies prcdemment jouaient un rle critique dans la rplication dHSV-1, suggrant ainsi que leur incorporation dans le virus nest pas alatoire. Nous avons ensuite examin le rle dune de ces protines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de rplication de plusieurs virus humains. laide de pARNi ainsi que de diffrentes lignes cellulaires, dont une ligne DDX3X thermosensible, nous avons dmontr que linhibition de DDX3X rsultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de lexpression des gnes viraux. Nous avons aussi dmontr que la fraction de DDX3X incorpore dans le virion contribuait activement au cycle infectieux dHSV-1. Ces rsultats confirment lintrt de notre approche afin dtudier les interactions hte-pathogne en plus de dmontrer la contribution des protines cellulaires incorpores HSV-1 dans linfection virale.
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Limmunosuppression a permis damliorer lincidence du rejet aigu sans toutefois amliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractris par une vasculopathie du greffon (VG) similaire une forme acclre dathrosclrose native accompagne de fibrose. La pathophysiologie de la VG dcoule de lhypothse de rponse linsulte propose par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, lendothlium stress par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie lapoptose endothliale suivi dune rponse de rparation vasculaire via un paississement myo-intimal aux sites dinsultes. Toutefois, lorsque les stress endothliaux initiaux demeurent soutenus, lapoptose endothliale et la rponse de rparation perptuent. Compte tenu que linhibition de lapoptose endothliale bloque le dveloppement de la VG in vivo, notre hypothse de travail reposait sur les rpercussions paracrines de lapoptose endothliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons gnr un systme exprimental in vitro afin dinduire lapoptose endothliale en absence significative de ncrose cellulaire. laide dune approche protomique multidimensionnelle et comparative, nous avons dmontr que les cellules endothliales apoptotiques exportent spcifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons dmontr que certains de ces SPM ont des proprits anti-apoptotiques (TCTP et EGF), dautre fibrognique (CTGF), rcapitulant ainsi certains phnotypes cellulaires associs au dveloppement de la VG. Parmi les mdiateurs identifis, 16 navaient pas de signal de scrtion, incluant TCTP, suggrant que des mcanismes de scrtion non conventionnels soient favoriss durant lapoptose. Nous avons dmontr que la caspase-3 effectrice rgule la voie de scrtion non classique exosomiale associe lexport extracellulaire de nanovsicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, lensemble des donnes protomiques ont permis dmettre lhypothse quen rponse un stress apoptotique, la cellule exporte diffrents mdiateurs (solubles et vsiculaires) de manire non conventionnelle ncessitant la fusion dorganelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mcanisme serait rgul durant la phase effectrice de lapoptose permettant ainsi dinitier une rponse de rparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protique et nanovsiculaire lgu durant lapoptose endothliale pourrait servir simultanment de biomarqueur de la VG et de cible thrapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique.
