Antioxidant and antiviral properties of Pseudopiptadenia contorta (Leguminosae) and of quebracho (Schinopsis sp.) extracts

Proanthocyanidins from P. contorta leaves and from a commercial quebracho extract were isolated and characterized. Flavonoids, catechins and gallic acid were also identified in the extracts of P. contorta. Compounds were evaluated for their antioxidant properties and for their antiviral activity against an acyclovir-resistant herpes simplex virus type 1 strain. The low molecular weight phenolic derivatives and the proanthocyanidins from P. contorta showed the highest antioxidant activity. Purified proanthocyanidins from both P. contorta and quebracho showed the same maximum non toxic concentrations (25 µg/mL), with 82.2% and 100% of virus inhibition, respectively.

Comparação da seqüência de nucleotídeos do gene da proteína capsidial de estirpes severas e premunizantes do Papaya ringspot virus

This study compared three mild and three severe strains of Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W), based on nucleotide and amino acid sequences of the capsid protein (CP) gene. The CP nucleotide sequences of the mild strains shared 98% to 100% identity. When compared to the severe strains the identity ranged from 93% to 95%, except in the case of PRSV-W-2R, which resulted from reversion of the mild strains PRSV-W-2. The CP sequence of the reverting strain showed 100% identity with the sequence of its parental strain. An insertion of six nucleotides in the core region of the CP gene, which reflected the addition of two amino acids (Asn and Asp) in the deduced sequence of the protein, was found in all mild strains. These sequence comparisons were used to design strain-specific primers that were used to specifically amplify regions for either the mild or severe strains.

Ability of Aphis gossypii and Myzus persicae to Transmit Cucumber mosaic virus in Single and Mixed Infection with Two Potyviruses to Zucchini Squash

The main objective of this work was to investigate the ability of Aphis gossypii and Myzus persicae to transmit Cucumber mosaic virus (CMV) singly and mixed with two potyviruses (Papaya ringspot virus - type W, PRSV-W and Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), to zucchini squash plants (Cucurbita pepo). The results showed that the potyviruses in general were more efficiently transmitted by both species of aphids as compared to CMV. The transmission of PRSV-W, ZYMV and CMV separately was more efficient than in mixture.

Distribution of HCV genotypes among different exposure categories in Brazil

Hepatitis C virus (HCV) infection is widespread and responsible for more than 60% of chronic hepatitis cases. HCV presents a genetic variability which has led to viral classification into at least 6 genotypes and a series of subtypes. These variants present characteristic geographical distribution, but their association with different responses to treatment with interferon and severity of disease still remains controversial. The aim of this study was to investigate the patterns of distribution of HCV genotypes among different exposure categories in Brazil. Two hundred and fifty anti-HCV positive samples were submitted to HCV-RNA detection by RT-PCR and their genotype was determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. In addition, the genotype/subtype of 60 samples was also determined by a reverse hybridization assay. HCV 1 was the most prevalent (72.0%), followed by type 3 (25.3%), HCV 2 (2.0%) and HCV 4 (0.7%). The HCV genotype distribution varied among the different exposure categories, with HCV 1 being more frequent among blood donors, hemophiliacs and hemodialysis patients. A high frequency of HCV 3 was observed in cirrhotic patients, blood donors from the South of Brazil and injecting drug users (IDUs). The general distribution of the HCV genotype in Brazil is similar to that in other regions of the world.

Severity score system for progressive myelopathy: development and validation of a new clinical scale

Progressive myelopathies can be secondary to inborn errors of metabolism (IEM) such as mucopolysaccharidosis, mucolipidosis, and adrenomyeloneuropathy. The available scale, Japanese Orthopaedic Association (JOA) score, was validated only for degenerative vertebral diseases. Our objective is to propose and validate a new scale addressing progressive myelopathies and to present validating data for JOA in these diseases. A new scale, Severity Score System for Progressive Myelopathy (SSPROM), covering motor disability, sphincter dysfunction, spasticity, and sensory losses. Inter- and intra-rater reliabilities were measured. External validation was tested by applying JOA, the Expanded Disability Status Scale (EDSS), the Barthel index, and the Osame Motor Disability Score. Thirty-eight patients, 17 with adrenomyeloneuropathy, 3 with mucopolysaccharidosis I, 3 with mucopolysaccharidosis IV, 2 with mucopolysaccharidosis VI, 2 with mucolipidosis, and 11 with human T-cell lymphotropic virus type-1 (HTLV-1)-associated myelopathy participated in the study. The mean ± SD SSPROM and JOA scores were 74.6 ± 11.4 and 12.4 ± 2.3, respectively. Construct validity for SSPROM (JOA: r = 0.84, P < 0.0001; EDSS: r = -0.83, P < 0.0001; Barthel: r = 0.56, P < 0.002; Osame: r = -0.94, P < 0.0001) and reliability (intra-rater: r = 0.83, P < 0.0001; inter-rater: r = 0.94, P < 0.0001) were demonstrated. The metric properties of JOA were similar to those found in SSPROM. Several clinimetric requirements were met for both SSPROM and JOA scales. Since SSPROM has a wider range, it should be useful for follow-up studies on IEM myelopathies.

Human papillomavirus infection among sexual partners attending a Sexually Transmitted Disease Clinic in Rio de Janeiro, Brazil

Cervical cancer is a major source of illness and death among women worldwide and genital infection with oncogenic human papillomavirus (HPV) its principal cause. There is evidence of the influence of the male factor in the development of cervical neoplasia. Nevertheless, the pathogenic processes of HPV in men are still poorly understood. It has been observed that different HPV types can be found among couples. The objective of the present study was to investigate HPV infections in female patients (n = 60 females/group) as well as in their sexual partners and to identify the concordance of HPV genotypes among them. By using the polymerase chain reaction, we detected a 95% prevalence of HPV DNA in women with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) compared to 18.3% in women with normal cervical epithelium, with a statistically significant difference (P < 0.001). The HPV DNA prevalence was 50% in male partners of women with CIN and 16.6% in partners of healthy women. In the control group (healthy women), only 9 couples were simultaneously infected with HPV, and only 22.2% of them had the same virus type, showing a weak agreement rate (kappa index = 0.2). Finally, we observed that HPV DNA was present in both partners in 30 couples if the women had CIN, and among them, 53.3% shared the same HPV type, showing moderate agreement, with a kappa index of 0.5. This finding supports the idea of circulation and recirculation of HPV among couples, perpetuating HPV in the sexually active population, rather than true recurrences of latent infections.

Transmission of West Nile virus in the Niagara Region among a population at risk for exposure

Background. West Nile Virus (WNV), a mosquito-borne flavivirus, is one of an increasing number of infectious diseases that have been emerging or re-emerging in the last two decades. Since the arrival ofWNV to Canada to present date, the Niagara Region has only reported 30 clinical cases, a small number compared to the hundreds reported in other regions of similar conditions. Moreover, the last reported human case in Niagara was in 2006. As it has been demonstrated that the majority of WNV infections are asymptomatic, the question remains whether the lack of clinical cases in Niagara truly reflects the lack of transmission to humans or if infections are still occurring but are mostly asymptomatic. Objectives. The general objective of this study was to establish whether or not active WNV transmission could be detected in a human population residing in Niagara for the 2007 transmission season. To fullfil this objective, a cross-sectional seroprevalence study was designed to investigate for the presence of anti-WNV antibodies in a sample of Mexican migrant agricultural workers employed in farms registered with the Seasonal Agricultural Workers Program (SAWP). Due to the Mexican origin of the study participants, three specific research objectives were proposed: a) determine the seroprevalence ofanti-WNV antibodies as well as anti-Dengue virus antibodies (a closely related virus prevalent in Mexico and likely to confound WNV serology); b) analyze risk factors associated with WNV and Dengue virus seropositivity; and c) assess the awareness of study participants about WNV infection as well as their understanding of the mode of transmission and clinical importance of the infection. Methodology: After obtaining ethics clearance from Brock University, farms were visited and workers invited to participate. Due to time constraints, only a small number of farms were enrolled with a resulting convenience and non-randomized study sample. Workers' demographic and epidemiological data were collected using a standardized questionnaire and blood samples were drawn to determine serum anti-WNV and anti- Dengue antibodies with a commercial ELISA. All positive samples were sent to the National Microbiology Laboratory in Winnipeg, Manitoba for confirmation with the Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT). Data was analyzed with Stata 10.0. Antibody determinations were reported as seroprevalence proportions for both WNV and Dengue. Logistic regression was used to analyze risk factors that may be associated with seropositivity and awareness was reported as a proportion of the number of individuals possessing awareness over the total number of participants. Results and Discussion. In total 92 participants working in 5 farms completed the study. Using the commercial ELISA, seropositivity was as follows: 2.2% for WNV IgM, 20.7% for WNV IgG, and 17.1 % for Dengue IgG. Possible cross-reactivity was demonstrated in 15/20 (75.0%) samples that were positive for both WNV IgG and Dengue IgG. Confirmatory testing with the PRNT demonstrated that none of the WNV ELISA positive samples had antibodies to WNV but 13 samples tested positive for anti-Dengue antibodies (14.1 % Dengue sereoprevalence). The findings showed that the ELISA performance was very poor for assessing anti-WNV antibodies in individuals previously exposed to Dengue virus. However, the ELISA had better sensitivity and specificity for assessing anti-Dengue antibodies. Whereas statistical analysis could not be done for WNV seropositivity, as all samples were PRNT negative, logistic regression demonstrated several risk factors for Dengue exposure_ The first year coming to Canada appeared to be significantly associated with increased exposure to Dengue while lower socio-economic housing and the presence of a water basin in the yard in Mexico appeared to be significantly associated with a decreased exposure to Dengue_ These seemingly contradictory results illustrate that in mobile populations such as migrant workers, risk factors for exposure to Dengue are not easily identified and more research is needed. Assessing the awareness of WNV and its clinical importance showed that only 23% of participants had some knowledge of WNV, of which 76% knew that the infection was mosquito-borne and 47% recognized fever as a symptom. The identified lack of understanding and awareness was not surprising since WNV is not a visible disease in Mexico. Since WNV persists in an enzootic cycle in Niagara and the occurrence of future outbreaks is unpredictable, the agricultural workers remain at risk for transmission. Therefore it important they receive sufficient health education regarding WNV before leaving Mexico and during their stay in Canada. Conclusions. Human transmission of WNV could not be proven among the study participants even when due to their occupation they are at high risk for mosquito bites. The limitations of the study sample do not permit generalizable conclusions, however, the study findings are consistent with the absence of clinical cases in the Niagara Region, so it is likely that human transmission is indeed neglible or absent. As evidenced by our WNV serology results, PRNT must be utilized as a confirmatory test since false positivity occurs frequently. This is especially true when previous exposure to Dengue virus is likely.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Importance des protéines cellulaires incorporées dans les virions matures d’HSV-1

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10).

In vitro and in vivo effects of deoxynivalenol (DON) mycotoxin on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in piglets

Les récoltes de céréales sont souvent contaminées par des moisissures qui se développent pendant la récolte et l’entreposage et produisent des métabolites secondaires appelés mycotoxines. Le porc est reconnu pour être sensible au déoxynivalénol (DON). L’infection virale la plus importante chez le porc est causée par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP). Celui-ci provoque un syndrome grippal et des troubles de reproduction. L’objectif du présent projet était de déterminer l'effet in vitro de DON sur la réplication du VSRRP dans de lignées cellulaires permissives, MARC-145 et PAM, et déterminer in vivo l'impact de DON dans des aliments naturellement contaminés sur l’infection au VSRRP chez le porcelet. Tout d’abord, les cellules ont été incubées avec des doses croissantes de DON et ont été infectées avec du VSRRP pour évaluer la viabilité et la mortalité cellulaire, la réplication virale et l’expression de cytokines. Les résultats ont montré que les concentrations de DON de 560ng/ml et plus affectaient significativement la survie des cellules MARC-145 et PAM infectées par le VSRRP. En revanche, il y avait une augmentation significative de la viabilité et une réduction de la mortalité cellulaire à des concentrations de DON de 140 à 280 ng/ml pour les cellules PAM et de 70 à 280 ng/ml pour les cellules MARC-145 avec une réduction de l'effet cytopathique provoqué parle VSRRP. Au niveau in vivo, 30 porcelets divisés en 3 groupes de 10 porcelets et nourris pendant 2 semaines avec 3 différentes diètes naturellement ont été contaminées avec DON (0; 2,5 et 3,5 mg/kg). Les porcelets ont été subdivisés en 6 groupes, 3 groupes de 6 porcelets et ont été exposés au DON pendant 2 semaines et infectés par voie intratrachéale et intramusculaire avec le virus. Les 3 autres groupes de 4 porcelets servaient de contrôle non infectés. Les signes cliniques ont été enregistrés pendant 21 jours. La virémie a été évaluée par PCR. À la fin de l’expérimentation, les porcelets ont été euthanasiés et les lésions pulmonaires ont été évaluées. Les résultats ont montré que l’ingestion de DON à 3,5 mg/kg a augmenté l’effet du VSRRP sur la sévérité des signes cliniques, les lésions pulmonaires et la mortalité. L’ingestion de DON à 2,5 mg/kg a entrainé une augmentation de la virémie au jour 3 après l’infection mais sans impact sur les signes cliniques et les lésions pulmonaires. Mot clés: DON, VSRRP, MARC-145, PAM, effet cytopathique, cytokines, PCR

Perfil neuropsicológico de personas adultas con VIH/SIDA

Los déficit neurológicos en el virus de inmunodeficiencia humana VIH, específicamente las alteraciones en el funcionamiento cognitivo, han estado presentes desde el inicio de su propagación y han sido una de las principales manifestaciones a lo largo de todas las etapas del virus. No obstante, gracias a los avances de la terapia antirretroviral se ha dado un aumento de la expectativa de vida de los pacientes, dándose de la misma manera un incremento en los déficits anteriormente mencionados. El objetivo del presente estudio es describir el perfil neuropsicológico de los pacientes con VIH y establecer si existen relaciones entre las funciones que se encuentren deterioradas, el tiempo de diagnóstico y la terapia antiretroviral. Para esto se llevo a cabo un estudio descriptivo de tipo exploratorio con el fin de medir las características de las funciones neuropsicológicas en un grupo de 24 pacientes pertenecientes al programa especial B24 del Hospital Universitario Mayor y Hospital de Barrios Unidos MÉDERI en Bogotá, Colombia. Para esto, se utilizó un protocolo de pruebas neuropsicológicas: Mini Mental StateExamination (MMSE), WAIS-III (sub-pruebas dígitos, letras y números, aritmética y semejanzas), Curva de aprendizaje auditivo verbal de Rey (RAVLT), WMS-III (sub-pruebas de recobro de historias y Localización), TMT A y B, Set Test de Isaacs, Figura Compleja de Rey y Test de Stroop. Dentro de los resultados se encontró que la medida de edad fue de 50 con un total de 19 hombres y 5 mujeres. Las funciones con mayor predominio de deterioro fueron la atención sostenida y alternante, la memoria declarativa, las funciones ejecutivas (específicamente en el control inhibitorio) y la velocidad de procesamiento, los pacientes presentan un rango de deterioro cognitivo leve (GDS 3). Se concluyó que el perfil de deterioro es mixto y que es necesario ampliar la muestra para obtener resultados más precisos en cuanto a las diferencias de acuerdo al tiempo de diagnóstico y la terapia antiretroviral.

Efecto del estrés ocasionado por las pruebas académicas sobre los niveles de cortisol y prolactina en un grupo de estudiantes de Medicina

Introducción: La relación entre el sistema inmune y el estrés ha sido motivo de debate en los últimos años. Los cambios neurohormonales generan variaciones en la respuesta inmunológica, con cambios importantes en los niveles de citoquinas lo que causa a su vez, en algunos casos, depresión de la respuesta citotóxica debida a la disminución de la población de células asesinas naturales (NK) (1). El estrés académico constituye un buen modelo para estudiar los cambios asociados en la secreción de algunas hormonas del eje Hipotalámico- Pituitario-Adrenocortical -HPA- (2, 3). Materiales y métodos: En el presente estudio se evaluó el comportamiento de las hormonascortisol y prolactina, así como su incidencia en la respuesta adaptativa a Herpes Simple tipo I, en una población de estudio constituída por 26 estudiantes de la Facultad de Medicina, con edades comprendidas entre 14 y 27 años, con mayor frecuencia de género masculino (80.8%). Se realizó un estudio de intervención longitudinal en tres momentos, donde se midieron los niveles de cortisol, prolactina y anticuerpos contra Herpes Simple tipo I. Así mismo, se realizó una medición 15 días antes de la exposición al estresor, durante la aplicación del estresor (semana de exámenes trimestrales), y quince días después de la exposición al estresor Todas las muestras fueron tomadas entre las 8:00 a.m. y las 10:00 a.m. Resultados y discusión: Se encontraron diferencias significativas (p < 0.001) en los valores promedio de prolactina, pues hubo una tendencia secular al aumento en los tres momentos evaluados. Para el cortisol, los cambios estuvieron cerca de mostrar diferencias significativas (p = 0.098), con un aumento en el momento del estresor y una disminución después del estresor. También hubo diferencias significativas (p = 0.043) en los niveles de anticuerpos para Herpes Simple tipo I, con una tendencia secular al aumento en los tres momentos evaluados. La respuesta adaptativa a Herpes Simple tipo I aumentó notoriamente como resultado de los cambios en la concentración de prolactina, la que, a su vez, aumentó de manera significativa después de la exposición al estresor. Aunque los niveles de cortisol no aumentan significativamente durante la semana del estresor, podrían ser suficientes para mantener niveles basales de prolactina, sin que haya un aumento de la respuesta adaptativa. Se podría inferir que el cortisol regula la síntesis de prolactina, pues en los resultados se observa que, a medida que disminuye la concentración de cortisol, los niveles de prolactina aumentan significativamente.

Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN® , TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.

An intronic G run within HIV-1 intron 2 is critical for splicing regulation of vif mRNA

Within target T lymphocytes, human immunodeficiency virus type I (HIV-1) encounters the retroviral restriction factor APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G; A3G), which is counteracted by the HIV-1 accessory protein Vif. Vif is encoded by intron-containing viral RNAs that are generated by splicing at 3' splice site (3'ss) A1 but lack splicing at 5'ss D2, which results in the retention of a large downstream intron. Hence, the extents of activation of 3'ss A1 and repression of D2, respectively, determine the levels of vif mRNA and thus the ability to evade A3G-mediated antiviral effects. The use of 3'ss A1 can be enhanced or repressed by splicing regulatory elements that control the recognition of downstream 5'ss D2. Here we show that an intronic G run (G(I2)-1) represses the use of a second 5'ss, termed D2b, that is embedded within intron 2 and, as determined by RNA deep-sequencing analysis, is normally inefficiently used. Mutations of G(I2)-1 and activation of D2b led to the generation of transcripts coding for Gp41 and Rev protein isoforms but primarily led to considerable upregulation of vif mRNA expression. We further demonstrate, however, that higher levels of Vif protein are actually detrimental to viral replication in A3G-expressing T cell lines but not in A3G-deficient cells. These observations suggest that an appropriate ratio of Vif-to-A3G protein levels is required for optimal virus replication and that part of Vif level regulation is effected by the novel G run identified here.

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