Inhibition of estrogen-responsive gene activation by the retinoid X receptor beta: evidence for multiple inhibitory pathways.

The retinoid X receptor beta (RXR beta; H-2RIIBP) forms heterodimers with various nuclear hormone receptors and binds multiple hormone response elements, including the estrogen response element (ERE). In this report, we show that endogenous RXR beta contributes to ERE binding activity in nuclear extracts of the human breast cancer cell line MCF-7. To define a possible regulatory role of RXR beta regarding estrogen-responsive transcription in breast cancer cells, RXR beta and a reporter gene driven by the vitellogenin A2 ERE were transfected into estrogen-treated MCF-7 cells. RXR beta inhibited ERE-driven reporter activity in a dose-dependent and element-specific fashion. This inhibition occurred in the absence of the RXR ligand 9-cis retinoic acid. The RXR beta-induced inhibition was specific for estrogen receptor (ER)-mediated ERE activation because inhibition was observed in ER-negative MDA-MB-231 cells only following transfection of the estrogen-activated ER. No inhibition of the basal reporter activity was observed. The inhibition was not caused by simple competition of RXR beta with the ER for ERE binding, since deletion mutants retaining DNA binding activity but lacking the N-terminal or C-terminal domain failed to inhibit reporter activity. In addition, cross-linking studies indicated the presence of an auxiliary nuclear factor present in MCF-7 cells that contributed to RXR beta binding of the ERE. Studies using known heterodimerization partners of RXR beta confirmed that RXR beta/triiodothyronine receptor alpha heterodimers avidly bind the ERE but revealed the existence of another triiodothyronine-independent pathway of ERE inhibition. These results indicate that estrogen-responsive genes may be negatively regulated by RXR beta through two distinct pathways.

Negative antagonists promote an inactive conformation of the beta 2-adrenergic receptor.

The beta 2-adrenergic receptor undergoes isomerization between an inactive conformation (R) and an active conformation (R*). The formation of the active conformation of the receptor molecule can be promoted by adrenergic agonists or by mutations in the third cytoplasmic domain that constitutively activate the receptor. Here we show that, of several beta-adrenergic receptor-blocking drugs tested, only two, ICI 118551 and betaxolol, inhibit the basal signaling activity of the beta 2-adrenergic receptor, thus acting as negative antagonists. We document the molecular properties of the more efficacious ICI 118551; (i) it shows higher affinity for the inactive form of the receptor and (ii) it inhibits the spontaneous formation of a beta-adrenergic receptor kinase substrate by the receptor. These properties are opposite those of adrenergic agonists, indicating that, in a fashion reciprocal to that of agonists, negative antagonists promote the formation of an inactive conformation of the receptor.

Expression of the NH(2)-terminal fragment of RasGAP in pancreatic beta-cells increases their resistance to stresses and protects mice from diabetes.

OBJECTIVE: Our laboratory has previously established in vitro that a caspase-generated RasGAP NH(2)-terminal moiety, called fragment N, potently protects cells, including insulinomas, from apoptotic stress. We aimed to determine whether fragment N can increase the resistance of pancreatic beta-cells in a physiological setting. RESEARCH DESIGN AND METHODS: A mouse line, called rat insulin promoter (RIP)-N, was generated that bears a transgene containing the rat insulin promoter followed by the cDNA-encoding fragment N. The histology, functionality, and resistance to stress of RIP-N islets were then assessed. RESULTS: Pancreatic beta-cells of RIP-N mice express fragment N, activate Akt, and block nuclear factor kappaB activity without affecting islet cell proliferation or the morphology and cellular composition of islets. Intraperitoneal glucose tolerance tests revealed that RIP-N mice control their glycemia similarly as wild-type mice throughout their lifespan. Moreover, islets isolated from RIP-N mice showed normal glucose-induced insulin secretory capacities. They, however, displayed increased resistance to apoptosis induced by a series of stresses including inflammatory cytokines, fatty acids, and hyperglycemia. RIP-N mice were also protected from multiple low-dose streptozotocin-induced diabetes, and this was associated with reduced in vivo beta-cell apoptosis. CONCLUSIONS: Fragment N efficiently increases the overall resistance of beta-cells to noxious stimuli without interfering with the physiological functions of the cells. Fragment N and the pathway it regulates represent, therefore, a potential target for the development of antidiabetes tools.

Competition between beta-subunits of cardiac L-type calcium channels

Cardiac L-type Ca (CaV1.2) channels are composed of a pore forming CaV1.2-α1 subunit and auxiliary β- and α2δ-subunits. β-subunits are important not only for surface expression of the channel pore but also for modulation of channel gating properties. Different β-subunits differentially modulate channel activity (Hullin et al., PLOSone, 2007) and thus L-type Ca2+ channel gating is altered when β-subunit expression pattern is changed. In human heart failure increased activity of single ventricular L-type Ca2+-channels is associated with an increased expression of β2-subunits. Interestingly, induction of β2-subunit over-expression in hearts of transgenic mice resembled this heart failure phenotype of hyperactive single L-type Ca2+-channel channels (Beetz et al., Cardiovasc Res. 2009). We hypothesised that competition of less stimulating β-subunits (e.g. β1) with β-subunits causing strong channel stimulation (e.g. β2) might be a means to treat dysfunctional L-type Ca2+-channel activity. To test this hypothesis, we performed whole-cell and single-channel measurements employing recombinant CaV1.2 channels expressed in HEK293 cells together with both β- and β1a2b-subunits. Whole-cell analysis revealed no differences of maximum L-type Ca2+-current densities [pA/pF] with coexpression of either β1a-subunits (-52±3.8), β2b-subunits (-61.5±6.6) or the mixtures of β- and β1a2b-subunits with the plasmid transfection ratio of 2:1 (-60.2±1.6) and 1:1 (-56.7±2.6) respectively. However, steady state inactivation kinetics differed between particular β-subunit and the relative amount of β-subunit presence in the mixtures (β1a1a-subunit (-41.1±1.0), β2b-subunits (-35.1±1.1), mixture 2:1 (-40.3±1.5), and mixture 1:1 (-38.4±2.0); [mV]; p<0.05, students t-test). Using a novel single-channel analysis, switching of gating between β1-like and β2-like modes was monitored on a minute time-scale when both β-subunits were co-expressed in the same cells, but the larger amount of β1a-subunits is required for the effective switching of gating. Our results indicate a model of mutually exclusive binding and effective competition between several β-subunits suggesting that hyperactive channel gating mediated e.g. by β2-subunits can be normalized by β1-subunits. Therefore, competitive replacement between different L-type Ca2+-channel β-subunits might serve as a novel therapeutic strategy for e.g. heart failure.

A natural structural variant of the mouse TCR beta-chain displays intrinsic receptor function and antigen specificity.

The Cbeta0 alternate cassette exon is located between the Jbeta1 and Cbeta1 genes in the mouse TCR beta-locus. In T cells with a VDJbeta1 rearrangement, the Cbeta0 exon may be included in TCRbeta transcripts (herein called TCRbeta-Cbeta0 transcripts), potentially inserting an additional 24 aa between the V and C domains of the TCR beta-chain. These TCRbeta splice isoforms may be differentially regulated after Ag activation, because we detected TCRbeta-Cbeta0 transcripts in a high proportion (>60%) of immature and mature T cells having VDJbeta1 rearrangements but found a substantially reduced frequency (<35%) of TCRbeta-Cbeta0 expression among CD8 T cells selected by Ag in vivo. To study the potential activity of the TCRbeta-Cbeta0 splice variant, we cloned full-length TCR cDNAs by single-cell RT-PCR into retroviral expression vectors. We found that the TCRbeta-Cbeta0 splice isoform can function during an early stage of T cell development normally dependent on TCR beta-chain expression. We also demonstrate that T hybridoma-derived cells expressing a TCRbeta-Cbeta0 isoform together with the clonally associated TCR alpha-chain recognize the same cognate peptide-MHC ligand as the corresponding normal alphabetaTCR. This maintenance of receptor function and specificity upon insertion of the Cbeta0 peptide cassette signifies a remarkable adaptability for the TCR beta-chain, and our findings open the possibility that this splice isoform may function in vivo.

The nuclear hormone receptor peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta potentiates cell chemotactism, polarization, and migration.

After an injury, keratinocytes acquire the plasticity necessary for the reepithelialization of the wound. Here, we identify a novel pathway by which a nuclear hormone receptor, until now better known for its metabolic functions, potentiates cell migration. We show that peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta (PPARbeta/delta) enhances two phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathways, namely, the Akt and the Rho-GTPase pathways. This PPARbeta/delta activity amplifies the response of keratinocytes to a chemotactic signal, promotes integrin recycling and remodeling of the actin cytoskeleton, and thereby favors cell migration. Using three-dimensional wound reconstructions, we demonstrate that these defects have a strong impact on in vivo skin healing, since PPARbeta/delta-/- mice show an unexpected and rare epithelialization phenotype. Our findings demonstrate that nuclear hormone receptors not only regulate intercellular communication at the organism level but also participate in cell responses to a chemotactic signal. The implications of our findings may be far-reaching, considering that the mechanisms described here are important in many physiological and pathological situations.

Effects of the PPAR-beta agonist GW501516 in an in vitro model of brain inflammation and antibody-induced demyelination.

BACKGROUND: Brain inflammation plays a central role in numerous brain pathologies, including multiple sclerosis (MS). Microglial cells and astrocytes are the effector cells of neuroinflammation. They can be activated also by agents such as interferon-gamma (IFN-gamma) and lipopolysaccharide (LPS). Peroxisome proliferator-associated receptor (PPAR) pathways are involved in the control of the inflammatory processes, and PPAR-beta seems to play an important role in the regulation of central inflammation. In addition, PPAR-beta agonists were shown to have trophic effects on oligodendrocytes in vitro, and to confer partial protection in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS. In the present work, a three-dimensional brain cell culture system was used as in vitro model to study antibody-induced demyelination and inflammatory responses. GW 501516, a specific PPAR-beta agonist, was examined for its capacity to protect from antibody-mediated demyelination and to prevent inflammatory responses induced by IFN-gamma and LPS. METHODS: Aggregating brain cells cultures were prepared from embryonal rat brain, and used to study the inflammatory responses triggered by IFN-gamma and LPS and by antibody-mediated demyelination induced by antibodies directed against myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The effects of GW 501516 on cellular responses were characterized by the quantification of the mRNA expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-6 (IL-6), inducible NO synthase (i-NOS), PPAR-beta, PPAR-gamma, glial fibrillary acidic protein (GFAP), myelin basic protein (MBP), and high molecular weight neurofilament protein (NF-H). GFAP expression was also examined by immunocytochemistry, and microglial cells were visualized by isolectin B4 (IB4) and ED1 labeling. RESULTS: GW 501516 decreased the IFN-gamma-induced up-regulation of TNF-alpha and iNOS in accord with the proposed anti-inflammatory effects of this PPAR-beta agonist. However, it increased IL-6 m-RNA expression. In demyelinating cultures, reactivity of both microglial cells and astrocytes was observed, while the expression of the inflammatory cytokines and iNOS remained unaffected. Furthermore, GW 501516 did not protect against the demyelination-induced changes in gene expression. CONCLUSION: Although GW 501516 showed anti-inflammatory activity, it did not protect against antibody-mediated demyelination. This suggests that the protective effects of PPAR-beta agonists observed in vivo can be attributed to their anti-inflammatory properties rather than to a direct protective or trophic effect on oligodendrocytes.

Involvement of the RasGAP derived fragment N in the resistance of pancreatic beta cells towards apoptosis

RESUME DESTINE AUX NON SCIENTIFIQUESLe diabète est une maladie associée à un excès de glucose (sucre) dans le sang. Le taux de glucose sanguin augmente lorsque l'action d'une hormone, l'insuline, responsable du transport du glucose du sang vers les tissus de l'organisme diminue, ou lorsque les quantités d'insuline à disposition sont inadéquates.L'une des causes communes entre les deux grands types de diabète connus, le type 1 et le type 2, est la disparition des cellules beta du pancréas, spécialisées dans la sécrétion d'insuline, par mort cellulaire programmée aussi appelée apoptose. Alors que dans le diabète de type 1, la destruction des cellules beta est causée par notre propre système immunitaire, dans le diabète de type 2, la mort de ces cellules, est principalement causée par des concentrations élevées de graisses saturés ou de molécules impliquées dans l'inflammation que l'on rencontre en quantités augmentées chez les personnes obèses. Etant donné l'augmentation épidémique du nombre de personnes obèses de par le monde, on estime que le nombre de personnes diabétiques (dont une majorité sont des diabétiques de type 2), va passer de 171 million en l'an 2000, à 366 million en l'an 2030, expliquant la nécessité absolue de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutique pour combattre cette maladie.L'apoptose est un processus complexe dont la dérégulation induit de nombreuses affections allant du cancer jusqu'au diabète. L'activation de caspase 3, une protéine clé contrôlant la mort cellulaire, était connue pour systématiquement mener à la mort cellulaire programmée. Ces dernières années, notre laboratoire a décrit des mécanismes de survie qui sont activés par caspase 3 et qui expliquent sans doute pourquoi son activation ne mène pas systématiquement à la mort cellulaire. Lorsqu'elle est faiblement activée, caspase 3 clive une autre protéine appelée RasGAP en deux protéines plus courtes dont l'une, appelée le fragment Ν a la particularité de protéger les cellules contre l'apoptose.Durant ma thèse, j'ai été impliqué dans divers projets destinés à mieux comprendre comment le fragment Ν protégeait les cellules contre l'apoptose et à savoir s'il pouvait être utilisé comme outil thérapeutique dans les conditions de survenue d'un diabète expérimental. C'est dans ce but que nous avons créé une souris transgénique, appelée RIP-N, exprimant le fragment Ν spécifiquement dans les cellules beta. Comme attendu, les cellules beta de ces souris étaient plus résistantes à la mort induite par des composés connus pour induire le diabète, comme certaines molécules induisant l'inflammation ou les graisses saturées. Nous avons ensuite pu montrer que les souris RIP-N étaient plus résistantes à la survenue d'un diabète expérimental que ce soit par l'injection d'une drogue induisant l'apoptose des cellules beta, que ce soit dans un fond génétique caractérisé par une attaque spontanée des cellules beta par le système immunitaire ou dans le contexte d'un diabète de type 2 induit par l'obésité. Dans plusieurs des modèles animaux étudiés, nous avons pu montrer que le fragment Ν protégeait les cellules en activant une voie protectrice bien connue impliquant successivement les protéines Ras, PI3K et Akt ainsi qu'en bloquant la capacité d'Akt d'activer le facteur NFKB, connu pour être délétère pour la survie de la cellule beta. La capacité qu'a le fragment Ν d'activer Akt tout en prévenant l'activation de NFKB par Akt est par conséquent particulièrement intéressante dans l'intégration des signaux régulant la mort cellulaire dans le contexte de la survenue d'un diabète.La perspective d'utiliser le fragment Ν comme outil thérapeutique dépendra de notre capacité à activer les signaux protecteurs induits par le fragment Ν depuis l'extérieur de la cellule ou de dériver des peptides perméables aux cellules possédant les propriétés du fragment N.2 SUMMARYDiabetes mellitus is an illness associated with excess blood glucose. Blood glucose levels raise when the action of insulin decreases or when insulin is provided in inappropriate amounts. In type 1 diabetes (T1D) as well as in type 2 diabetes (T2D), the insulin secreting beta cells in the pancreas undergo controlled cell death also called apoptosis. Whereas in T1D, beta cells are killed by the immune system, in T2D, they are killed by several factors, among which are increased blood glucose levels, increased levels of harmful lipids or pro-inflammatory cytokines that are released by the dysfunctional fat tissue of obese people. Given the epidemic increase in the number of obese people throughout the world, the number of diabetic people (a majority of which are type 2 diabetes) is estimated to rise from 171 million affected people in the year 2000 to 366 million in 2030 explaining the absolute requirement for new therapies to fight the disease.Apoptosis is a very complex process whose deregulation leads to a wide range of diseases going from cancer to diabetes. Caspase 3 although known as a key molecule controlling apoptosis, has been shown to have various other functions. In the past few years, our laboratory has described a survival mechanism, that takes place at low caspase activity and that might explain how cells that activate their caspases for reasons other than apoptosis survive. In such conditions, caspase 3 cleaves another protein called RasGAP into two shorter proteins, one of which, called fragment N, protects cells from apoptosis.We decided to check whether fragment Ν could be used as a therapeutical tool in the context of diabetes inducing conditions. We thus derived a transgenic mouse line, called RIP-N, in which the expression of fragment Ν is restricted to beta cells. As expected, the beta cells of these mice were more resistant ex-vivo to cell death induced by diabetes inducing factors. We then showed that the RIP-N transgenic mice were resistant to streptozotocin induced diabetes, a mouse model mimicking type 1 diabetes, which correlated to fewer number of apoptotic beta cells in the pancreas of the transgenic mice compared to their controls. The RIP-N transgene also delayed overt diabetes development in the NOD background, a mouse model of autoimmune type 1 diabetes, and delayed the occurrence of obesity induced hyperglycemia in a mouse model of type 2-like diabetes. Interestingly, fragment Ν was mediating its protection by activating the protective Akt kinase, and by blocking the detrimental NFKB factor. Our future ability to activate the protective signals elicited by fragment Ν from the outside of cells or to derive cell permeable peptides bearing the protective properties of fragment Ν might condition our ability to use this protein as a therapeutic tool.3 RESUMELe diabète est une maladie associée à un excès de glucose plasmatique. La glycémie augmente lorsque l'action de l'insuline diminue ou lorsque les quantités d'insuline à disposition sont inadéquates. Dans le diabète de type 1 (D1) comme dans le diabète de type 2 (D2), les cellules beta du pancréas subissent la mort cellulaire programmée aussi appelée apoptose. Alors que dans le D1 les cellules beta sont tuées par le système immunitaire, dans le D2 elles sont tuées par divers facteurs parmi lesquels on trouve des concentrations élevées de glucose, d'acides gras saturés ou de cytokines pro-inflammatoires qui sont sécrétées en concentrations augmentées par le tissu adipeux dysfonctionnel des personnes obèses. Etant donné l'augmentation épidémique du nombre de personnes obèses de par le monde, on estime que le nombre de personnes diabétiques (dont une majorité sont des diabétiques de type 2), va passer de 171 million en l'an 2000, à 366 million en l'an 2030, justifiant la nécessité absolue de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutique pour combattre cette maladie.L'apoptose est un processus complexe dont la dérégulation induit de nombreuses affections allant du cancer jusqu'au diabète. Caspase 3, bien que connue comme étant une protéine clé contrôlant l'apoptose a bien d'autres fonctions démontrées. Ces dernières années, notre laboratoire a décrit un mécanisme de survie qui est activé lorsque caspase 3 est faiblement activée et qui explique probablement comment des cellules qui ont activé leurs caspases pour une autre raison que l'apoptose peuvent survivre. Dans ces conditions, caspase 3 clive une autre protéine appelée RasGAP en deux protéines plus courtes dont l'une, appelée le fragment Ν a la particularité de protéger les cellules contre l'apoptose.Nous avons donc décidé de vérifier si le fragment Ν pouvait être utilisé comme outil thérapeutique dans les conditions de survenue d'un diabète expérimental. Pour se faire, nous avons créé une souris transgénique, appelée RIP-N, exprimant le fragment Ν spécifiquement dans les cellules beta. Comme attendu, les cellules beta de ces souris étaient plus résistantes ex-vivo à la mort induite par des facteurs pro-diabétogènes. Nous avons ensuite pu montrer que les souris RIP-N étaient plus résistantes à la survenue d'un diabète induit par la streptozotocine, un drogue mimant la survenue d'un D1 et que ceci était corrélée à une diminution du nombre de cellules en apoptose dans le pancréas des souris transgéniques comparé à leurs contrôles. L'expression du transgène a aussi eu pour effet de retarder la survenue d'un diabète franc dans le fond génétique NOD, un modèle génétique de diabète de type 1 auto-immun, ainsi que de retarder la survenue d'une hyperglycémie dans un modèle murin de diabète de type 2 induit par l'obésité. Dans plusieurs des modèles animaux étudiés, nous avons pu montrer que le fragment Ν protégeait les cellules en activant la kinase protectrice Akt ainsi qu'en bloquant le facteur délétère NFKB. La perspective d'utiliser le fragment Ν comme outil thérapeutique dépendra de notre capacité à activer les signaux protecteurs induits par le fragment Ν depuis l'extérieur de la cellule ou de dériver des peptides perméables aux cellules possédant les propriétés du fragment

Analysis of the alternative pathways for the beta-oxidation of unsaturated fatty acids using transgenic plants synthesizing polyhydroxyalkanoates in peroxisomes.

Degradation of fatty acids having cis-double bonds on even-numbered carbons requires the presence of auxiliary enzymes in addition to the enzymes of the core beta-oxidation cycle. Two alternative pathways have been described to degrade these fatty acids. One pathway involves the participation of the enzymes 2, 4-dienoyl-coenzyme A (CoA) reductase and Delta(3)-Delta(2)-enoyl-CoA isomerase, whereas the second involves the epimerization of R-3-hydroxyacyl-CoA via a 3-hydroxyacyl-CoA epimerase or the action of two stereo-specific enoyl-CoA hydratases. Although degradation of these fatty acids in bacteria and mammalian peroxisomes was shown to involve mainly the reductase-isomerase pathway, previous analysis of the relative activity of the enoyl-CoA hydratase II (also called R-3-hydroxyacyl-CoA hydro-lyase) and 2,4-dienoyl-CoA reductase in plants indicated that degradation occurred mainly through the epimerase pathway. We have examined the implication of both pathways in transgenic Arabidopsis expressing the polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas aeruginosa in peroxisomes and producing polyhydroxyalkanoate from the 3-hydroxyacyl-CoA intermediates of the beta-oxidation cycle. Analysis of the polyhydroxyalkanoate synthesized in plants grown in media containing cis-10-heptadecenoic or cis-10-pentadecenoic acids revealed a significant contribution of both the reductase-isomerase and epimerase pathways to the degradation of these fatty acids.

Comparison of thermogenic activity induced by the new sympathomimetic Ro 16-8714 between normal and obese subjects.

In a previous study, we demonstrated that the new beta-adrenoceptor agonist Ro 16-8714 possesses thermogenic property in normal male volunteers. The aim of the present study was to compare the metabolic response of lean vs obese individuals to a similar dose of this compound. Following an overnight fast, Ro 16-8714 (0.17 mg/kg fat free mass) or a placebo was given per os to six normal-weight subjects and to six moderately obese subjects. The rate of energy expenditure (EE) and the substrate utilization were determined by indirect calorimetry (hood system) before and for 6 h following the drug administration. Heart rate and blood pressure as well as plasma glucose, insulin and free fatty acid (FFA) concentrations were also measured at regular intervals throughout the study. The increment relative to base-line (mean +/- s.e.m.) in EE was similar in the two groups and averaged 4.0 +/- 1.4 per cent and 12.2 +/- 1.4 per cent with placebo and with Ro 16-8714 respectively in lean subjects, whereas the values reached 3.5 +/- 1.2 per cent and 14.4 +/- 2.0 per cent in obese subjects. Heart rate, systolic blood pressure, insulin and FFA were increased without any significant difference between the two groups. This study shows that Ro 16-8714 is a potent thermogenic agent both in normal and obese subjects.

Critical roles of the nuclear receptor PPARbeta (peroxisome-proliferator-activated receptor beta) in skin wound healing.

The PPARs (peroxisome-proliferator-activated receptors) alpha, beta/delta and gamma belong to the nuclear hormone receptor superfamily. While all three receptors are undetectable in adult mouse interfollicular epidermis, PPARbeta expression and activity is strongly re-activated by inflammatory stimuli during epidermal injury. The pro-inflammatory cytokine TNFalpha (tumour necrosis factor alpha) stimulates transcription of the PPARbeta gene via an activator protein-1 site in its promoter and it also triggers the production of PPARbeta ligands in keratinocytes. This increase of PPARbeta activity in these cells up-regulates the expression of integrin-linked kinase and 3-phosphoinositide-dependent kinase-1, which phosphorylates protein kinase B-alpha (Akt1). The resulting increase in Akt1 activity suppresses apoptosis and ensures the presence of a sufficient number of viable keratinocytes at the wound margin for re-epithelialization. Together, these observations reveal that PPARbeta takes on multiple roles and contributes favourably to the process of wound closure.

Pulse wave amplitude drops during sleep are reliable surrogate markers of changes in cortical activity

Rapport de synthèseLe syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une pathologie respiratoire fréquente. Sa prévalence est estimée entre 2 et 5% de la population adulte générale. Ses conséquences sont importantes. Notamment, une somnolence diurne, des troubles de la concentration, des troubles de la mémoire et une augmentation du risque d'accident de la route et du travail. Il représente également un facteur de risque cardiovasculaire indépendant.Ce syndrome est caractérisé par la survenue durant le sommeil d'obstructions répétées des voies aériennes supérieures. L'arrêt ou la diminution d'apport en oxygène vers les poumons entraîne des épisodes de diminution de la saturation en oxygène de l'hémoglobine. Les efforts ventilatoires visant à lever l'obstacle présent sur les voies aériennes causent de fréquents réveils à l'origine d'une fragmentation du sommeil.La polysomnographie (PSG) représente le moyen diagnostic de choix. Il consiste en l'enregistrement dans un laboratoire du sommeil et en présence d'un technicien diplômé, du tracé électroencéphalographique (EEG), de l'électrooculogramme (EOG), de l'électromyogramme mentonnier (EMG), du flux respiratoire nasal, de l'oxymétrie de pouls, de la fréquence cardiaque, de l'électrocardiogramme (ECG), des mouvements thoraciques et abdominaux, de la position du corps et des mouvements des jambes. L'examen est filmé par caméra infrarouge et les sons sont enregistrés.Cet examen permet entre autres mesures, de déterminer les événements respiratoires obstructifs nécessaires au diagnostic de syndrome d'apnée du sommeil. On définit une apnée lors d'arrêt complet du débit aérien durant au moins 10 secondes et une hypopnée en cas, soit de diminution franche de l'amplitude du flux respiratoire supérieure à 50% durant au moins 10 secondes, soit de diminution significative (20%) de l'amplitude du flux respiratoire pendant au minimum 10 secondes associée à un micro-éveil ou à une désaturation d'au moins 3% par rapport à la ligne de base. La détection des micro-éveils se fait en utilisant les dérivations électroencéphalographiques, électromyographiques et électrooculographiques. Il existe des critères visuels de reconnaissance de ces éveils transitoire: apparition de rythme alpha (8.1 à 12.0 Hz) ou beta (16 à 30 Hz) d'une durée supérieure à 3 secondes [20-21].Le diagnostic de S AOS est retenu si l'on retrouve plus de 5 événements respiratoires obstructifs par heure de sommeil associés soit à une somnolence diurne évaluée selon le score d'Epworth ou à au moins 2 symptômes parmi les suivants: sommeil non réparateur, étouffements nocturne, éveils multiples, fatigue, troubles de la concentration. Le S AOS est gradué en fonction du nombre d'événements obstructifs par heure de sommeil en léger (5 à 15), modéré (15 à 30) et sévère (>30).La polysomnographie (PSG) comporte plusieurs inconvénients pratiques. En effet, elle doit être réalisée dans un laboratoire du sommeil avec la présence permanente d'un technicien, limitant ainsi son accessibilité et entraînant des délais diagnostiques et thérapeutiques. Pour ces mêmes raisons, il s'agit d'un examen onéreux.La polygraphie respiratoire (PG) représente l'alternative diagnostique au gold standard qu'est l'examen polysomnographique. Cet examen consiste en l'enregistrement en ambulatoire, à savoir au domicile du patient, du flux nasalrespiratoire, de l'oxymétrie de pouls, de la fréquence cardiaque, de la position du corps et du ronflement (par mesure de pression).En raison de sa sensibilité et sa spécificité moindre, la PG reste recommandée uniquement en cas de forte probabilité de SAOS. Il existe deux raisons principales à l'origine de la moindre sensibilité de l'examen polygraphique. D'une part, du fait que l'état de veille ou de sommeil n'est pas déterminé avec précision, il y a dilution des événements respiratoires sur l'ensemble de l'enregistrement et non sur la période de sommeil uniquement. D'autre part, en l'absence de tracé EEG, la quantification des micro-éveils est impossible. Il n'est donc pas possible dans l'examen poly graphique, de reconnaître une hypopnée en cas de diminution de flux respiratoire de 20 à 50% non associée à un épisode de désaturation de l'hémoglobine de 3% au moins. Alors que dans l'examen polysomnographique, une telle diminution du flux respiratoire pourrait être associée à un micro-éveil et ainsi comptabilisée en tant qu'hypopnée.De ce constat est né la volonté de trouver un équivalent de micro-éveil en polygraphie, en utilisant les signaux à disposition, afin d'augmenter la sensibilité de l'examen polygraphique.Or plusieurs études ont démontrés que les micro-éveils sont associés à des réactions du système nerveux autonome. Lors des micro-éveils, on met en évidence la survenue d'une vasoconstriction périphérique. La variation du tonus sympathique associée aux micro-éveils peut être mesurée par différentes méthodes. Les variations de l'amplitude de l'onde de pouls mesurée par pulsoxymétrie représentant un marqueur fiable de la vasoconstriction périphérique associée aux micro-réveils, il paraît donc opportun d'utiliser ce marqueur autonomique disponible sur le tracé des polygraphies ambulatoires afin de renforcer la sensibilité de cet examen.Le but de l'étude est d'évaluer la sensibilité des variations de l'amplitude de l'onde de pouls pour détecter des micro-réveils corticaux afin de trouver un moyen d'augmenter la sensibilité de l'examen polygraphique et de renforcer ainsi sont pouvoir diagnostic.L'objectif est de démontrer qu'une diminution significative de l'amplitude de l'onde pouls est concomitante à une activation corticale correspondant à un micro¬réveil. Cette constatation pourrait permettre de déterminer une hypopnée, en polygraphie, par une diminution de 20 à 50% du flux respiratoire sans désaturation de 3% mais associée à une baisse significative de l'amplitude de pouls en postulant que l'événement respiratoire a entraîné un micro-réveil. On retrouve par cette méthode les mêmes critères de scoring d'événements respiratoires en polygraphie et en polysomnographie, et l'on renforce la sensibilité de la polygraphie par rapport au gold standard polysomnographique.La méthode consiste à montrer en polysomnographie qu'une diminution significative de l'amplitude de l'onde de pouls mesurée par pulsoxymétrie est associée à une activation du signal électroencéphalographique, en réalisant une analyse spectrale du tracé EEG lors des baisses d'amplitude du signal d'onde de pouls.Pour ce faire nous avons réalisé une étude rétrospective sur plus de 1000 diminutions de l'amplitude de l'onde de pouls sur les tracés de 10 sujets choisis de manière aléatoire parmi les patients référés dans notre centre du sommeil (CIRS) pour suspicion de trouble respiratoire du sommeil avec somnolence ou symptomatologie diurne.Les enregistrements nocturnes ont été effectués de manière standard dans des chambres individuelles en utilisant le système d'acquisition Embla avec l'ensemble des capteurs habituels. Les données ont été par la suite visuellement analysées et mesurées en utilisant le software Somnologica version 5.1, qui fournit un signal de l'amplitude de l'onde de pouls (puise wave amplitude - PWA).Dans un premier temps, un technicien du sommeil a réalisé une analyse visuelle du tracé EEG, en l'absence des données du signal d'amplitude d'onde de pouls. Il a déterminé les phases d'éveil et de sommeil, les stades du sommeil et les micro¬éveils selon les critères standards. Les micro-éveils sont définis lors d'un changement abrupt dans la fréquence de l'EEG avec un pattern d'ondes thêta-alpha et/ou une fréquence supérieure à 16 Hz (en l'absence de fuseau) d'une durée d'au minimum trois secondes. Si cette durée excède quinze secondes, l'événement correspond à un réveil.Puis, deux investigateurs ont analysé le signal d'amplitude d'onde de pouls, en masquant les données du tracé EEG qui inclut les micro-éveils. L'amplitude d'onde de pouls est calculée comme la différence de valeur entre le zénith et le nadir de l'onde pour chaque cycle cardiaque. Pour chaque baisse de l'amplitude d'onde de pouls, la plus grande et la plus petite amplitude sont déterminées et le pourcentage de baisse est calculé comme le rapport entre ces deux amplitudes. On retient de manière arbitraire une baisse d'au moins 20% comme étant significative. Cette limite a été choisie pour des raisons pratiques et cliniques, dès lors qu'elle représentait, à notre sens, la baisse minimale identifiable à l'inspection visuelle. Chaque baisse de PWA retenue est divisée en 5 périodes contiguës de cinq secondes chacune. Deux avant, une pendant et deux après la baisse de PWA.Pour chaque période de cinq secondes, on a pratiqué une analyse spectrale du tracé EEG correspondant. Le canal EEG C4-A1 est analysé en utilisant la transformée rapide de Fourier (FFT) pour chaque baisse de PWA et pour chaque période de cinq secondes avec une résolution de 0.2 Hz. La distribution spectrale est catégorisée dans chaque bande de fréquence: delta (0.5 à 4.0 Hz); thêta (4.1 à 8.0Hz); alpha (8.1 à 12.0 Hz); sigma (12.1 à 16 Hz) et beta (16.1 à 30.0 Hz). La densité de puissance (power density, en μΥ2 ) pour chaque bande de fréquence a été calculée et normalisée en tant que pourcentage de la puissance totale. On a déterminé, ensuite, la différence de densité de puissance entre les 5 périodes par ANOVA on the rank. Un test post hoc Tukey est été utilisé pour déterminer si les différences de densité de puissance étaient significatives. Les calculs ont été effectués à l'aide du software Sigmastat version 3.0 (Systat Software San Jose, California, USA).Le principal résultat obtenu dans cette étude est d'avoir montré une augmentation significative de la densité de puissance de l'EEG pour toutes les bandes de fréquence durant la baisse de l'amplitude de l'onde de pouls par rapport à la période avant et après la baisse. Cette augmentation est par ailleurs retrouvée dans la plupart des bande de fréquence en l'absence de micro-réveil visuellement identifié.Ce résultat témoigné donc d'une activation corticale significative associée à la diminution de l'onde de pouls. Ce résulat pourrait permettre d'utiliser les variations de l'onde de pouls dans les tracés de polygraphie comme marqueur d'une activation corticale. Cependant on peut dire que ce marqueur est plus sensible que l'analyse visuelle du tracé EEG par un technicien puisque qu'on notait une augmentation de lactivité corticale y compris en l'absence de micro-réveil visuellement identifié. L'application pratique de ces résultats nécessite donc une étude prospective complémentaire.

Molecular identification and characterization of the Arabidopsis delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-coenzyme A isomerase, a peroxisomal enzyme participating in the beta-oxidation cycle of unsaturated fatty acids.

Degradation of unsaturated fatty acids through the peroxisomal beta-oxidation pathway requires the participation of auxiliary enzymes in addition to the enzymes of the core beta-oxidation cycle. The auxiliary enzyme delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-coenzyme A (CoA) isomerase has been well studied in yeast (Saccharomyces cerevisiae) and mammals, but no plant homolog had been identified and characterized at the biochemical or molecular level. A candidate gene (At5g43280) was identified in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) encoding a protein showing homology to the rat (Rattus norvegicus) delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, and possessing an enoyl-CoA hydratase/isomerase fingerprint as well as aspartic and glutamic residues shown to be important for catalytic activity of the mammalian enzyme. The protein, named AtDCI1, contains a peroxisome targeting sequence at the C terminus, and fusion of a fluorescent protein to AtDCI1 directed the chimeric protein to the peroxisome in onion (Allium cepa) cells. AtDCI1 expressed in Escherichia coli was shown to have delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase activity in vitro. Furthermore, using the synthesis of polyhydroxyalkanoate in yeast peroxisomes as an analytical tool to study the beta-oxidation cycle, expression of AtDCI1 was shown to complement the yeast mutant deficient in the delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, thus showing that AtDCI1 is also appropriately targeted to the peroxisome in yeast and has delta(3,5),delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase activity in vivo. The AtDCI1 gene is expressed constitutively in several tissues, but expression is particularly induced during seed germination. Proteins showing high homology with AtDCI1 are found in gymnosperms as well as angiosperms belonging to the Monocotyledon or Dicotyledon classes.

Involvement of microRNAs in the cytotoxic effects exerted by proinflammatory cytokines on pancreatic beta-cells.

OBJECTIVE: Pancreatic beta-cells exposed to proinflammatory cytokines display alterations in gene expression resulting in defective insulin secretion and apoptosis. MicroRNAs are small noncoding RNAs emerging as key regulators of gene expression. Here, we evaluated the contribution of microRNAs to cytokine-mediated beta-cell cytotoxicity. RESEARCH DESIGN AND METHODS: We used global microarray profiling and real-time PCR analysis to detect changes in microRNA expression in beta-cells exposed to cytokines and in islets of pre-diabetic NOD mice. We assessed the involvement of the microRNAs affected in cytokine-mediated beta-cell failure by modifying their expression in insulin-secreting MIN6 cells. RESULTS: We found that IL-1beta and TNF-alpha induce the expression of miR-21, miR-34a, and miR-146a both in MIN6 cells and human pancreatic islets. We further show an increase of these microRNAs in islets of NOD mice during development of pre-diabetic insulitis. Blocking miR-21, miR-34a, or miR-146a function using antisense molecules did not restore insulin-promoter activity but prevented the reduction in glucose-induced insulin secretion observed upon IL-1beta exposure. Moreover, anti-miR-34a and anti-miR-146a treatment protected MIN6 cells from cytokine-triggered cell death. CONCLUSIONS: Our data identify miR-21, miR-34a, and miR-146a as novel players in beta-cell failure elicited in vitro and in vivo by proinflammatory cytokines, notably during the development of peri-insulitis that precedes overt diabetes in NOD mice.

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor beta/delta in the Brain: Facts and Hypothesis.

peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear receptors acting as lipid sensors. Besides its metabolic activity in peripheral organs, the PPAR beta/delta isotype is highly expressed in the brain and its deletion in mice induces a brain developmental defect. Nevertheless, exploration of PPARbeta action in the central nervous system remains sketchy. The lipid content alteration observed in PPARbeta null brains and the positive action of PPARbeta agonists on oligodendrocyte differentiation, a process characterized by lipid accumulation, suggest that PPARbeta acts on the fatty acids and/or cholesterol metabolisms in the brain. PPARbeta could also regulate central inflammation and antioxidant mechanisms in the damaged brain. Even if not fully understood, the neuroprotective effect of PPARbeta agonists highlights their potential benefit to treat various acute or chronic neurological disorders. In this perspective, we need to better understand the basic function of PPARbeta in the brain. This review proposes different leads for future researches.