The role of the vacuolar H+ - ATPase in membrane fusion

RésuméLa H+-ATPase vacuolaire (V-ATPase) est un complexe enzymatique composé de deux secteurs multimériques (VQ et Vi) dont l'association dans la cellule est réversible. Le secteur intramembranaire de la V-ATPase (V0) interagit physiquement avec des protéines SNARE et stimule la fusion homotypique des vacuoles de la levure (lysosomes), la sécrétion de neurotransmetteurs et d'insuline, la fusion entre phagosome et lysosome ainsi que la sécrétion des corps multivésiculaires par un mécanisme inconnu. Dans cette étude j'ai identifié des résidues d'acides amines situés dans des sous-unités de V0 impliqués dans le mécanisme de fusion des vacuoles mais non essentiels pour l'acidification vacuolaire par la V-ATPase. j'ai utilisé un protocole de mutagenèse aléatoire pour produire des libraries de mutants des sous unités de V0. Ces libraries ont été analysées in vivo afin d'identifier des alleles qui permettent la translocation des protons mais produisent une vacuole fragmentée, phénotype indiquant un défaut dans la fusion membranaire. Les vacuoles des mutants ont été isolées et caractéisées en utilisant une grande variété d'outils biochimiques pour déterminer précisément l'impact des différentes mutations sur l'accomplissement d'événements clés du processus de fusion.J'ai identifié des mutations associées à des défauts spécifiques de la fusion dans plusieurs sous-unités de V0. Dans les protéolipides c, c' et c" ces mutations se concentrent dans la partie cytosolique des domaines transmembranaires. Elles renforcent les associations entre les secteurs de la V-ATPase et entre V0 et les SNAREs. Dans la fusion vacuolaire ces mutations permettent la formation de complexes SNAREs en trans mais inhibent l'induction de la fusion. Par contre, la deletion de la sous- unité d influence les étapes de la fusion qui précèdent la formation des complexes trans-SNAREs. Mes résultats démontrent que V0 joue des rôles différents dans plusieurs étapes de la fusion et que ces fonctions sont liées au système des SNAREs. Ils différencient génétiquement les activités de V0 dans la translocation des protons et dans la fusion et identifient de nombreux résidus importants pour la fusion vacuolaire. De plus, compte tenu de la grande conservation de sequence des protéolipides chez les eukaryotes les mutations identifiées dans cette l'étude apportent de nouvelles informations pour analyser la fonction de V0 dans des organismes multicellulaires pour lesquels la function catalytique de la V-ATPase est essentielle à la survie.Résumé pour le large publicLe transport de protéines et de membranes est important pour maintenir la fonction des organelles dans la cellule. Il s'excerce au niveau des vesicules. La fusion membranaire est un processus élémentaire de ce transport. Pour fusionner deux membranes, il faut la coordination de deux activités: le rapprochement et la déstabiiization des deux membranes. La collaboration d'un ensemble de proteins conservés chez les eukaryotes, est nécessaire pour catalyser ces activités. Les proteins SNAREs sont les protagonistes principaux dans la fusion membranaire. Néanmoins, d'autres protéines, comme des Rab-GTPases et des chaperonnes, sont nécessaires pour permettre ce phénomène de fusion. Toutes ces protéines sont temporairement associées avec les SNAREs et leur fonction dans la fusion membranaire est souvent directement liée à leur activité dans cette association. Le secteur transmembranaire V0 de la V-ATPase rnteragit avec des SNAREs et est essentiel pour la fusion dans une variété de systèmes modèles comme la mouche, la souris et la levure. Le secteur V0 est composé de six protéines différentes. Avec te secteur Va, qui réside dans le cytosol, il forme la V-ATPase dont la fonction principale est l'acidification des organelles par translocation des protons à travers la membrane par un mécanisme ressemblant à celui d'une pompe. V0joue un role dans la fusion membranaire, indépendamment de son activité catalytique liée au pompage des protons, et ce rôle est encore largement méconnu à ce jour. Le but de ma thèse était de mieux comprendre l'implication de V0 dans ce contexte.Pour étudier des activités liées à la V-ATPase, la levure est un excellent modèle d'étude car elle survie à une inactivation de l'enzyme alors que le meme traitement serait léthal pour des organismes multicellulaires. Dans ma thèse j'ai utilisé la fusion homotypique de la vacuole de levure comme système modèle pour étudier le rôle de V0 dans la fusion. J'ai muté des gènes qui encodent des sous- unités de V0 et les ai introduit dans des souches privées des gènes respectifs. Dans les librairies de souches portant différentes versions de ces gènes j'ai cherché des clones exprimant une V-ATPase intacte et fonctionnelle mais qui possèdent une vacuole fragmentée. Le plus souvent, une vacuole fragmentée indique un défaut dans la fusion vacuolaire. Dans les trois types de protéolipides qui composent un cylindre dans le secteur V0, j'ai trouvé des clones avec une vacuole fragmentée. Après avoir isolé les mutations responsable de ce type de morphologie vacuolaire, j'ai isolé les vacuoles de ces clones pour étudier leur activités dans différentes étapes de la fusion vacuolaire. Les résultats de ces analyses mettent en évidence une implication de V0 dans plusieurs étapes de la fusion vacuolaire. Certaines mutations sélectionnées dans mon étude inhibent une étape précoce de la fusion qui inclue la dissociation des complexes SNARE, tandis que d'autres mutations inhibent une étape tardive du processus de fusion qui inclue la transmission d'une force disruptive dans la membrane.AbstractThe membrane-integral V0 sector of the vacuolar H+-ATPase (V-ATPase) interacts with SNARE proteins. V0 stimulates fusion between yeast vacuoles (lysosomes) (Peters et al., 2001b), secretion of neurotransmitters and insulin (Hiesinger et al., 2005a, Sun-Wada et al., 2006a), phagosome-lysosome fusion (Peri and Nusslein-Volhard, 2008) and secretion of multivesicular bodies (Liegeois et al., 2006b) by a yet unknown mechanism. In my thesis, I identified sites in V0 subunits that are involved in yeast vacuole fusion but dispensable for the proton pumping by the V-ATPase. I randomly mutagenized V0 subunits and screened in vivo for mutant alleles that support proton pumping but cause fragmented vacuoles, a phenotype indicative of a fusion defect. Mutant vacuoles were isolated and analyzed in a cell-free system, allowing assay of key events in fusion, such as trans-SNARE pairing, lipid transition and fusion pore opening (Reese et al., 2005b).Mutants with selective fusion defects were found in several V0 subunits. In the proteolipids c, c' and c", critical mutations are concentated in the cytosolic half of the transmembrane domains. These mutations rendered the V-ATPase holoenzyme more stable and modulated V0-SNARE associations. In vacuole fusion critical proteolipid mutations permitted trans-SNARE pairing but impeded the induction of lipid flow between the membranes. Deletion of subunit d, by contrast, influenced early stages of fusion that precede trans-SNARE pairing. My results show that V0 acts in several steps of the fusion process and that its function is intimately connected to the SNARE system. They genetically separate the proton pump and fusion activities of V0 and identify numerous critical residues. Given the high sequence conservation of proteolipids in eukaryotic life, the identified mutations may be helpful in analyzing the fusion function of V0 also in mammalian cells, where V- ATPase pump function is essential for survival.

Herniectomie percutanée sous guidage scanner : 7 ans d?experience.

Objectifs: Relater notre expérience des herniectomies sous guidage scanner des conflits disco-radiculaires résistants au traitement médical et aux infiltrationsradio-guidées. Decrire les techniques, indications, contre-indications et limites de ces procédures. Matériels et méthodes: De janvier 2004 à janvier 2011, plus de 1000 herniectomies ont été réalisées dans notre institution. L'intervention se déroule en salle de scanner interventionnelavec arceau de scopie. Ce guidage permet de positionner le matériel d'extraction exactement dans la hernie discale. Résultats: Les herniectomies sont réalisées lorsque l'indication chirurgicale classique est posée . Le principe de l'intervention est similaire à la chirurgie standard , et consisteen une extraction du matériel nucléaire hernié sous-ligamentaire, mais sous anesthésie locale et percutané. Notre expérience confirme que cette procédure estune alternative mini-invasive très efficace dans les positions latérales et foraminales en raison de leur accès direct facile au scanner . Les résultats statistiquesdétaillés seront exposés. Conclusion: La herniectomie sous guidage scanner est une intervention tres efficace dans les conflits disco -radiculaires en particulier foraminaux. Elle est devenu en moinsde 7 ans dans notre institution l'intervention de première intention dans le traitement de la hernie foraminale résistante aux thérapeutiques médicales .

The biology of cancer stem cells : part 1: nuclear translocation of CD44 : part 2: IMP2 in glioblastoma cancer stem cells

SummaryCancer stem cells (CSC) are poorly differentiated, slowly proliferating cells, with high tumorigenic potential. Some of these cells, as it has been shown in leukemia, evade chemo- and radiotherapy and recapitulate the tumor composed of CSC and their highly proliferative progeny. Therefore, understanding the molecular biology of those cells is crucial for improvement of currently used anti-cancer therapies.This work is composed of two CSC-related projects. The first deals with CD44, a frequently used marker of CSC; the second involves Imp2 and its role in CSC bioenergetics. PART 1. CD44 is a multifunctional transmembrane protein involved in migration, homing, adhesion, proliferation and survival. It is overexpressed in many cancers and its levels are correlated with poor prognosis. CD44 is also highly expressed by CSC and in many malignancies it is used for CSC isolation.In the present work full-lenght CD44 nuclear localization was studied, including the mechanism of nuclear translocation and its functional role in the nucleus. Full-length CD44 can be found in nuclei of various cell types, regardless of their tumorigenic potential. For nuclear localization, CD44 needs to be first inserted into the cell membrane, from which it is transported via the endocytic pathway. Upon binding to transportinl it is translocated to the nucleus. The nuclear localization signal recognized by transportinl has been determined as the first 20 amino acids of the membrane proximal intracellular domain. Nuclear export of CD44 is facilitated by exportin Crml. Investigation of the function of nuclear CD44 revealed its implication in de novo RNA synthesis.PART 2. Glioblastoma multiforme is the most aggressive and most frequent brain malignancy. It was one of the first solid tumors from which CSC have been isolated. Based on the similarity between GBM CSC and normal stem cells expression of an oncofetal mRNA binding protein Imp2 has been investigated.Imp2 is absent in normal brain as well as in low grade gliomas, but is expressed in over 75% GBM cases and its expression is higher in CSC compared to their more differentiated counterparts. Analysis of mRNA transcripts bound by Imp2 and its protein interactors revealed that in GBM CSC Imp2 may be implicated in mitochondrial metabolism. Indeed, shRNA mediated silencing of protein expression led to decreased mitochondrial activity, decreased oxygen consumption and decreased activity of respiratory chain protein complex I. Moreover, lack of Imp2 severely affected self-renewal and tumorigenicity of GBM CSC. Experimental evidence suggest that GBM CSC depend on mitochondrial oxidative phosphorylation as an energy producing pathway and that Imp2 is a novel regulator of this pathway.RésuméLes cellules cancéreuses souches sont des cellules peu différentiées, à proliferation lente et hautement tumorigénique. Ces cellules sont radio-chimio résistantes et sont capable reformer la tumeur dans sont intégralité, reproduisant l'hétérogénéité cellulaire présent dans la tumeur d'origine. Pour améliorer les therapies antitumorales actuelles il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires qui caractérisent cette sous-population de cellules hautement malignes.Ce travail de thèse se compose de deux projets s'articulant autour du même axe :Le CD44 est une protéine multifonctionnelle et transmembranaire très souvent utilisée comme marqueur de cellules souches tumorales dans différents cancers. Elle est impliquée dans la migration, l'adhésion, la prolifération et la survie des cellules. Lors de ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés à la localisation cellulaire du CD44, ainsi qu'aux mécanismes permettant sa translocation nucléaire. En effet, bien que principalement décrit comme un récepteur de surface transmembranaire, le CD44 sous sa forme entière, non clivée en peptides, peut également être observé à l'intérieur du noyau de diverses cellules, quel que soit leur potentiel tumorigénique. Pour passer ainsi d'un compartiment cellulaire à un autre, le CD44 doit d'abord être inséré dans la membrane plasmique, d'où il est transporté par endocytose jusqu'à l'intérieur du cytoplasme. La transportai permet ensuite la translocation nucléaire du CD44 via une « séquence signal » contenue dans les 20 acides aminés du domaine cytoplasmique qui bordent la membrane. A l'inverse, le CD44 est exporté du noyau grâce à l'exportin Crml. En plus des mécanismes décrits ci-dessus, cette étude a également mis en évidence l'implication du CD44 dans la synthèse des ARN, d'où sa présence dans le noyau.Le glioblastome est la plus maligne et la plus fréquente des tumeurs cérébrales. Dans ce second projet de recherche, le rôle de IMP2 dans les cellules souches tumorales de glioblastomes a été étudié. La présence de cette protéine oncofoetale a d'abord été mise en évidence dans 75% des cas les plus agressifs des gliomes (grade IV, appelés glioblastomes), tandis qu'elle n'est pas exprimée dans les grades I à III de ces tumeurs, ni dans le cerveau sain. De plus, IMP2 est apparue comme étant davantage exprimée dans les cellules souches tumorales que dans les cellules déjà différenciées. La baisse de l'expression de IMP2 au moyen de shRNA a résulté en une diminution de l'activité mitochondriale, en une réduction de la consommation d'oxygène ainsi qu'en une baisse de l'activité du complexe respiratoire I.L'inhibition de IMP2 a également affecté la capacité de renouvellement de la population des cellules souches tumorales ainsi que leur aptitude à former des tumeurs.Lors de ce travail de thèse, une nouvelle fonction d'un marqueur de cellules souches tumorales a été mise en évidence, ainsi qu'un lien important entre la bioénergétique de ces cellules et l'expression d'une protéine oncofoetale.

Natural variation in learning ability in "Drosophila melanogaster"

Learning is the ability of an organism to adapt to the changes of its environment in response to its past experience. It is a widespread ability in the animal kingdom, but its evolutionary aspects are poorly known. Learning ability is supposedly advantageous under some conditions, when environmental conditions are not too stable - because in this case there is no need to learn to predict any event in the environment - and not changing too fast - otherwise environmental cues cannot be used because they are not reliable. Nevertheless, learning ability is also known to be costly in terms of energy needed for neuronal synthesis, memory formation, initial mistakes. During my PhD, I focused on the study of genetic variability of learning ability in natural populations. Genetic variability is the basis on which natural selection and genetic drift can act. How does learning ability vary in nature? What are the roles of additive genetic variation or maternal effects in this variation? Is it involved in evolutionary trade-offs with other fitness-related traits?¦I investigated a natural population of fruit fly, Drosophila melanogaster, as a model organism. Its learning ability is easy to measure with associative memory tests. I used two research tools: multiple inbred and isofemale lines derived from a natural population as a representative sample. My work was divided into three parts.¦First, I investigated the effects of inbreeding on aversive learning (avoidance of an odor previously associated with mechanical shock). While the inbred lines consistently showed reduced egg-to-adult viability by 28 %, the effects of inbreeding on learning performance was 18 % and varied among assays, with a trend to be most pronounced for intermediate conditioning intensity. Variation among inbred lines indicates that ample genetic variance for learning was segregating in the base population, and suggests that the inbreeding depression observed in learning performance was mostly due to dominance rather than overdominance. Across the inbred lines, learning performance was positively correlated with the egg-to-adult viability. This positive genetic correlation contradicts previous studies which observed a trade-off between learning ability and lifespan or larval competitive ability. It suggests that much of the genetic variation for learning is due to pleiotropic effects of genes affecting other functions related to survival. Together with the overall mild effects of inbreeding on learning performance, this suggests that genetic variation specifically affecting learning is either very low, or is due to alleles with mostly additive (semi-dominant) effects. It also suggests that alleles reducing learning performance are on average partially recessive, because their effect does not appear in the outbred base population. Moreover, overdominance seems unlikely as major cause of the inbreeding depression, because even if the overall mean of the inbred line is smaller than the outbred base population, some of the inbred lines show the same learning score as the outbred base population. If overdominance played an important part in inbreeding depression, then all the homozygous lines should show lower learning ability than¦outbred base population.¦In the second part of my project, I sampled the same natural population again and derived isofemale lines (F=0.25) which are less adapted to laboratory conditions and therefore are more representative of the variance of the natural population. They also showed some genetic variability for learning, and for three other fitness-related traits possibly related with learning: resistance to bacterial infection, egg-to-adult viability and developmental time. Nevertheless, the genetic variance of learning ability did not appear to be smaller than the variance of the other traits. The positive correlation previously observed between learning ability and egg- to-adult viability did not appear in isofemale lines (nor a negative correlation). It suggests that there was still genetic variability within isofemale lines and that they did not fix the highly deleterious pleiotropic alleles possibly responsible for the previous correlation.¦In order to investigate the relative amount of nuclear (additive and non-additive effects) and extra-nuclear (maternal and paternal effect) components of variance in learning ability and other fitness-related traits among the inbred lines tested in part one, I performed a diallel cross between them. The nuclear additive genetic variance was higher than other components for learning ability and survival to learning ability, but in contrast, maternal effects were more variable than other effects for developmental traits. This suggests that maternal effects, which reflects effects from mitochondrial DNA, epigenetic effects, or the amount of nutrients that are invested by the mother in the egg, are more important in the early stage of life, and less at the adult stage. There was no additive genetic correlation between learning ability and other traits, indicating that the correlation between learning ability and egg-to-adult viability observed in the first pat of my project was mostly due to recessive genes.¦Finally, my results showed that learning ability is genetically variable. The diallel experiment showed additive genetic variance was the most important component of the total variance. Moreover, every inbred or isofemale line showed some learning ability. This suggested that alleles impairing learning ability are eliminated by selection, and therefore that learning ability is under strong selection in natural populations of Drosophila. My results cannot alone explain the maintenance of the observed genetic variation. Even if I cannot eliminate the hypothesis of pleiotropy between learning ability and the other fitness-related traits I measured, there is no evidence for any trade-off between these traits and learning ability. This contradicts what has been observed between learning ability and other traits like lifespan and larval competitivity.¦L'apprentissage représente la capacité d'un organisme à s'adapter aux changement de son environnement au cours de sa vie, en réponse à son expérience passée. C'est une capacité très répandue dans le règne animal, y compris pour les animaux les plus petits et les plus simples, mais les aspects évolutifs de l'apprentissage sont encore mal connus. L'apprentissage est supposé avantageux dans certaines conditions, quand l'environnement n'est ni trop stable - dans ce cas, il n'y a rien à apprendre - ni trop variable - dans ce cas, les indices sur lesquels se reposer changent trop vite pour apprendre. D'un autre côté, l'apprentissage a aussi des coûts, en terme de synthèse neuronale, pour la formation de la mémoire, ou de coûts d'erreur initiale d'apprentissage. Pendant ma thèse, j'ai étudié la variabilité génétique naturelle des capacités d'apprentissage. Comment varient les capacités d'apprentissage dans la nature ? Quelle est la part de variation additive, l'impact des effets maternel ? Est-ce que l'apprentissage est impliqué dans des interactions, de type compromis évolutifs, avec d'autres traits liés à la fitness ?¦Afin de répondre à ces questions, je me suis intéressée à la mouche du vinaigre, ou drosophile, un organisme modèle. Ses capacités d'apprentissage sont facile à étudier avec un test de mémoire reposant sur l'association entre un choc mécanique et une odeur. Pour étudier ses capacités naturelles, j'ai dérivé de types de lignées d'une population naturelle: des lignées consanguines et des lignées isofemelles.¦Dans une première partie, je me suis intéressée aux effets de la consanguinité sur les capacités d'apprentissage, qui sont peu connues. Alors que les lignées consanguines ont montré une réduction de 28% de leur viabilité (proportion d'adultes émergeants d'un nombre d'oeufs donnés), leurs capacités d'apprentissage n'ont été réduites que de 18%, la plus forte diminution étant obtenue pour un conditionnement modéré. En outre, j'ai également observé que les capacités d'apprentissage était positivement corrélée à la viabilité entre les lignées. Cette corrélation est surprenante car elle est en contradiction avec les résultats obtenus par d'autres études, qui montrent l'existence de compromis évolutifs entre les capacités d'apprentissage et d'autres traits comme le vieillissement ou la compétitivité larvaire. Elle suggère que la variation génétique des capacités d'apprentissage est due aux effets pleiotropes de gènes récessifs affectant d'autres fonctions liées à la survie. Ces résultats indiquent que la variation pour les capacités d'apprentissage est réduite comparée à celle d'autres traits ou est due à des allèles principalement récessifs. L'hypothèse de superdominance semble peu vraisemblable, car certaines des lignées consanguines ont obtenu des scores d'apprentissage égaux à ceux de la population non consanguine, alors qu'en cas de superdominance, elles auraient toutes dû obtenir des scores inférieurs.¦Dans la deuxième partie de mon projet, j'ai mesuré les capacités d'apprentissage de lignées isofemelles issues de la même population initiale que les lignées consanguines. Ces lignées sont issues chacune d'un seul couple, ce qui leur donne un taux d'hétérozygosité supérieur et évite l'élimination de lignées par fixation d'allèles délétères rares. Elles sont ainsi plus représentatives de la variabilité naturelle. Leur variabilité génétique est significative pour les capacités d'apprentissage, et trois traits liés à la fois à la fitness et à l'apprentissage: la viabilité, la résistance à l'infection bactérienne et la vitesse de développement. Cependant, la variabilité des capacités d'apprentissage n'apparaît cette fois pas inférieure à celle des autres traits et aucune corrélation n'est constatée entre les capacité d'apprentissage et les autres traits. Ceci suggère que la corrélation observée auparavant était surtout due à la fixation d'allèles récessifs délétères également responsables de la dépression de consanguinité.¦Durant la troisième partie de mon projet, je me suis penchée sur la décomposition de la variance observée entre les lignées consanguines observée en partie 1. Quatre composants ont été examinés: la variance due à des effets nucléaires (additifs et non additifs), et due à des effets parentaux (maternels et paternels). J'ai réalisé un croisement diallèle de toutes les lignées. La variance additive nucléaire s'est révélée supérieure aux autres composants pour les capacités d'apprentissage et la résistance à l'infection bactérienne. Par contre, les effets maternels étaient plus importants que les autres composants pour les traits développementaux (viabilité et vitesse de développement). Ceci suggère que les effets maternels, dus à G ADN mitochondrial, à l'épistasie ou à la quantité de nutriments investis dans l'oeuf par la mère, sont plus importants dans les premiers stades de développement et que leur effet s'estompe à l'âge adulte. Il n'y a en revanche pas de corrélation statistiquement significative entre les effets additifs des capacités d'apprentissage et des autres traits, ce qui indique encore une fois que la corrélation observée entre les capacités d'apprentissage et la viabilité dans la première partie du projet était due à des effets d'allèles partiellement récessifs.¦Au, final, mes résultats montrent bien l'existence d'une variabilité génétique pour les capacités d'apprentissage, et l'expérience du diallèle montre que la variance additive de cette capacité est importante, ce qui permet une réponse à la sélection naturelle. Toutes les lignées, consanguines ou isofemelles, ont obtenu des scores d'apprentissage supérieurs à zéro. Ceci suggère que les allèles supprimant les capacités d'apprentissage sont fortement contre-sélectionnés dans la nature Néanmoins, mes résultats ne peuvent pas expliquer le maintien de cette variabilité génétique par eux-même. Même si l'hypothèse de pléiotropie entre les capacités d'apprentissage et l'un des traits liés à la fitness que j'ai mesuré ne peut être éliminée, il n'y a aucune preuve d'un compromis évolutif pouvant contribuer au maintien de la variabilité.

De la perception à l'apprentissage [From perception to learning]

Dans le domaine de la perception, l'apprentissage est contraint par la présence d'une architecture fonctionnelle constituée d'aires corticales distribuées et très spécialisées. Dans le domaine des troubles visuels d'origine cérébrale, l'apprentissage d'un patient hémi-anopsique ou agnosique sera limité par ses capacités perceptives résiduelles, mais un déficit de reconnaissance visuelle de nature apparemment perceptive, peut également être associé à une altération des représentations en mémoire à long terme. Des réseaux neuronaux distincts pour la reconnaissance - cortex temporal - et pour la localisation des sons - cortex pariétal - ont été décrits chez l'homme. L'étude de patients cérébro-lésés confirme le rôle des indices spatiaux dans un traitement auditif explicite du « where » et dans la discrimination implicite du « what ». Cette organisation, similaire à ce qui a été décrit dans la modalité visuelle, faciliterait les apprentissages perceptifs. Plus généralement, l'apprentissage implicite fonde une grande partie de nos connaissances sur le monde en nous rendant sensible, à notre insu, aux règles et régularités de notre environnement. Il serait impliqué dans le développement cognitif, la formation des réactions émotionnelles ou encore l'apprentissage par le jeune enfant de sa langue maternelle. Le caractère inconscient de cet apprentissage est confirmé par l'étude des temps de réaction sériels de patients amnésiques dans l'acquisition d'une grammaire artificielle. Son évaluation pourrait être déterminante dans la prise en charge ré-adaptative. [In the field of perception, learning is formed by a distributed functional architecture of very specialized cortical areas. For example, capacities of learning in patients with visual deficits - hemianopia or visual agnosia - from cerebral lesions are limited by perceptual abilities. Moreover a visual deficit in link with abnormal perception may be associated with an alteration of representations in long term (semantic) memory. Furthermore, perception and memory traces rely on parallel processing. This has been recently demonstrated for human audition. Activation studies in normal subjects and psychophysical investigations in patients with focal hemispheric lesions have shown that auditory information relevant to sound recognition and that relevant to sound localisation are processed in parallel, anatomically distinct cortical networks, often referred to as the "What" and "Where" processing streams. Parallel processing may appear counterintuitive from the point of view of a unified perception of the auditory world, but there are advantages, such as rapidity of processing within a single stream, its adaptability in perceptual learning or facility of multisensory interactions. More generally, implicit learning mechanisms are responsible for the non-conscious acquisition of a great part of our knowledge about the world, using our sensitivity to the rules and regularities structuring our environment. Implicit learning is involved in cognitive development, in the generation of emotional processing and in the acquisition of natural language. Preserved implicit learning abilities have been shown in amnesic patients with paradigms like serial reaction time and artificial grammar learning tasks, confirming that implicit learning mechanisms are not sustained by the cognitive processes and the brain structures that are damaged in amnesia. In a clinical perspective, the assessment of implicit learning abilities in amnesic patients could be critical for building adapted neuropsychological rehabilitation programs.]

Long-term and long range migration of radioisotopes in terrestrial systems : mechanisms of radioisotopes (Cs, Sr, Pu, Am) mobilization in soils

Summary Artificial radionuclides were released in the environment during the atmospheric nuclear weapon tests and after accidental events involving nuclear industries. As a primary receptor of the deposition, the soil is a very sensitive compartment and understanding the interaction and migration of radionuclides within soils allows the development of scenario for the contamination risk of the population and of the environment. Most available field studies on radionuclides in soils only concern one or two isotopes, mostly 137Cs, and few physico-chemical soil parameters. The purpose of this study was a broader understanding of the radioecology of an Alpine valley. In a first part, we aimed to describe the depth distribution of 137Cs, 90Sr, 239+240Pu, and 241Am within different alpine soils and to identify some stable elements as indicators for accumulating layers. In the central part of the study, the goal was to investigate the repartition of ^Sr and 239Pu between the truly dissolved fraction and the colloidal fraction of the soil solutions and to identify the nature of colloids involved in the adsorption of ^Sr and 239Pu. These results were integrated in an "advection- sorption" transport model seeking to explain the migration of 239Pu and 90Sr within the soils and to assess the importance of colloidal transport for these two isotopes. A further aspect studied was the role of the competition between the radioisotopes (137Cs and 90Sr) and their stable chemical analogues (K and Ca) with respect to plant uptake by different plant species. The results on the depth distribution within the soils showed that 137Cs was mostly retained in the topsoil, to the exception of an organic-rich soil (Histosol 2) receiving important surface runoff, where migration down to a depth of 30 cm was observed. 137Cs depth distribution within the soils was similar to unsupported 210Pb depth distribution. The plant uptake of 137Cs clearly depended on the concentration of exchangeable potassium in the soils. Moreover, we showed that the 137Cs uptake by certain species of the taxonomic orders Poales and Rosales was more sensitive to the increase in exchangeable Κ compared to other orders. Strontium-90 was much more mobile in the soils than 137Cs and depth migration and accumulation in specific AI- and Fe-rich layers were found down to 30 cm. Copper and Ni showed accumulations in these same layers, indicating their potential to be used as indicators for the migration of ^Sr within the soils. In addition, we observed a 90Sr activity peak in the topsoil that can be attributable to recycling of 90Sr by plant uptake. We demonstrated for the first time that a part of 90Sr (at least 40%) was associated with the colloids in organic-rich soil solutions. Therefore, we predict a significant effect of the colloidal migration of ^Sr in organic-rich soil solutions. The plant uptake results for 90Sr indicated a phylogenetic effect between Non-Eudicot and Eudicots: the order Poales concentrating much less 90Sr than Eudicots do. Moreover, we were able to demonstrate that the sensitivity of the 90Sr uptake by 5 different Alpine plant species to the amount of exchangeable Ca was species-independent. Plutonium and 241Am accumulated in the second layer of all soils and only a slight migration deeper than 20 cm was observed. Plutonium and 241Am showed a similar depth distribution in the soils. The model results suggested that the present day migration of 239Pu was very slow and that the uptake by plants was negligible. 239Pu activities between 0.01 to 0.08 mBq/L were measured in the bulk soil solutions. Migration of 239Pu with the soil solution is dominated by colloidal transport. We reported strong evidences that humic substances were responsible of the sorption of 239Pu to the colloidal fraction of the soil solutions. This was reflected by the strong correlation between 239Pu concentrations and the content of (colloidal) organic matter in the soil solution. Résumé Certains radioéléments artificiels ont été disséminés dans l'environnement suite aux essais atmosphériques de bombes nucléaires et suite à des accidents impliquant les industries nucléaires. En tant que récepteur primaire de la déposition, le sol est un compartiment sensible et des connaissances sur les interactions et la migration des radioéléments dans le sol permettent de développer des modèles pour estimer la contamination de la population et de l'environnement. Actuellement, la plupart des études de terrain sur ce sujet concernent uniquement un ou deux radioéléments, surtout le 137Cs et peu d'études intègrent les paramètres du sol pour expliquer la migration des radioéléments. Le but général de cette étude était une compréhension étendue de la radio-écologie d'une vallée alpine. Notre premier objectif était de décrire la distribution en profondeur de 137Cs, ^Sr, 239+240pu et 241Am dans différents sols alpins en relation avec des éléments stables du sol, dans le but d'identifier des éléments stables qui pourraient servir d'indicateurs pour des horizons accumulateurs. L'objectif de la deuxième partie, qui était la partie centrale de l'étude, était d'estimer le pourcentage d'activité sous forme colloïdale du 239Pu et du 90Sr dans les solutions des sols. De plus nous avons déterminé la nature des colloïdes impliqués dans la fixation du ^Sr et 239Pu. Nous avons ensuite intégré ces résultats dans un modèle de transport développé dans le but de décrire la migration du 239Pu et 90Sr dans le sol. Finalement, nous avons étudié l'absorption de 137Cs et 90Sr par les plantes en fonction de l'espèce et de la compétition avec leur élément analogue stable (K et Ca). Les résultats sur la migration en profondeur du 137Cs ont montré que ce radioélément était généralement retenu en surface, à l'exception d'un sol riche en matière organique dans lequel nous avons observé une nette migration en profondeur. Dans tous les sols, la distribution en profondeur du 137Cs était corrélée avec la distribution du 210Pb. L'absorption du 137Cs par les plantes, était dépendante de la concentration en Κ échangeable dans le sol, le potassium étant un compétiteur. De plus, nous avons observé que les espèces ne réagissaient pas de la même manière aux variations de la concentration de Κ échangeable. En effet, les espèces appartenant aux ordres des Poales et des Rosales étaient plus sensibles aux variations de potassium échangeable dans le sol. Dans tous les sols Le 90Sr était beaucoup plus mobile que le 137Cs. En effet, nous avons observé des accumulations de 90Sr dans des horizons riches en Fe et Al jusqu'à 30 cm de profondeur. De plus, le Cu et le Ni montraient des accumulations dans les mêmes horizons que le 90Sr, indiquant qu'il pourrait être possible d'utiliser ces deux éléments comme analogues pour la migration du 90Sr. D'après le modèle développé, le pic de 90Sr dans les premiers centimètres du sol peut être attribué à du recyclage par les plantes. Le 90Sr en solution était principalement sous forme dissoute dans des solutions de sols peu organique (entre 60 et 100% de 90Sr dissous). Par contre, dans des solutions organiques, un important pourcentage de 90Sr (plus de 40%) était associé aux colloïdes. La migration colloïdale du 90Sr peut donc être significative dans des solutions organiques. Comme pour le 137Cs, l'absorption du 90Sr par les plantes dépendait de la concentration de son analogue chimique dans la fraction échangeable du sol. Par contre, les espèces de plantes étudiées avaient la même sensibilité aux variations de la concentration du calcium échangeable. Le plutonium et l'américium étaient accumulés dans le deuxième horizon du sol et nous avons observé seulement une faible migration plus profondément que 20 cm. Selon le modèle, la migration actuelle du plutonium est très lente et l'absorption par les plantes semble négligeable. Nous avons mesuré entre 0.01 et 0.08 mBq/L de 239Pu dans les solutions de sol brutes. La migration du plutonium par la solution du sol est due principalement aux colloïdes, probablement de nature humique. Résumé grand public Dans les années 1950 à 1960, l'environnement a été contaminé par des éléments radioactifs (radioéléments) artificiels provenant des essais des armes atomiques et de l'industrie nucléaire. En effet, durant ces années, les premiers essais de bombes atomiques se faisaient dans l'atmosphère, libérant de grandes quantités d'éléments radioactifs. De plus certains accidents impliquant l'industrie nucléaire civile ont contribué à la dissémination d'éléments radioactifs dans l'environnement. Ce fut par exemple le cas de l'accident de la centrale atomique de Tchernobyl en 1986 qui a causé une importante contamination d'une grande partie de l'Europe par le 137Cs. Lorsqu'ils sont libérés dans l'atmosphère, les radioéléments sont dispersés et transportés par les courants atmosphériques, puis peuvent être déposés dans l'environnement, principalement par les précipitations. Une fois déposés sur le sol, les radioéléments vont interagir avec les composants du sol et migrer plus ou moins vite. La connaissance des interactions des éléments radioactifs avec le sol est donc importante pour prédire les risques de contamination de l'environnement et de l'homme. Le but général de ce travail était d'évaluer la migration de différents éléments radioactifs (césium-137, strontium-90, plutonium et américium-241) à travers le sol. Nous avons choisi un site d'étude en milieu alpin (Val Piora, Tessin, Suisse), contaminé en radioéléments principalement par les retombées de l'accident de Tchernobyl et des essais atmosphériques de bombes atomiques. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la distribution en profondeur des éléments radioactifs dans le sol et l'avons comparée à divers éléments stables. Cette comparaison nous a permit de remarquer que le cuivre et le nickel s'accumulaient dans les mêmes horizons du sol que le strontium-90 et pourraient donc être utilisés comme analogue pour la migration du strontium-90 dans les sols. Dans la plupart des sols étudiés, la migration du césium-137, du plutonium et de l'américium-241 était lente et ces radioéléments étaient donc accumulés dans les premiers centimètres du sol. Par contre, le strontium-90 a migré beaucoup plus rapidement que les autres radioéléments si bien qu'on observe des accumulations de strontium-90 à plus de 30 cm de profondeur. Les radioéléments migrent dans la solution du sol soit sous forme dissoute, soit sous forme colloïdale, c'est-à-dire associés à des particules de diamètre < Ιμηι. Cette association avec des colloïdes permet à des radioéléments peu solubles, comme le plutonium, de migrer plus rapidement qu'attendu. Nous avons voulu savoir quelle était la part de strontium-90 et plutonium associés à des colloïdes dans la solution du sol. Les résultats ont montré que le plutonium en solution était principalement associé à des colloïdes de type organique. Quant au strontium-90, ce dernier était en partie associé à des colloïdes dans des solutions de sol riches en matière organique, par contre, il était principalement sous forme dissoute dans les solutions de sol peu organiques. L'absorption de radioéléments par les plantes représente une voie importante pour le transfert vers la chaîne alimentaire, par conséquent pour la contamination de l'homme. Nous avons donc étudié le transfert du césium-137 et du strontium-90 de plusieurs sols vers différentes espèces de plantes. Les résultats ont montré que l'absorption des radioéléments par les plantes était liée à la concentration de leur analogue chimique (calcium pour le strontium-90 et potassium pour le césium- 137) dans la fraction échangeable du sol. De plus certaines espèces de plantes accumulent significativement moins de strontium-90.

Peroxisome proliferator activated receptor BETA/DELTA as a central player in the skin response to ultra-violets radiation

Previous studies in the lab of Dr. Liliane Michalik, have shown thai the nuclear hormone receptor Peroxisome Proliferator Activated Receptor beta/delta (PPARß/ö) is an important regulator of skin homeostasis, being involved in the regulation of keratinocyte differentiation, inflammation, apoptosis, arid mouse skin wound healing. Studies of PPARß/ö knock out mice have suggested a possible role for this receptor in cancer. However, contradictory observations of the role for PPARß/ö on tumor growth have been published, depending on cellular contexts and biological models. Given the controversial role of PPARß/ö in skin carcinoma development, the main aim of this PhD work has been to further explore the implication of PPARß/ö in skin response to UV and skin tumor growth. This PhD dissertation is divided in four chapters. The first chapter describes the core part of the project, where I explored the changes in miRNA expression in the skin upon chronic UV irradiation of PPARß/ö wild type and knock-out mice. This analysis shed light on a miRNA- PPARß/ö signature and also predicted thai miR-21-3p (previously named miR-21*) is a key regulator of the PPARß/ö-dependent UV response in the pre-lesiona! skin. Using mice acutely UV-irradiated, ! further demonstrated that miR-21-3p is indirectly regulated by PPARß/ö through activation of Transforming Growth Factor (TGFß)-1 under UV exposure. I also show that miR-21-3p is deregulated in human cutaneous squamous celi carcinoma. In cultured keratinocytes, application of a miR-21 -3p mimic oligonucleotide sequence leads to the regulation of lipid metabolism-related pathway. In the second chapter, I demonstrate that the usage of an mRNA/miRNA combined bioinformatics analysis leads to the discovery of important pathways involved in the PPARß/ö-miRNA response of the skin to chronic UV irradiation, indeed, I validated angiogenesis and lipid metabolism as important functions regulated by PPARß/ö in this context. In the third chapter, we demonstrate that PPARß/5 knockout mice have decreased cutaneous squamous cell carcinomas incidence compared to wild type mice and that PPARß/5 directly activates the cSrc kinase gene. In the last chapter, we review novel insights into PPAR functions in keratinocytes and liver, with emphasis on PPARß/ö but also on PPARa. In summary, this PhD study shows that i) PPARß/5 is able to regulate biological function through regulation of miRNAs, and specifically through miR-21-3p, the passenger miRNA of the oncomiR miR-21, and that ii) the PPARß/5-dependent skin response to UV involves the regulation of angiogenesis and lipid metabolism. Furthermore, the bioinformatics study highlights the relevance of performing integrated mRNA and miRNA genome-wide studies in order to better screen mRNAs and/or miRNAs of interest in the biological context of diseases. - Des études préalables dans le laboratoire du Dr. Liliane Michalik ont démontré que le récepteur nucléaire PPARß/5 est un régulateur important de l'homéostasie de la peau, étant impliqué dans la régulation de la différenciation des keratinocytes, dans l'inflammation, dans l'apoptose et dans la cicatrisation de la peau chez !a souris. L'étude de souris knock-out pour le gène PPARß/5, ont suggérées un rôle possible de ce récepteur dans le cancer. Cependant, des observations opposées ont été publiées suggérant un rôle pro- ou anti- cancer selon le tissue impliqué et le type- cellulaire. En considérant cette controverse autour du rôle de PPARß/5 dans le développement des cancers de la peau, le but principal de mon projet de recherche aura été d'approfondir l'exploration du rôle de PPARß/5 dans la réponse de la peau aux UVs et dans le développement du cancer. Cette dissertation de thèse est divisée en quatre parties. Une première partie, représentant le coeur de mon travail de recherche, décrit la découverte de l'implication des microRNAs (rniRNAs) dans la réponse aux UVs de PPARß/ö et plus spécifiquement l'implication du miRNA miR- 21 -3p (précédemment nommé miR-21*). En étudiant un modèle de souris irradiées de manière aigüe aux UVs, nous montrons que ia régulation de miR-21-3p est PPARß/ö-däpenaante et que cette régulation à lieu par l'intermédiaire du facteur de transcription TGFß-1. Dans des cultures de keratinocytes Humains, la transfecticn d'une séquence oligonucléotidique similaire à celle de miR-21-3p (mimic), montre l'implication de rniR-21-3p dans des fonctions importantes pour le développement des cancers telles que le métabolisme des lipides. Dans un second chapitre, nous montrons que l'usage d'une méthode bioinformatique combinant l'expression des ARN messagers et des miRNAs permet de mettre en évidence des fonctions biologiques importantes lors de ia réponse de PPARß/ö à l'irradiation chronique. L'angiogenèse, le stress oxydatif et le métabolisme des lipides font partie de ces fonctions régulées par PPARß/5 dans la peau irradiée aux UVs. Nous mettons également en évidence la régulation du gène LpcatS par PPARß/5 dans la peau irradiée aux UV ainsi que dans des keratinocytes humains suggérant un rôle pour PPARß/5 dans le remodelage des lipides membranaires. Dans une troisième partie, nous établissons un lien entre la régulation de l'oncogène Src et l'activation de PPARß/5 dans les carcinomes spinocellulaires de la peau. Finalement dans un quatrième chapitre, nous faisons une revue des dernières recherches portées sur le rôle de PPARß/5 et de PPARa dans le foie et ia peau. En résumé ce projet de thèse représente un avancement pour la recherche sur rimplication de PPARß/5 dans la réponse aux UVs de la peau. Pour la première fois, un lien est établi entre ce facteur de transcription et la régulation de microRNAs dans le cadre du carcinome spinocellulare. Jusqu'alors resté dans l'ombre de rniR-21-5p, miR-21-3p est en fait fortement augmenté à la fois dans un modèle de souris d'irradiation aux UVs ainsi que dans ie carcinome spinocellulare chez i'humain. De nouvelles fonctions biologiques pour PPARß/5 ont été également mises en évidence dans ce travail, comme la régulation de l'angiogenèse ou du métabolisme des lipides dans Sa peau. De plus cette dissertation valorise l'intérêt d'une association entre le travail de laboratoire et celui de la bioinformatique.

Diminution des appréhensions dans la lombalgie chronique : retour au travail accéléré

Introduction. - La lombalgie chronique, définie comme une douleur de plus de 3 mois, est un état cher pour la société. Les patients les plus chers sont ceux avec des longs arrêts de travail. Plusieurs études ont été fait sur des modèles de réhabilitation travaillant en augmentant la confiance corporelle de ses patients : une possibilité reste un programme interdisciplinaire. IL traite la situation déconditionnée dans sa globalité de manière interdisciplinaire. Le but de cette étude était d'analyser la diminution de l'appréhension à l'aide de questionnaires : un concernant la capacité de travail (PACT) et un sur l'appréhension (FABQ). Patients et Méthodes. - Nous avons étudié les résultants de 520 de nos patients ayant accomplis un programme interdisciplinaire, et qui ont été suivis sur 24 mois. Le programme contenait un réentraînement physique, du work hardening, le tout dans un contexte cognitive-comportemental. Nous avons analysé la diminution de l'appréhension durant le temps à l'aide de questionnaires d'autoévaluation (PACT et FABQ). Résultats. - Nous avons vu une claire augmentation de la capacité de travail globale entre le début du programme et à 24 mois faisant passer de 48 à 80,4 %. En parallèle il y avait une augmentation subjective de la capacité physique mesurée par le Pact. Cette augmentation était corrélée avec une diminution de l'appréhension selon le Fabq. Le retour au travail n'était pas corrélé à une amélioration des performances physiques, mais dans moins d'appréhension. Conclusion. - Dans la lombalgie chronique, avec des patients ayant des nombreux arrêts de travail, un programme interdisciplinaire de réhabilitation a un effet positif sur l'appréhension. Cette corrélation était encore présente sur le côté psychologique avec moins d'appréhensions et une augmentation globale au SF 36. Ainsi une meilleure confiance corporelle reste un facteur important dans les programmes de restauration fonctionnelle.

Role of the epithelial sodium channel (ENaC) in the epidermal barrier function of the skin

Abstract In humans, the skin is the largest organ of the body, covering up to 2m2 and weighing up to 4kg in an average adult. Its function is to preserve the body from external insults and also to retain water inside. This barrier function termed epidermal permeability barrier (EPB) is localized in the functional part of the skin: the epidermis. For this, evolution has built a complex structure of cells and lipids sealing the surface, the stratum corneum. The formation of this structure is finely tuned since it is not only formed once at birth, but renewed all life long. This active process gives a high plasticity and reactivity to skin, but also leads to various pathologies. ENaC is a sodium channel extensively studied in organs like kidney and lung due to its importance in regulating sodium homeostasis and fluid volume. It is composed of three subunits α, ß and r which are forming sodium selective channel through the cell membrane. Its presence in the skin has been demonstrated, but little is known about its physiological role. Previous work has shown that αENaC knockout mice displayed an abnormal epidermis, suggesting a role in differentiation processes that might be implicated in the EPB. The principal aim of this thesis has been to study the consequences for EPB function in mice deficient for αENaC by molecular and physiological means and to investigate the underlying molecular mechanisms. Here, the barrier function of αENaC knockout pups is impaired. Apparently not immediately after birth (permeability test) but 24h later, when evident water loss differences appeared compared to wildtypes. Neither the structural proteins of the epithelium nor the tights junctions showed any obvious alterations. In contrary, stratum corneum lipid disorders are most likely responsible for the barrier defect, accompanied by an impairment of skin surface acidification. To analyze in details this EPB defect, several hypotheses have been proposed: reduced sensibility to calcium which is the key activator far epidermal formation, or modification of ENaC-mediated ion fluxes/currents inside the epidermis. The cellular localization of ENaC and the action in the skin of CAPl, a positive regulator of ENaC, have been also studied in details. In summary, this study clearly demonstrates that ENaC is a key player in the EPB maintenance, because αENaC knockout pups are not able to adapt to the new environment (ex utero) as efficiently as the wildtypes, most likely due to impaired of sodium handling inside the epidermis. Résumé Chez l'homme, la peau est le plus grand organe, couvrant presque 2m2 et pesant près de 4kg chez l'adulte. Sa fonction principale est de protéger l'organisme des agressions extérieures mais également de conserver l'eau à l'intérieur du corps. Cette fonction nommée barrière épithéliale est localisée dans la partie fonctionnelle de la peau : l'épiderme. A cette fin, l'évolution s'est dotée d'une structure complexe composée de cellules et de lipides recouvrant la surface, la couche cornée. Sa formation est finement régulée, car elle n'est pas seulement produite à la naissance mais constamment renouvelée tout au long de la vie, ce qui lui confère une grande plasticité mais ce qui est également la cause de nombreuses pathologies. ENaC est un canal sodique très étudié dans le rein et le poumon pour son importance dans la régulation de l'homéostasie sodique et la régulation du volume du milieu intérieur. Il est composé de 3 sous unités, α, ß et y qui forment un pore sélectif pour le sodium dans les membranes. Ce canal est présent dans la peau mais sa fonction n'y est pas connue. Des travaux précédents ont pu montrer que les souris dont le gène codant pour αENaC a été invalidé présentent un épiderme pathologique, suggérant un rôle dans la différentiation et pourrait même être impliqué dans la barrière épithéliale. Le but de cette thèse fut l'étude de la barrière dans ces souris knockouts avec des méthodes moléculaires et physiologiques et la caractérisation des mécanismes moléculaire impliqués. Dans ce travail, il a été montré que les souris mutantes présentaient un défaut de la barrière. Ce défaut n'est pas visible immédiatement à la naissance (test de perméabilité), mais 24h plus tard, lorsque les tests de perte d'eau transépithéliale montrent une différence évidente avec les animaux contrôles. Ni les protéines de structures ni les jonctions serrées de l'épiderme ne présentaient d'imperfections majeures. A l'inverse, les lipides de la couche cornée présentaient un problème de maturation (expliquant le phénotype de la barrière), certainement consécutif au défaut d'acidification à la surface de la peau que nous avons observé. D'autres mécanismes ont été explorées afin d'investiguer cette anomalie de la barrière, comme la réduction de sensibilité au calcium qui est le principal activateur de la formation de l'épiderme, ou la modification des flux d'ions entre les couches de l'épiderme. La localisation cellulaire d'ENaC, et l'action de son activateur CAPl ont également été étudiés en détails. En résumé, cette étude démontre clairement qu'ENaC est un acteur important dans la formation de la barrière épithéliale, car la peau des knockouts ne s'adapte pas aussi bien que celle des sauvages au nouvel environnement ex utero à cause de la fonction d'ENaC dans les mouvements de sodium au sein même de l'épiderme. Résumé tout public Chez l'homme, la peau est le plus grand organe, couvrant presque 2m2 et pesant près de 4kg chez l'adulte. Sa fonction principale est de protéger l'organisme des agressions extérieures mais également de conserver l'eau à l'intérieur du corps. Cette fonction nommée barrière épithéliale est localisée dans la partie fonctionnelle de la peau : l'épiderme. A cette fin, l'évolution s'est dotée d'une structure complexe composée de cellules et de lipides recouvrant la surface, la couche cornée. Sa formation est finement régulée, car elle n'est pas seulement produite à la naissance mais constamment renouvelée tout au long de la vie, ce qui lui confère une grande plasticité mais ce qui est également la cause de nombreuses maladies. ENaC est une protéine formant un canal qui permet le passage sélectif de l'ion sodium à travers la paroi des cellules. Il est très étudié dans le rein pour son importance dans la récupération du sel lors de la concentration de l'urine. Ce canal est présent dans la peau mais sa fonction n'y est pas connue. Des travaux précédents ont pu montrer que les souris où le gène codant pour αENaC a été invalidé présentent un épiderme pathologique, suggérant un rôle dans la peau et plus particulièrement la fonction de barrière de l'épiderme. Le but de cette thèse fut l'étude de la fonction de barrière dans ces souris mutantes, au niveau tissulaire et cellulaire. Dans ce travail, il a été montré que les souris mutantes présentaient une peau plus perméable que celle des animaux contrôles, grâce à une machine mesurant la perte d'eau à travers la peau. Ce défaut n'est visible que 24h après la naissance, mais nous avons pu montrer que les animaux mutants perdaient quasiment 2 fois plus d'eau que les contrôles. Au niveau moléculaire, nous avons pu montrer que ce défaut provenait d'un problème de maturation des lipides qui composent la barrière de la peau. Cette maturation est incomplète vraisemblablement à cause d'un défaut de mouvement des ions dans les couches les plus superficielles de l'épiderme, et cela à cause de l'absence du canal ENaC. En résumé, cette étude démontre clairement qu'ENaC est un acteur important dans la formation de la barrière épithéliale, car la peau des mutants ne s'adapte pas aussi bien que celle des sauvages au nouvel environnement ex utero à cause de la fonction d'ENaC dans les mouvements de sodium au sein même de l'épiderme.

Role of AP-1 family members in lymphomagenesis

Constitutive activation of the nuclear factor-KB (NF-KB) transcriptional pathway is the main characteristic of the activated B-cell-like (ABC) subtype of diffuse large B- cell lymphoma (DLBCL). This has been attributed to oncogenic mutations in the CARMA1, CD79A/B, MyD88 or RNF31 signaling proteins, which control NF-kB activation at different levels. Since several of these mutations lead to a state that mimics chronically antigen receptor-stimulated B-cells, and since the antigen receptor also triggers other transcription pathways, these might be important in ABC DLBCL malignancy too. In this study we analyzed whether abnormal expression and activity of members of the AP-1 transcription factor family could contribute to the pathogenesis of ABC DLBCL. Here, we identified activation of Jun as well as ATF members of the dimeric AP-1 transcription factor family, as a hallmark of ABC but not of germinal center B- cell-like (GCB) DLBCL cell lines. ABC DLBCL cell lines harbored an upregulated expression of c-Jun, JunB, JunD and ATF3 proteins. We could show that the upregulation of c-Jun, JunB and ATF3 was dependent on constitutive BCR and MyD88 signaling. Since AP-1 transcription factors need to dimerize to be active, Jun binding partners were investigated and we could demonstrate the presence of several ATF/Jun heterodimers (including c-Jun/ATF2, c-Jun/ATF3, c-Jun/ATF7, JunB/ATF2, JunB/ATF3, JunB/ATF7, JunD/ATF2, JunD/ATF3 and JunD/ATF7 heterodimers). The disruption of ATF/Jun heterodimers by A-Fos, a dominant negative form of Jun members, was toxic to ABC but not to GCB DLBCL cell lines. Finally, ATF3 immunohistochemistry on DLBCL patient samples revealed that samples classified as non-GCB had more intense and preferentially nuclear staining of ATF3, which could be of diagnostic relevance since the histological classification of the ABC and GCB DLBCL subtypes is difficult in clinical practice. In conclusion, we could show that ABC DLBCL are not only addicted to NF-KB signaling, but also to signaling by some members of the AP-1 transcription factor family. Thus, the AP-1 pathway might be a promising therapeutic target for the treatment of ABC DLBCL. Additionally, monitoring ATF3 levels could improve the diagnosis of ABC DLBCL by IHC. -- L'activation constitutive du facteur de transcription NF-KB est l'une des caractéristiques principales des lymphomes B du type ABC-DLBCL. Cette addiction est dépendante de mutations oncogéniques de CARMA1, CD79A/B, MyD88 et RNF31 qui contrôlent NF-KB à différents niveaux. Etant donné que la plupart de ces mutations mène à un état d'activation chronique du récepteur des cellules B (BCR) et que le BCR active d'autres voies de signalisation, d'autres facteurs de transcription pourraient être impliqués dans la lymphomagénèse des ABC-DLBCL. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si les membres de la famille du facteur de transcription AP-1 contribuaient à la pathogénèse de ce type de lymphome. Dans des lignées cellulaires de lymphomes du type ABC-DLBCL en comparaison avec le type GCB-DLBCL, nous avons pu identifier une activation anormale de plusieurs membres de la famille Jun et ATF, deux sous-familles du facteur de transcription AP-1. Les lignées cellulaires dérivées de lymphomes du type ABC-DLBCL surexpriment les facteurs de transcription c-Jun, JunB, JunD et ATF3. Leur surexpression dépend de l'activation constitutive de la voie du BCR et de MyD88. Etant donné qu'AP-1 requiert la formation de dimères pour être actif, nous nous sommes intéressés aux partenaires d'interactions de c-Jun, JunB et JunD et avons pu montrer la formation de plusieurs hétérodimères Jun/ATF (incluant les hétérodimères c-Jun/ATF2, c-Jun/ATF3, c-Jun/ATF7, JunB/ATF2, JunB/ATF3, JunB/ATF7, JunD/ATF2, JunD/ATF3 et JunD/ATF7). Lorsque l'on empêche la formation de ces hétérodimères avec A-Fos, un dominant négatif des membres Jun, la survie des lignées cellulaires du type ABC-DLBCL est diminuée, tandis que les lignées cellulaires GCB-DLBCL ne sont pas affectées. Pour finir, des immunohistochimies (IHC) pour ATF3 sur des échantillons de patients classifiés comme GCB et non-GCB ont pu montrer une coloration d'ATF3 nucléaire et beaucoup plus intense que les échantillons du type GCB. Ainsi, ATF3 pourrait être potentiellement utile en clinique pour différencier le sous type non-GCB des GCB. En conclusion, nous avons pu montrer que les lymphomes du type ABC- DLBCL ne présentent pas uniquement une addiction à NF-KB, mais également de certains membres de la famille de facteur de transcription AP-1. Par conséquent, AP- 1 pourrait être une cible thérapeutique prometteuse pour le développement de futures stratégies. En outre, la détermination des niveaux d'ATF3 par IHC pourraient améliorer le diagnostic des patients du type ABC DLBCL.

Perinuclear Mlp proteins down-regulate gene expression in response to a defect in mRNA export

Résumé Une caractéristique des cellules eucaryotes est le confinement du matériel génétique (ADN/DNA) dans le noyau. Pour décoder cette information, un ARN messager (mRNA) est d'abord transcrit sous forme d'un ARN prémessager (pré-mRNA). Ce-dernier doit subir plusieurs étapes de maturation pour aboutir à une particule ribonucléoprotéique (mRNP) qui sera exportée vers le cytoplasme et traduite en protéine. La protéine de levure Mex67p et son homologue humain TAP sont des récepteurs d'export médiant la translocation du mRNP au travers des complexes du pore nucléaire (NPC). Mex67p/TAP ne se lient pas directement au mRNA, mais nécessitent la présence de protéines adaptatrices, telles que Yra1p et son homologue humain REF1. Afin d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans l'export des mRNPs ou de nouvelles fonctions pour Yra1p, nous avons effectué un crible génétique avec un mutant thermosensible de Yra1p, GFP-yra 1 -8. Ce mutant présente un défaut d'export des mRNAs et une diminution des niveaux de transcrits du gène rapporteur LacZ ainsi que de certains transcrits endogènes. Nous avons trouvé que la perte de Mlp2p, ou d'une protéine hautement similaire, Mlp1p, restaure la croissance du mutant GFP-yra1-8 à température restrictive. Mlp1p et Mlp2p sont des protéines nucléaires, dont l'homologue humain est TPR. Les Mlp (myosin¬like proteins) ainsi que TPR forment des structures filamenteuses ancrées aux NPC. Bien que la fonction des Mlp ne soit pas clairement définie, un rôle dans la biogenèse et la surveillance des mRNPs a été récemment proposé. Notre étude montre que la perte des Mlp, non seulement restaure la croissance de GFP-yra1-8, mais augmente aussi les niveaux des transcrits LacZ et facilite leur apparition dans le cytoplasme. Des expériences d'immunoprécipitations de la chromatine révèlent que Mlp2p diminue le taux de synthèse du transcrit LacZ dans GFP-yra1-8. Des analyses du transcriptome montrent que Mlp2p réduit aussi les niveaux d'une population de transcrits endogènes dans le mutant. Finalement, des localisations in situ suggèrent que la transcription du rapporteur LacZ a lieu à la périphérie du noyau, à proximité des Mlp. Ainsi, les protéines Mlp pourraient préférentiellement diminuer la transcription de gènes exprimés à la périphérie nucléaire. Nous montrons aussi que Yra1p interagit génétiquement avec Nab2p une protéine liée au mRNA et impliquée dans son export, mais non avec d'autres protéines également impliquées dans l'export des mRNAs. Les résultats obtenus soutiennent un modèle où les protéines Yra1p et Nab2p sont nécessaires à l'arrimage des mRNPs sur la plate-forme des Mlp. Si ces signaux manquent ou sont défectueux, les mRNPs ne peuvent pas poursuivre leur trajet vers le canal central du NPC. Ce bloc induirait par la suite une diminution de la transcription d'une population de gènes potentiellement localisée à la périphérie nucléaire. Dans son ensemble, cette étude suggère que les protéines Mlp établissent un lien entre la transcription de certains mRNAs et leur export au travers du pore nucléaire. Summary A hallmark of the eukaryotic cell is the packaging of DNA in the nucleus. To decode the genetic information, a messenger RNA (mRNA) is first synthesized as a pre-mRNA molecule, which undergoes different maturation steps resulting in an mRNP (messenger RNA ribonucleoprotein), which can be actively transported to the cytoplasm and translated into a protein. Yeast Mex67p and its human homologue TAP are export receptors mediating mRNP translocation through the nuclear pore complex (NPC). The recruitment of Mex67p/TAP to mRNA is mediated by mRNA export adaptors of the evolutionarily conserved REF (RNA and Export Factor binding) family: yeast Yra1p and human REF1. To uncover new functions of Yra1p or new factors implicated in mRNA export, we performed a genetic screen with a themiosensitive (ts) yra1 mutant, GFP-yra1-8. This mutant exhibits mRNA export defects and a decrease in the levels of LacZ reporter and certain endogenous transcripts. We found that the loss of Mlp2p, or the related Mlp1p protein, substantially rescues the growth defect of the GFP-yra1 -8 mutant. Mlp1p and M1p2p are large non-essential proteins, homologous to human TPR, proposed to form intra-nuclear filamentous structures anchored at the NPC. Their role is not clearly defined, but they have been implicated in mRNP biogenesis and surveillance. Our study shows that loss of Mlp proteins not only restores growth of GFP-yra1-8, but also rescues LacZ mRNA levels and increases their appearance in the cytoplasm. Chromatin immunoprecipitation and pulse chase experiments indicate that Mlp2p down-regulates LacZ mRNA synthesis in GFP-yra1-8. DNA micro- array analyses reveal that Mlp2p also reduces the levels of a subset of cellular transcripts in the yra1 mutant strain. In situ localizations suggest that LacZ transcription occurs at the nuclear periphery, in close proximity to Mlp proteins. Thus, Mlp proteins may preferentially down-regulate genes expressed at the nuclear periphery. Finally, we show that Yra1p genetically interacts with the shuttling mRNA-binding protein Nab2p and that loss of Mlp proteins rescues the growth defect of yra1 and nab2, but not other mRNA export mutants. The data support a model in which Nab2p and Yra1p are required for rnRNP docking to the Mlp platform. Lack of these signals prevents mRNPs from crossing the Mlp gate. This block may then negatively feed-back on the transcription of a subset of genes, potentially located at the nuclear envelope. Overall, this study suggests that perinuclear Mlp proteins establish a link between mRNA transcription and export.

Infections and functionnal impairment in nursing home residents : a reciprocal relationship

RESUME: Contexte : l'objectif de cette étude de cohorte prospective était de déterminer la relation entre la survenue d'infections et la dépendance fonctionnelle chez des résidents d'établissements de long séjour durant une période de 6 mois. Population et méthode : les patients inclus (1324 résidents) étaient âgés de 65 ans et plus (âge moyen 85.7 ans, 76.6% de femmes), étaient des résidents de 39 EMS du canton de Vaud. Au baseline, des données démographiques, médicales, concernant les facteurs de risque et protecteurs des infections ont été récoltées. Au cours du suivi de 6 mois, les infirmières des EMS ont documenté la survenue de symptômes et signes d'infection en utilisant les critères développés spécifiquement par l'APIC pour les établissements de long séjour. Les mesures du status fonctionnel ont été évaluées au baseline, à 3 mois et à 6 mois. Deux outcomes différents ont été utilisés : a) le déclin fonctionnel défini comme le décès ou une diminution des capacités fonctionnelles au suivi, b) le status fonctionnel mesuré par une échelle standardisée. Résultats : à la fin du suivi, la mortalité était de 14.6%, similaire pour les résidents avec et sans infection (16.2% versus 13.1%, P .11). Durant les 2 périodes de suivi de 3 mois, les sujets ayant présenté une ou plusieurs infections avaient des odds de déclin fonctionnel plus élevés, y compris après ajustement pour les caractéristiques démographiques, médicales et fonctionnelles du baseline, ainsi que la survenue de nouvelles maladies (odds ratio ajustés (OR) = 1.6, intervalle de confiance à 95% (IC) = 1.2-2.2, P = .002 et OR = 1.5, 95% IC= 1.1-2.0, P= .008, respectivement). Comparés aux résidents non infectés, les odds de déclin fonctionnel augmentaient significativement et graduellement chez ceux ayant eu une, respectivement 2 infections ou plus. L'analyse prédisant le score fonctionnel (restreinte aux sujets ayant survécu) a donné des résultats similaires. Finalement, une analyse de survie prédisant le temps jusqu'à la première infection a confirmé une augmentation progressive de la probabilité d'infection chez les sujets avec dépendance fonctionnelle modérée, respectivement sévère, comparés aux sujets indépendants à la ligne de base. Conclusion : chez les résidents de long séjour, les infections sont à la fois cause et conséquence de la dépendance fonctionnelle. Des études futures devraient être entreprises pour investiguer si des programmes de prévention des infections peuvent également contribuer à prévenir le déclin fonctionnel, un facteur important pour la qualité de vie de ces résidents. ABSTRACT: Objectives: To determine the relationship between infections and functional impairment in nursing home residents. Design: Prospective cohort study (follow-up period, 6 months). Setting: Thirty-nine nursing homes in western Switzerland. Participants: A total of 1,324 residents aged 65 and older (mean age 85.7; 76.6% female) who agreed to participate, or their proxies, by oral informed consent. Measurements: Functional status measured every 3 months. Two different outcomes were used: (a) functional decline defined as death or decreased function at follow-up and (b) functional status score using a standardized measure. Results: At the end of follow-up, mortality was 14.6%, not different for those with and without infection (16.2% vs 13.1%, P= .11) During both 3-month periods, subjects with infection had higher odds of functional decline, even after adjustment for baseline characteristics and occurrence of a new illness (adjusted odds ratio (AOR) = 1.6, 95% confidence interval (CI) = 1.2-2.2, P = .002, and AOR 1.5, 95% CI 1.1-2.0, P .008, respectively). The odds of decline increased in a stepwise fashion in patients with zero, one, and two or more infections. The analyses predicting functional status score (restricted to subjects who survived) gave similar results. A survival analysis predicting time to first infection confirmed a stepwise greater likelihood of infection in subjects -with moderate and severe impairment at baseline than in subjects with no or mild functional impairment at baseline. Conclusion: Infections appear to be both a cause and a consequence of functional impairment in nursing home residents. Further studies should be undertaken to investigate whether effective infection control programs can also contribute to preventing functional decline, an important component of these residents' quality of life.