964 resultados para Mécanisme enzymatique
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Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche
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Limmunosuppression a permis damliorer lincidence du rejet aigu sans toutefois amliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractris par une vasculopathie du greffon (VG) similaire une forme acclre dathrosclrose native accompagne de fibrose. La pathophysiologie de la VG dcoule de lhypothse de rponse linsulte propose par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, lendothlium stress par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie lapoptose endothliale suivi dune rponse de rparation vasculaire via un paississement myo-intimal aux sites dinsultes. Toutefois, lorsque les stress endothliaux initiaux demeurent soutenus, lapoptose endothliale et la rponse de rparation perptuent. Compte tenu que linhibition de lapoptose endothliale bloque le dveloppement de la VG in vivo, notre hypothse de travail reposait sur les rpercussions paracrines de lapoptose endothliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons gnr un systme exprimental in vitro afin dinduire lapoptose endothliale en absence significative de ncrose cellulaire. laide dune approche protomique multidimensionnelle et comparative, nous avons dmontr que les cellules endothliales apoptotiques exportent spcifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons dmontr que certains de ces SPM ont des proprits anti-apoptotiques (TCTP et EGF), dautre fibrognique (CTGF), rcapitulant ainsi certains phnotypes cellulaires associs au dveloppement de la VG. Parmi les mdiateurs identifis, 16 navaient pas de signal de scrtion, incluant TCTP, suggrant que des mécanismes de scrtion non conventionnels soient favoriss durant lapoptose. Nous avons dmontr que la caspase-3 effectrice rgule la voie de scrtion non classique exosomiale associe lexport extracellulaire de nanovsicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, lensemble des donnes protomiques ont permis dmettre lhypothse quen rponse un stress apoptotique, la cellule exporte diffrents mdiateurs (solubles et vsiculaires) de manire non conventionnelle ncessitant la fusion dorganelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait rgul durant la phase effectrice de lapoptose permettant ainsi dinitier une rponse de rparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protique et nanovsiculaire lgu durant lapoptose endothliale pourrait servir simultanment de biomarqueur de la VG et de cible thrapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique.
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ralis en cotutelle avec la Facult des Sciences de Tunis, Universit Tunis El Manar.
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Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans locan. Son gnome mitochondrial possde une caractristique spciale: tous les gnes sont briss en de multiples fragments qui sappellent modules. Chaque module est cod par un chromosome diffrent. Lexpression dun gne exige des pissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet partir de tous les modules du gne. Nous avons prcdemment montr que le gne cox1 est encod dans neuf modules avec six Us non encods entre le module 4 et le module 5 de lARN messager mature [1]. Nous navons identifi aucune squence consensus connue de site dpissage prs des modules. Nous spculons quun ARN guide (gRNA) a dirig lpissage-en-trans du gne cox1 par un mécanisme qui est semblable ldition dARN par linsertion/la suppression des Us chez les kintoplastides, le groupe sur des diplonmides. Nous avons trouv que les six Us sont ajouts au bout 3 de lARN dune faon semblable ceux ajouts par le TUTase lors de ldition de linsertion des Us chez les kintoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de lpissage-en-trans avec les expressions rgulires bas sur notre connaissance des gRNAs dans ldition dARN chez les kintoplastides. Selon la complmentarit partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons gnr des amorces pour RT-PCR visant dtecter des squences qui sont assorties un des profils de gRNA. Une exprience pilote in vitro na pas permis de reconstituer lpissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggrant que nous devons amliorer nos techniques.
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Ce mmoire dcrit la synthse, la caractrisation spectroscopique et ltude de la ractivit catalytique dune nouvelle srie de complexes pinceurs de Ni(II) forms partir du ligand POCOPPh (P,C,P-2,6-{Ph2PO}2C6H4), trs peu tudi dans le cas du nickel. Les tudes dcrites dans ce mmoire examinent leffet des substituants des phosphines sur les proprits spectroscopiques et lectrochimiques ainsi que les activits catalytiques. La synthse du ligand a t amliore par rapport la procdure connue dans la littrature en diminuant le temps de raction 30 min et la temprature jusqu' temprature ambiante. Les composs pinceur (P,C,P-2,6-{Ph2PO}2C6H3)NiX ont t obtenus avec des rendements variant entre 60% et 88%. Le premier complexe a t synthtis en faisant ragir le prcurseur NiBr2(NCCH3)x avec le ligand POCOPPh pour donner (POCOPPh)NiBr. Ce dernier ragit par la suite avec les sels dargent et de potassium pour donner 4 nouveaux complexes soient : (POCOPPh)NiCN, (POCOPPh)NiOTf, (POCOPPh)NiOAc et (POCOPPh)NiONO2 (OTf = triflate et OAc = acetate). Vu la ractivit limite du driv bromure, le driv (POCOPPh)NiOTf a t utilis pour la prparation du compos (POCOPPh)NiCCPh. Le driv Ni-OTf a t utilis galement pour la synthse des complexes (POCOPPh)NiR qui ont t dtects par RMN. Ces complexes (POCOPPh)NiR ont montr une stabilit trop faible et donnent des nouveaux complexes de type (POCOPPh)NiX en changeant lhalogne avec le Mg ou de type (POCOPPh)NiOH en shydrolysant. Les espces cationiques [(POCOPPh)NiNCR][OTf] (R= Me, CHCH2, CHCHMe, C(Me)CH2, NCCH2CH2N(Ph)H) ont t obtenues facilement et avec des bon rendements partir du (POCOPPh)NiOTf. Tous les composs obtenus ont t caractriss par la spectroscopie RMN (1H, 13C{1H}, 31P{1H}, 19F{1H}), la spectroscopie IR et la spectroscopie UV-vis. Lanalyse lmentaire et lanalyse par la diffraction des rayons X, dont le but est de rsoudre la structure ltat solide, ont t utilises pour la plupart des complexes. Des tudes de voltampromtrie cyclique ont t menes pour dterminer la densit lectronique des centres mtalliques et leffet des phosphines sur cette proprit lectrochimique. Dans le but de dterminer leffet des substituants des phosphines sur lactivit catalytique des complexes, nous avons valu les ractivits catalytiques des deux complexes (POCOPPh)NiOTf et (POCOPi-Pr)NiOTf dans la raction dhydroamination des olfines activs et plus spcifiquement lacrylonitrile. Aprs optimisation des conditions exprimentales, on a constat que la ractivit des deux composs sont similaires mais une grande diffrence apparat aprs lajout des additifs. En effet, le complexe (POCOPi-Pr)NiOTf donne une bonne activit catalytique en prsence de la trithylamine, tandis que cette activit diminue considrablement en prsence deau, contrairement au complexe (POCOPPh)NiOTf qui est plus actif en prsence deau. Dans le cas du complexe (POCOPPh)NiOTf, on a pu montrer que la base se coordonne au nickel dans le produit form aprs la raction dhydroamination, ce qui diminue lactivit de ce complexe dans certains cas. galement on a explor la raction de laddition du lien O-H sur lacrylonitrile, et tonnamment le complexe (POCOPPh)NiOTf est beaucoup plus actif que son homologue (POCOPi-Pr)NiOTf dans le cas des alcools aromatiques. Par contre, les alcools aliphatiques restent un dfi majeur pour ce genre de complexe. Le mécanisme de cette raction qui a t propos montre que lalcoolyse passe par les deux intermdiaires (POCOPPh)NiOAr et [(POCOPPh)NiOAr][HOAr] mais lisolation de ces intermdiaires observs par RMN semble tre difficile.
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Nous avons dj dmontr que les probiotiques rduisaient l'apoptose observe dans le systme limbique aprs un infarctus du myocarde (IM), suggrant un rle anti-dpresseur potentiel des probiotiques. Cette tude a t conue pour dterminer si les probiotiques pouvaient attnuer le comportement dpressif observ aprs un infarctus du myocarde. Un autre objectif visait dmontrer quune altration de la barrire intestinale pourrait avoir lieu lors dun IM et que les probiotiques pourraient empcher cette altration de la permabilit intestinale. Mthodes: Des rats mles Sprague-Dawley ont reu des probiotiques (1 milliard de cellules bactriennes vivantes de Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175) ou le vhicule tous les jours en dilution dans leur eau, dbutant 1 semaine avant l'induction d'une ischmie myocardique. Un infarctus a ensuite t induit chez la moiti des rats, par l'occlusion de l'artre coronaire antrieure gauche (40 minutes) suivie d'une reperfusion. Les rats tmoins, l'autre moiti de la cohorte, ont t soumis la mme procdure sans occlusion coronarienne. Une semaine aprs l'infarctus, les animaux ont t resoumis au traitement pralable jusqu'au moment du sacrifice. Le comportement dpressif a t valu par trois tests soit: l'interaction sociale, le test de nage force et le test d'vitement passif. Rsultats: Les rsultats obtenus indiquent qu'en absence d'infarctus, les probiotiques n'ont pas d'effet significatif. Toutefois, en dpit de taille similaire IM, des rats traits avec des probiotiques, ont dmontr davantage d'interactions sociales et une meilleure performance dans le test de nage force et d'vitement passif, comparativement des rats du groupe IM sans probiotique (p<0,05). Conclusion: Les probiotiques attnuent le comportement dpressif observ aprs infarctus du myocarde par un mécanisme qui pourrait impliquer l'intgrit des intestins.
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Lautophagie est un processus cellulaire catabolique qui a t conserv durant lvolution de la levure lhomme. Cet important mécanisme consiste en une dgradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de lautophagie : la microautophagie, lautophagie mdie par les chaperones et la macroautophagie nomme autophagie . Il a t dmontr que lors de lautophagie, le matriel cytoplasmique (protines cytosoliques et organites) est squestr dans lautophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi lautophagolysosome. Le matriel squestr et la membrane interne de lautophagosome seront dgrads par les hydrolases lysosomales. Plusieurs tudes se sont focalises sur la dtermination de la machinerie molculaire et les mécanismes de lautophagie. Il a t dmontr limplication de 31 molcules Atg essentielles dans le processus de lautophagie. Lidentification de ces protines a permis de dceler le rle de lautophagie non seulement dans le maintien de lhomostasie cellulaire mais aussi dans la dfense contre les agents pathognes. En effet, lautophagie joue un rle important dans limmunit inne conduisant contrler lvasion des pathognes dont les bactries et les virus. galement, lautophagie est implique dans limmunit adaptative en favorisant la prsentation des antignes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une tude rcente suggre que lautophagie contribue la prsentation antignique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu dvelopper des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rle protecteur de lautophagie. Rcemment, une tude dans notre laboratoire a mis en vidence, lors dune infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la prsence dune nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de linfection. Cette nouvelle structure est diffrente des autophagosomes classiques double membrane et est caractrise morphologiquement par quatre membranes drives de lenveloppe nuclaire interne et externe. Peu de choses ont t rapportes sur cette nouvelle voie autophagique qui peut tre un mécanisme de dfense cellulaire quand lautophagie classique dans le cytosol est inhibe par HSV-1. Il devient donc intressant de caractriser les molcules impliques dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectromtrie de masse. Pour ce faire, il tait impratif dtablir un outil disolation des noyaux partir de macrophages infects par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront forms. La validation de cette mthode disolation a t effectue en dterminant la puret et lintgrit des noyaux isols partir des cellules non infectes (contrle) et infectes par HSV-1. La puret des prparations de noyaux isols a t caractrise par labsence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. galement, il a fallu dterminer la cintique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignes cellulaires de macrophages utilises dans ce projet. Dans une perspective future, lanalyse protomique partir des chantillons purs des noyaux isols (non infects et infects) mnera identifier les protines impliques dans la formation des autophagosomes drivs des noyaux, ce qui permettra ultrieurement deffectuer des tudes sur les mécanismes molculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.
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Dans cette thse nous dmontrons le travail fait sur deux matriaux de cathodes pour les piles lithium-ion. Dans la premire partie, nous avons prpar du phosphate de fer lithi (LiFePO4) par deux mthodes de lithiation prsentes dans la littrature qui utilisent du phosphate de fer (FePO4) amorphe comme prcurseur. Pour les deux mthodes, le produit obtenu chaque tape de la synthse a t analys par la spectroscopie Mssbauer ainsi que par diffraction des rayons X (DRX) pour mieux comprendre le mécanisme de la raction. Les rsultats de ces analyses ont t publis dans Journal of Power Sources. Le deuxime matriau de cathode qui a t tudi est le silicate de fer lithi (Li2FeSiO4). Une nouvelle mthode de synthse a t dveloppe pour obtenir le silicate de fer lithi en utilisant des produits chimiques peu couteux ainsi que de lquipement de laboratoire de base. Le matriau a t obtenu par une synthse ltat solide. Les performances lectrochimiques ont t obtenues aprs une tape de broyage et un dpt dune couche de carbone. Un essai a t fait pour synthtiser une version substitue du silicate de fer lithi dans le but daugmenter les performances lectrochimiques de ce matriau.
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Cette thse comporte trois essais en macroconomie en conomie ouverte et commerce international. Je considre tour tour les questions suivantes: sous quelles conditions est-il optimal pour un pays de former une union conomique? (essai 1); l'augmentation de la dispersion transversale des avoirs extrieurs nets des pays est-elle compatible avec une dispersion relativement stable des taux d'investissement? (essai 2); le risque de perte de march l'exportation du fait de l'existence des zones de commerce prfrentiel joue t-il un rle dans la dcision des pays exclus de ngocier des accords commerciaux leur tour? (essai 3). Le premier essai examine les conditions d'optimalit d'une union conomique. Il s'intresse une motivation particulire: le partage du risque li aux fluctuations du revenu. Dans la situation initiale, les pays ont trs peu d'opportunits pour partager le risque cause des frictions: les marchs financiers internationaux sont incomplets et il n'y pas de mécanisme pour faire respecter les contrats de crdit entre pays. Dans ce contexte, une union conomique apparait comme un arrangement qui pallie ces frictions entre les pays membres seulement. Cependant, l'union dans son ensemble continue de faire face ces frictions lorsqu'elle change avec le reste du monde. L'arbitrage cl dans le modle est le suivant. D'un cot, l'intgration conomique permet un meilleur partage du risque entre pays membres et la possibilit pour le partenaire pauvre d'utiliser la ligne de crdit du partenaire riche en cas de besoin. De l'autre cot, l'union peut faire face une limite de crdit plus restrictive parce que rsilier la dette extrieure est moins coteux pour les membres l'union. De plus, le fait que le partenaire pauvre peut utiliser la limite de crdit du partenaire riche gnre une externalit ngative pour ce dernier qui se retrouve plus frquemment contraint au niveau des marchs internationaux des capitaux. En conformit avec les faits observs sur l'intgration conomique, le modle prdit que les unions conomiques sont relativement peu frquentes, sont plus susceptibles d'tre cres parmi des pays homognes, et gnralement riches. Le deuxime essai porte sur la dispersion des avoirs extrieurs nets et la relation avec la dispersion des taux d'investissement. Au cours des rcentes dcennies, la dispersion croissante des dsquilibres extrieurs et les niveaux record atteints par certaines grandes conomies ont reu une attention considrable. On pourrait attribuer ce phnomne une rduction des barrires aux mouvements internationaux des capitaux. Mais dans ce cas, il est lgitime de s'attendre une augmentation de la dispersion au niveau des taux d'investissement; ceci, parce que le financement des besoins en investissements constitue une raison fondamentale pour laquelle les pays changent les capitaux. Les donnes indiquent cependant que la dispersion des taux d'investissement est reste relativement stable au cours des rcentes dcennies. Pour rconcilier ces faits, je construis un modle d'quilibre gnral dynamique et stochastique o les pays sont htrognes en raison des chocs idiosyncratiques leurs niveaux de productivit totale des facteurs. Au niveau des marchs internationaux des capitaux, le menu des actifs disponibles est restreint une obligation sans risque et il n'y a pas de mécanisme pour faire respecter les contrats de crdit entre pays. A tout moment, un pays peut choisir de rsilier sa dette extrieure sous peine d'exclusion financire et d'un cot direct. Ce cot direct reflte les canaux autres que l'exclusion financire travers lesquels les pays en dfaut sont pnaliss. Lorsque le modle est calibr pour reproduire l'volution de la dispersion transversale des avoirs extrieurs nets, il produit une dispersion relativement stable des taux d'investissement. La raison principale est que les incitations que les pays ont investir sont lies la productivit. Avec l'intgration financire, mme si les opportunits d'emprunt se sont multiplies, les incitations investir n'ont pas beaucoup chang. Ce qui permet de gnrer une dispersion accrue de la position des avoirs extrieurs nets des pays avec une dispersion relativement stable des taux d'investissement. Le troisime essai analyse un aspect de l'interdpendance dans la formation des accords commerciaux prfrentiels: j'examine empiriquement si le risque de diversion des exportations en faveur des pays membres des zones de commerce prfrentiel est un facteur dterminant dans la dcision des pays exclus de ces accords de ngocier un accord leur tour. Je construis un indicateur qui mesure le potentiel de diversion des exportations auquel font face les pays et estime un modle probit de formation des zones de commerce prfrentiel cres entre 1961 et 2005. Les rsultats confirment que les pays confronts un plus grand potentiel de dtournement des changes sont plus susceptibles de former une zone de commerce prfrentiel leur tour.
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Dans ce mmoire, nous examinons le fichage de la dlinquance sexuelle dont les divers rgimes juridiques reposent sur lide que ces contrevenants prsentent un risque rel de rcidive criminelle. Les donnes scientifiques sur la dlinquance sexuelle relativisent ce risque et attestent quil est quasi absent dans un trs grand nombre de cas. Il existe donc une dichotomie entre les prmisses du droit et les connaissances issues des sciences sociales et humaines sur cette question. Le fichage de cette dlinquance au Canada donne lieu des mécanismes administratifs provinciaux en plus dun rgime fdral contenu au Code criminel. Nous mettons lhypothse que le fichage provincial emporte de vritables consquences pnales sur les dlinquants sexuels, affectent leurs droits en vertu de larticle 7 de la Charte et contrecarre des principes de justice fondamentale. Ensuite, nous examinons le rgime fdral intgr au Code criminel et nous argumentons que ce mécanisme juridique cre une mesure punitive de la nature dune peine. Par consquent, le fichage fdral devrait tre amnag de faon satisfaire aux garanties constitutionnelles propres la peine et aux principes gnraux de la dtermination de la peine en vertu de la Partie XXIII du Code criminel. Nous concluons que les lgislateurs successifs ont cr des rgimes juridiques rgissant le fichage de la dlinquance sexuelle en cartant les principes fondamentaux administratifs, criminels et constitutionnels qui devraient prsider llaboration des rgles concernant ce stigmate de la criminalit. Les tribunaux, par leur interprtation, ont galement dqualifi cette stigmatisation de la criminalit sexuelle titre de peine. Le droit relatif au fichage de la dlinquance sexuelle donne donc lieu une rosion des principes fondamentaux de la justice criminelle et punitive.
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Candida albicans est une levure pathogne qui, ltat commensal, colonise les muqueuses de la cavit orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systmiques svres. C. albicans a la capacit de se dvelopper sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouves chez lhte (temprature de 37C, pH neutre, prsence de srum) induisent la transition levure--hyphe (i.e. morphogense ou filamentation). Cette transition morphologique contribue la pathognicit de C. albicans, du fait que des souches prsentant un dfaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogense est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le dveloppement dantifongiques. En effet, il a dj t dmontr que linhibition de la transition levure--hyphe attnuait la virulence de C. albicans lors dinfections systmiques. Par ailleurs, des tudes ont dmontr que de nombreuses molcules pouvaient moduler la morphogense. Parmi ces molcules, certains acides gras, dont lacide linolique conjugu (CLA), inhibent la formation dhyphes. Ainsi, le CLA possderait des proprits thrapeutiques, du fait quil interfre avec un dterminant de pathognicit de C. albicans. Par contre, avant dvaluer son potentiel thrapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel dtudier son mode daction. Ce projet vise caractriser lactivit anti-filamentation des acides gras et du CLA et dterminer le mécanisme par lequel ces molcules inhibent la morphogense chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont t effectues afin dobtenir le profil transcriptionnel de la rponse de C. albicans au CLA. Lacide gras a entran une baisse des niveaux dexpression de gnes encodant des protines hyphes-spcifiques et des rgulateurs de morphogense, dont RAS1. Ce gne code pour la GTPase Ras1p, une protine membranaire de signalisation qui joue un rle important dans la transition levure--hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirm que le CLA inhibait linduction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement caus une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entran sa dlocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit lactivation de la voie de signalisation Ras1p-dpendante, inhibant ainsi la morphogense. Il est possible que le CLA altre la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en vidence le mode daction du CLA. Le potentiel thrapeutique du CLA pourrait maintenant tre valu dans un contexte dinfection, permettant ainsi de vrifier quune telle approche constitue vritablement une stratgie pour le traitement des candidoses.
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L'assemblage des nuclosomes est troitement couple la synthse des histones ainsi qu la rplication et la rparation de lADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrle qui contribue soigneusement et de manire rgule lassemblage de lADN en chromatine. L'assemblage des nuclosomes durant la synthse de lADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilit gnomique. Cette thse dcrit la caractrisation par spectromtrie de masse(SM) des protines jouant un rle critique dans lassemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus prcisment, la phosphorylation de deux facteurs dassemblage des nuclosome, le facteur CAF-1, une chaperone dhistone qui participe l'assemblage de la chromatine spcifiquement couple la rplication de l'ADN, ainsi que le complexe protique Hir, jouant de plus un rle important dans la rgulation transcriptionelle des gnes dhistones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en rponse aux dommages de l'ADN, a t examin. La caractrisation des sites de phosphorylation par SM ncssite la sparation des protines par lctrophorse suivi dune coloration a largent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration largent induit un artfact de sulfatation. Plus prcisment, cet artfact est caus par un ractif spcifiquement utilis lors de la coloration. La sulfatation prsente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, lincrment de masse observ sur les peptides sulfats et phosphoryls (+80 Da) ncssite des instruments offrant une haute rsolution et haute prcision de masse pour diffrencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons dabord dmontr par SM que Cac1, la plus grande sous-unit du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intrssant, certains de ces sites contiennent des squences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces rsultats fournissent les premires vidences que CAF-1 est potentiellement rgul par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifis a ensuite t value. Nous avons dmontr que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle la rprssion transcriptionelle des gnes au niveau des tlomres. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas tre ncssaire pour dautres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spcifiquement la fonction de CAF-1 aux structures htrochromatiques des tlomres. Ensuite, nous avons identifis une intraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des tudes in vitro ont galement demontr que cette kinase phosphoryle spcifiquement Cac1 Ser-503, suggrant un rle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans lassemblage et la stabilit de la structure htrochromatique aux tlomres. Finalement, les analyses par SM nous ont galement permi de montrer que la sous-unit Hpc2 du complexe Hir est phosphoryle sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM dun site spcifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, sest rvle tre fortement induite suite lactivation du point de contrle de rplication (le checkpoint) suite au dommage a lADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshoryle par les kinases de point de contrle de manire Mec1/Tel1- et Rad53-dpendante. Nos donnes prliminaires suggrent ainsi que la capacit du complex Hir de rguler la rprssion transcriptionelle des gnes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en rponse au dommage de l'ADN est mdie par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux tudes mettent en vidence l'importance de la spectromtrie de masse dans la caractrisation des sites de phosphorylation des protines, nous permettant ainsi de comprendre plus prcisement les mécanismes de rgulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthse des histones.
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Le benzo-a-pyrne (BaP) est un cancrogne reconnu pour l'homme, contaminant prsent dans notre environnement. Il cause des dommages l'ADN que nous avons mesurs dans les lymphocytes exposs de faibles concentrations de BaP, provenant de 20 jeunes volontaires non fumeurs et en sant. Suite lexposition, la frquence des micronoyaux (MN) augmente significativement et dcrit une courbe dose-rponse non linaire, suggrant le dclenchement du processus de dtoxification et la rparation de lADN. Des diffrences entre les individus et entre les sexes sont prsentes dans la rponse gnotoxique produite par le BaP. Le test des aberrations chromosomiques montre que le pourcentage de chromosomes casss augmente significativement dans les cellules exposes au BaP. Combins avec l'augmentation de la frquence des MN, nos rsultats confirment l'effet clastogne du BaP dj rapport dans la littrature. Lhybridation in situ en fluorescence (FISH) des MN avec une sonde pancentromrique est aussi utilise pour tablir leur mécanisme de formation. La FISH rvle que la majorit des MN forms aprs une exposition au BaP contient un centromre et plus, ce qui est significativement diffrent de la condition non expose. Plus prcisment, dans nos conditions exprimentales, les MN induits par le BaP contiennent surtout trois centromres et plus, indiquant galement la prsence d'un effet aneugne. L'effet clastogne du BaP est reli son rle d'initiateur dans la cancrogense, alors que l'effet aneugne le relierait l'tape de progression. Ces rsultats sont importants puisque l'exposition aux composs de la classe du BaP est de longue dure (cigarette, air pollu).
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La rparation de lADN par excision des nuclotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large varit de lsions causant une distorsion de la double hlice, comme celles causes par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de rparation de lADN, la NER contribue la prvention de la carcinognse en prvenant la mutation de lADN. Lors de ce processus, il y a dabord reconnaissance de la lsion par la protine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe droule lADN par son activit hlicase et recrute lendonuclase XPG/Rad2 ainsi que dautres protines ncessaires lexcision de lADN. Lors de son arrive au site de lsion, XPG/Rad2 dplace XPC/Rad4. TFIIH agit galement lors de la transcription de lADN, entre autres par son activit hlicase. Outre cette similarit de la prsence de TFIIH lors de la transcription et la rparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intresss aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de rparation de lADN. Nous avons donc entrepris une caractrisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons dcouvert que Rad2 et Rad4 possdent un motif dinteraction en nous basant sur dautres interactions de la sous-unit Tfb1 de TFIIH. Par calorimtrie titrage isotherme, nous avons observ que les segments de ces deux protines contenant ce motif interagissent avec une grande affinit au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est trs semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIE avec Tfb1PH, tel que dmontr par rsonance magntique nuclaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire comptition les uns aux autres pour la liaison Tfb1PH. Nous avons aussi dmontr in vivo chez la levure quune dltion de Tfb1PH cre une sensibilit aux radiations UV. De plus, la dltion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments dinteraction Tfb1PH, est ncessaire pour voir une sensibilit aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliques dans la liaison de Rad2 et Rad4 TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont t rsolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des rsidus hydrophobes interagissant avec des cavits peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont trs semblables la structure de TFIIE-p62PH. Ces dcouvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la rparation de lADN. De plus, elles permettent dmettre un modle du mécanisme de dplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage lADN. Ces connaissances aident mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilit gnomique et peuvent ainsi mener dvelopper de nouvelles thrapies contre le cancer.
Resumo:
Le rcepteur de l'acide rtinoque RAR est une protine de la superfamille des rcepteurs nuclaires liant le ligand acide rtinoque (AR). En prsence de son ligand, RAR induit la transcription de ses gnes cibles alors qu'en son absence la transcription est inhibe. Le mécanisme de rgulation de RAR est altr dans les lignes cellulaires humaines de carcinome mammaire d une baisse de capacit de synthse de l'AR. Aussi, l'expression des microARN (miR) est perturbe dans le cancer du sein et un grand nombre de gnes ont t identifis, aprs une analyse in-silico, comme des cibles prdites des miRs. Ces derniers peuvent tre rguls pas des facteurs de transcription et ils sont capables d'inhiber la prolifration cellulaire et d'induire l'apoptose via la rgulation de leurs cibles. Ainsi, les miRs peuvent jouer un rle dans le mécanisme de rgulation de RAR et tre impliqus dans des boucles de rgulation avec ce rcepteur. Dans le cadre de ce travail, nous dcrivons une approche dveloppe pour prdire et caractriser des circuits de rgulation au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel dans le cancer du sein. Nous nous sommes intresss aux boucles de rgulation de type feed-forward o RAR rgule un miR et en commun ils rgulent un ensemble de gnes codants pour des protines dans les cellules tumorales mammaires MCF7 et SKBR3. Ces circuits ont t construits en combinant des donnes de ChIP-chip de RAR et des donnes de micro-puces d'ADN tout en utilisant des outils in-silico de prdiction des gnes cibles de miRs. Afin de proposer le modle appropri de rgulation, une analyse in-silico des lments de rponse de l'AR (RARE) dans les promoteurs des miRs est ralise. Cette tape permet de prdire si la rgulation par RAR est directe ou indirecte. Les boucles ainsi prdites sont filtres en se basant sur des donnes d'expression de miR existantes dans des bases de donnes et dans diffrentes lignes cellulaires, en vue d'liminer les faux positifs. De plus, seuls les circuits pertinents sur le plan biologique et trouvs enrichis dans Gene Ontology sont retenus. Nous proposons galement d'infrer l'activit des miRs afin d'orienter leur rgulation par RAR. L'approche a russi identifier des boucles valides exprimentalement. Plusieurs circuits de rgulation prdits semblent tre impliqus dans divers aspects du dveloppement de l'organisme, de la prolifration et de la diffrenciation cellulaire. De plus, nous avons pu valider que let-7a peut tre induit par l'AR dans les MCF7.
