Identification of non-zein proteins in BR473 maize protein bodies by LC-nanoESI-MS/MS

The nutritional value of maize seed is limited due to its high content of storage proteins (zeins), which are deficient in essential amino acids such as lysine and tryptophan. In a previous paper, we showed that protein bodies obtained from BR473 maize variety, developed by Embrapa (Brazilian Agricultural Research Corporation), were mainly constituted by Z27 and a smaller quantity of Z50 gamma-zeins. Besides zein proteins, other not identified protein band in the SDS/PAGE was also observed, which could indicate the presence of non-zein proteins additionally to gamma-zeins. In the present paper, we have demonstrated the presence of non-zein proteins in BR473 maize protein bodies by LC-nanoESI-MS/MS and database searching. This fact could be related to the excellent energetic value and higher protein quality of BR473 maize grains, since high lysine concentration in some maize varieties has been related to the presence of cytoskeleton proteins that are non-zeins. We have identified the following proteins: Brittle-1 protein (chloroplast precursor), Legumin-1, glyceroldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and elongation factor 1-alpha.

Sample stacking in CZE using dynamic thermal junctions II: Analytes with high dpK(a)/dT crossing a single thermal junction in a BGE with low dpH/dT

In a previous work [M. Mandaji, et al., this issue] a sample stacking method was theoretically modeled and experimentally demonstrated for analytes with low dpK(a)/dT (analytes carrying carboxylic groups) and BGEs with high dpH/dT (high pH-temperature-coefficients). In that work, buffer pH was modulated with temperature, inducing electrophoretic mobility changes in the analytes. In the present work, the opposite conditions are studied and tested, i.e. analytes with high dpK(a)/dT and BGEs that exhibit low dpH/dT. It is well known that organic bases such as amines, imidazoles, and benzimidazoles exhibit high dpK(a)/dT. Temperature variations induce instantaneous changes on the basicity of these and other basic groups. Therefore, the electrophoretic velocity of some analytes changes abruptly when temperature variations are applied along the capillary. This is true only if BGE pH remains constant or if it changes in the opposite direction of pK(a) of the analyte. The presence of hot and cold sections along the capillary also affects local viscosity, conductivity, and electric field strength. The effect of these variables on electrophoretic velocity and band stacking efficacy was also taken into account in the theoretical model presented. Finally, this stacking method is demonstrated for lysine partially derivatized with naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde. In this case, the amino group of the lateral chain was left underivatized and only the alpha amino group was derivatized. Therefore, the basicity of the lateral amino group, and consequently the electrophoretic mobility, was modulated with temperature while the pH of the buffer used remained unchanged.

Comparação de dois métodos de quantificação de Salmonella sp. em embutidos suínos.

A segurança dos alimentos é uma preocupação mundial e um fator importante na comercialização de produtos de origem animal. A presença de Salmonella sp. em suínos ao abate e em produtos do tipo frescal podem representar um risco para a saúde do consumidor. A análise de risco prevê a avaliação de diferentes fatores, entre eles a quantificação do microrganismo presente no alimento. A partir disso, a contribuição do presente estudo foi buscar estabelecer um método confiável de quantificação de Salmonella sp. em produtos suínos, uma vez que uma das etapas da análise de risco prevê a quantificação do perigo. No caso de Salmonella sp., a técnica da estimativa do Número Mais Provável (NMP) tem sido adotada. Em uma primeira fase desse trabalho, amostras foram quantificadas, individualmente, com três amostras de Salmonella Typhimurium (ATTCC15290 e 2 amostras de suínos) em três diferentes contagens, 101, 102 e 103 UFC. Para o método A, as amostras quantificadas foram adicionadas a 225 mL de água peptonada tamponada, sendo, posteriormente, fracionadas em 3 alíquotas de 50mL, 5mL e 0,5mL. Para o método B, a amostra fortificada foi diluída em água peptonada tamponada até 10-3, sempre em triplicata. Na segunda fase, foram testadas amostras naturalmente contaminadas, utilizando as mesmas metodologias usadas na primeira fase. Todas as alíquotas de ambos métodos foram incubadas a 370C por 18 horas. Após, cada alíquota foi semeada em caldo Rappaport-Vassiliadis (RV) e incubadas à 420C por 24 h e após, em àgar Xylose-Lysine-Tergitol 4 (XLT4) à 370C por 48 h. Colônias suspeitas foram confirmadas por testes bioquímicos. O número de placas positivas para Salmonella sp. foi utilizado para o cálculo do Número Mais Provável, utilizando tabela apropriada. Na segunda fase, os dois métodos foram avaliados em 20 amostras naturalmente contaminadas, mantidas congeladas por até 115 dias. Em 45 ensaios conduzidos, para cada método, em amostras de lingüiça de carne suína contaminadas artificialmente, 38 do método A e 41 do método B resultaram em NMP (95% de intervalo de confiança) concordante com número de UFC de Salmonella inoculado. A maioria das amostras naturalmente contaminada de massa de embutido apresentaram contagens <10NMP/g. A variabilidade encontrada entre os valores de NMP médio foi bastante elevada, tanto entre os métodos como entre repetições de um mesmo método. Isto reflete uma das limitações do método de NMP para estimar a contagem de microrganismos e deverá ser considerada quando o método for aplicado em alimentos naturalmente contaminados e quando aplicado em um estudo de análise de risco. Uma vez que o método B foi o que demonstrou valores médios de NMP mais próximos das quantidades inoculadas, sugere-se que este seja adotado em estudos futuros de quantificação de Salmonella sp. em produtos de origem suína.

Characterization of a new platelet aggregating factor from crotoxin Crotalus durissus cascavella venom

In this article we investigated the platelet aggregating activity of whole crotoxin and its subunits isolated from Crotalus durissus cascavella venom. During the purification protocols of the venom, using HPLC molecular exclusion, we detected the presence of two different serine protease activities in the gyroxin fraction, and another in the crotoxin fraction, which induced strong and irreversible platelet aggregation, in addition to blood coagulation. From crotoxin, we isolated PLA(2), crotapotin (both fractions corresponding approximately 85% of whole crotoxin) and another minor fraction (F20) that exhibited serine protease activity. After a new fractionation on reverse phase HPLC chromatography, we obtained three other fractions named as F201, F202 and F203. F202 was obtained with high degree of molecular homogeneity with molecular mass of approximately 28 kDa and a high content of acidic amino residues, such as aspartic acid and glutamic acid. Other important amino acids were histidine, cysteine and lysine. This protein exhibited a high specificity for BApNA, a Michaelis-Menten behavior with Vmax estimated in 5.64 mu M/min and a Km value of 0.58 mM for this substrate. In this work, we investigated the ability of F202 to degrade fibrinogen and observed alpha and beta chain cleavage. Enzymatic as well as the platelet aggregation activities were strongly inhibited when incubated with TLCK and PMSF, specific inhibitors of serine protease. Also, F202 induced platelet aggregation in washed and platelet-rich plasma, and in both cases, TLCK inhibited its activity. The N-terminal amino acid sequence of F202 presented a high amino acid sequence homology with other thrombin-like proteins, but it was significantly different from gyroxin. These results showed that crotoxin is a highly heterogeneous protein composed of PLA(2), thrombin-like and other fractions that might explain the diversity of physiological and pharmacological activities of this protein.

Umbelliferone induces changes in the structure and pharmacological activities of Bn IV, a phospholipase A(2) isoform isolated from Bothrops neuwiedi

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Renal and cardiovascular effects of Bothrops marajoensis venom and phospholipase A(2)

Bothrops marajoensis is found in the savannah of Marajo Island in the State of Par S and regions of Amapa State, Brazil. The aim of the work was to study the renal and cardiovascular effects of the B. marajoensis venom and phospholipase A(2) (PLA(2)). The venom was fractionated by Protein Pack 5PW. N-terminal amino acid sequencing of sPLA(2) showed amino acid identity with other lysine K49sPLA(2)s of snake venom. B. marajoensis venom (30 mu g/mL) decreased the perfusion pressure, renal vascular resistance, urinary flow, glomerular filtration rate and sodium tubular transport. PLA(2) did not change the renal parameters. The perfusion pressure of the mesenteric bed did not change after infusion of venom. In isolated heart, the venom decreased the force of contraction and increased PP but did not change coronary flow. In the arterial pressure, the venom and PLA(2) decreased mean arterial pressure and cardiac frequency. The presence of atrial flutter and late hyperpolarisation reversed, indicating QRS complex arrhythmia and dysfunction in atrial conduction. In conclusion, B. marajoensis venom and PLA(2) induce hypotension and bradycardia while simultaneously blocking electrical conduction in the heart. Moreover, the decrease in glomerular filtration rate, urinary flow and electrolyte transport demonstrates physiological changes to the renal system. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Farinha de vísceras de aves em rações para a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus L.) durante a fase de reversão sexual

Neste trabalho, objetivou-se avaliar o desempenho, a sobrevivência e a efetividade de reversão de larvas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus L.) alimentadas com rações contendo níveis crescentes de inclusão de farinha de vísceras de aves (FVA). Utilizou-se 500 larvas de tilápia do Nilo com dois dias de idade, distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos e cinco repetições, sendo a unidade experimental constituída por um aquário de 30 L com 20 larvas. Foram elaboradas cinco rações com cinco níveis de inclusão de FVA ( 0; 20; 40, 60% e 60% mais lisina sintética). Foram elaboradas rações isocalóricas, isocálcicas, isofosfóricas e isoprotéicas, com 60mg de a-metiltestosterona/kg, 38,6% de proteína digestível e 3.700 kcal de energia digestível/kg, de modo que a ração com inclusão de lisina foi isoaminoacídica para lisina em relação à ração sem a inclusão de FVA. O arraçoamento foi realizado quatro vezes ao dia, ad libitum. Ao final, foram avaliadas as médias de peso final (PF), comprimento total (CT), sobrevivência (SO) e efetividade de reversão (ER). Foi observado aumento linear no PF e CT com o aumento da inclusão da FVA na ração, enquanto, para SO, a ração sem FVA foi inferior às demais. As rações sem inclusão de FVA e com 20% de inclusão de lisina proporcionaram PF e CT médios inferiores e somente a ração sem FVA foi inferior para SO. Conclui-se que a FVA pode ser utilizada em rações para a tilápia do Nilo durante a reversão sexual.

Antibacterial and antiparasitic effects of Bothrops marajoensis venom and its fractions: Phospholipase A(2) and L-amino acid oxidase

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Ingredient classification according to the digestible amino acid profile: an exploratory analysis

This study aimed: 1) to classify ingredients according to the digestible amino acid (AA) profile; 2) to determine ingredients with AA profile closer to the ideal for broiler chickens; and 3) to compare digestible AA profiles from simulated diets with the ideal protein profile. The digestible AA levels of 30 ingredients were compiled from the literature and presented as percentages of lysine according to the ideal protein concept. Cluster and principal component analyses (exploratory analyses) were used to compose and describe groups of ingredients according to AA profiles. Four ingredient groups were identified by cluster analysis, and the classification of the ingredients within each of these groups was obtained from a principal component analysis, showing 11 classes of ingredients with similar digestible AA profiles. The ingredients with AA profiles closer to the ideal protein were meat and bone meal 45, fish meal 60 and wheat germ meal, all of them constituting Class 1; the ingredients from the other classes gradually diverged from the ideal protein. Soybean meal, which is the main protein source for poultry, showed good AA balance since it was included in Class 3. on the contrary, corn, which is the main energy source in poultry diets, was classified in Class 8. Dietary AA profiles were improved when corn and/or soybean meal were partially or totally replaced in the simulations by ingredients with better AA balance.

Comparação dos caldos selenito cistina, tetrationato Muller-Kauffmann e Rappaport-Vassiliadis no isolamento de Salmonella Typhimurium

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Comparação da eficiência dos caldos de enriquecimento seletivo no isolamento de Salmonella Dublin

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeitos da tricostatina A sobre a acetilação de histonas, proliferação celular e diferenciação de células tronco embrionárias murinas

Background: Embryonic stem cells are cells derived from early-stage embryos that are characterized by pluripotency and self-renewal capacity. The in vitro cultured murine embryonic stem cells can indefinitely propagate in an undifferentiated state in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF). However, when stimulated, these cells can differentiate into cell lines derived from all three embryonic germ layers. The trichostatin A (TSA) is an epigenetic modifier agent and several studies have used the TSA to stimulate cellular differentiation. However, most of these studies only assessed one TSA concentration. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of different TSA concentrations on histone hyperacetylation during in vitro cell differentiation of murine pluripotent embryonic stem cells, cultured with or without LIF, in the quest of to standardize their application on early cultures of embryonic stem cells.Materials, Methods & Results: Undifferentiated murine embryonic stem cells were plated in the presence of different TSA concentrations (0 nM, 15 nm, 50 nM and 100 nM) in the presence or absence of LIF. Thus, the treatments were evaluated in undifferentiated embryonic stem cells cultured in the presence of LIF (Control group: 0 nM LIF(+); Group 15 nM LIF+; Group 50 nM LIF+ and Group 100 nM LIF+), and in embryonic stem cells cultured in the absence of LIF (Control group: 0 nM LIF; Group 15 nM LIF(-); Group 50 nM LIF(-) and Group 100 nM LIF-). Treatment with TSA was performed for 24 h. After that the medium was replaced with fresh medium without TSA. Samples were collected at 0, 12, 24, 36 and 48 h after the beginning of the experiment. Three replicates were performed in each experimental group. The relative amount of Histone H3 lysine 9 acetylation was analyzed in all groups, as well as the cell proliferation in the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF. In the control group (0 nM), the absence of LIF resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac compared to the cultures supplemented with LIF. In the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF, the 50 nM and 100 nM treatments resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac when compared with 0 nM and 15 nM treatments. Evaluating the Hoechst area in the 0 nM group, it was observed that the number of cells increased (P < 0.05) according to the time of culture. Treatment with 15 nM also reflected a similar distribution, but the Hoechst area in 15 nM group was lower (P < 0.05) at 24 and 48h when compared to the observed in the control group. In the 100 nM treatment, was observed that the area of Hoechst was lower (P < 0.05) to that obtained in the control group at 12, 24 and 48h. In addition, it was observed that treatment with TSA induces greater cellular differentiation when compared to control groups in stem cells cultured in the presence of LIF as well as in the absence of LIF.Discussion: In the present study it was observed that TSA treatment increased the levels of histone acetylation in murine embryonic stem cells at a 50 nM concentration, making it possible to reduce the concentration recommended in the literature (100 nM). In addtion, it was concluded that the lower TSA concentrations utilized (15 nm and 50 nM) was less harmful to cellular proliferation than the 100 nM TSA concentration.

Diferentes critérios de formulação de rações para frangos de corte no período de 1 a 21 dias de idade

Dois experimentos foram realizados com o objetivo de avaliar diferentes critérios de formulação de rações, baseados em aminoácidos totais e digestíveis, para frangos de corte no período de 1 a 21 dias de idade. As dietas foram formuladas para atender às exigências de metionina, metionina+cistina, lisina e treonina. No primeiro experimento, foram utilizados 800 pintos machos, Hubbard, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado com 4 critérios de formulação, para atender às exigências em aminoácidos totais - NRC (1994), Rostagno et al. (1992), Degussa (1997) e AEC (1993), com 4 repetições de 50 aves. No segundo experimento, foram utilizados 600 pintos machos, Cobb, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado com 3 critérios de formulação, para atender às exigências em aminoácidos digestíveis - Rostagno et al. (2000), Baker & Han (1994) e Degussa (1997), com 4 repetições de 50 aves. Foram avaliados ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar. Os resultados obtidos demonstraram não haver diferença no desempenho das aves ao serem alimentadas com diferentes critérios de formulação baseados em aminoácidos totais. Ao formular dietas com aminoácidos digestíveis, o padrão estabelecido por Baker & Han (1994) resultaram em melhor desempenho das aves no período avaliado.

Avaliação do Desempenho e Excreção de Cálcio em Duas Linhagens de Frangos de Corte, na Fase Inicial, Alimentados com Diferentes Níveis de Aminoácidos e de Cálcio

Dois experimentos foram realizados com o objetivo de avaliar os efeitos de diferentes níveis de aminoácidos e de cálcio sobre o desempenho e excreção de cálcio de duas linhagens de frangos de corte (Cobb e Avian Farms) na fase inicial de criação. Foram avaliados os dados de desempenho (consumo de ração, ganho de peso e conversão alimentar) e excreção de cálcio. Foram utilizadas 540 aves, em cada experimento, distribuídas em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x2, ou seja, 3 perfis de aminoácidos (metionina, metionina+cistina, lisina e treonina - 100%, 125% e 150% dos níveis do NRC,1994) e 2 níveis de cálcio (75% e 100% dos níveis do NRC,1994), com 30 aves por repetição. Analisou-se o cálcio excretado das aves, e para tanto, utilizou-se 72 aves, em cada experimento, alojadas em gaiolas, seguindo o mesmo delineamento descrito anteriormente. Não houve interação entre os tratamentos estudados. Para a linhagem Avian Farms, o ganho de peso diminuiu com a elevação dos níveis de aminoácidos e ocorreu menor excreção de cálcio com menor nível de cálcio da dieta. A linhagem Cobb não foi influenciada pelos tratamentos em nenhum dos parâmetros estudados.

Desempenho, rendimento de carcaça e excreção de cálcio de frangos de corte alimentados com diferentes níveis de aminoácidos e cálcio no período de 22 a 42 dias de idade

Um experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar diferentes níveis de aminoácidos e de cálcio para frangos de corte no período de 22 a 42 dias de idade. Avaliou-se o desempenho, o rendimento de carcaça e a excreção de cálcio. Foram utilizadas 540 aves, machos, da marca comercial Cobb, distribuídas em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x2, ou seja, 3 níveis de aminoácidos (metionina, metionina+cistina, lisina e treonina - 100%, 125% e 150% NRC,1994) e 2 níveis de cálcio (75% e 100% NRC,1994), com 3 repetições de 30 aves cada. Os aminoácidos estudados foram metionina, metionina+cistina, lisina e treonina. O desempenho das aves foi avaliado pelo peso vivo, ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar. O rendimento de carcaça e a percentagem de cada parte foram avaliados de 2 aves de cada repetição, escolhidas ao acaso, perfazendo um total de 6 animais por tratamento. O rendimento de carcaça foi realizado após o abate levando-se em consideração a percentagem de peito, pernas (coxa+sobrecoxa), asas, dorso, cabeça+pescoço e pés em relação à carcaça eviscerada. Além disso, analisou-se o cálcio excretado pelas aves. Para tanto, utilizou-se 72 aves, alojadas em gaiolas, seguindo o mesmo delineamento descrito anteriormente. Não houve interação entre os fatores estudados para as características avaliadas. As que consumiram dietas com 125% e 150% de aminoácidos apresentaram melhor conversão alimentar. O rendimento de peito foi afetado pelos níveis de cálcio.