Ageing exacerbates damage of systemic and salivary neutrophils from patients presenting Candida-related denture stomatitis

Abstract Background Ageing leads to a decline in the function of the immune system, increasing the body's susceptibility to infections through the impairment of T-cells, macrophages, neutrophils and dendritic cells Denture stomatitis is a primary oral disease affecting elderly denture wearers. The major etiologic factor involved in this pathology is the infection by Candida albicans, an opportunistic pathogen that causes local and disseminated diseases in immunosuppressed humans. Neutrophils play a critical role in the immune response against C. albicans and are continually present in the salivary fluid and in the blood. The aim of this study was to determine ageing-related changes in salivary and blood neutrophils and their potential implications in Candida-related denture stomatitis. Results Our results showed a lower number of neutrophils in the saliva from patients presenting Candida-related denture stomatitis in comparison to their matched controls. Furthermore, fewer neutrophils were isolated from the saliva of aged control individuals in comparison to matched younger subjects. CXCR1, CD62L and CD11b expression were significantly greater on systemic neutrophils from younger control individuals. Elderly individuals showed more apoptotic salivary neutrophils and lower GM-CSF levels than younger ones, regardless of the occurrence of Candida infection. On the other hand, CXCL-8 concentrations were higher in the saliva from elderly individuals. Besides, TNF-α was detected at elevated levels in the saliva from infected elderly subjects. Salivary neutrophils from elderly and young patients presented impaired phagocytic activity against C. albicans. However, just systemic neutrophils from elderly showed decreased phagocytosis when compared to the younger ones, regardless of the occurrence of infection. In addition, neutrophils from aged individuals and young patients presented low fungicidal activity. Conclusion The data suggests that the Candida related-denture stomatitis is associated to neutrophils function deficiency, and ageing drastically appears to alter important characteristics of such cells, facilitating the establishment of this infection.

Clinical, epidemiological and molecular features of the HIV-1 subtype C and recombinant forms that are circulating in the city of São Paulo, Brazil

Abstract Background The city of Sao Paulo has the highest AIDS case rate, with nearly 60% in Brazil. Despite, several studies involving molecular epidemiology, lack of data regarding a large cohort study has not been published from this city. Objectives This study aimed to describe the HIV-1 subtypes, recombinant forms and drug resistance mutations, according to subtype, with emphasis on subtype C and BC recombinants in the city of São Paulo, Brazil. Study design RNA was extracted from the plasma samples of 302 HIV-1-seropositive subjects, of which 211 were drug-naive and 82 were exposed to ART. HIV-1 partial pol region sequences were used in phylogenetic analyses for subtyping and identification of drug resistance mutations. The envelope gene of subtype C and BC samples was also sequenced. Results From partial pol gene analyses, 239 samples (79.1%) were assigned as subtype B, 23 (7.6%) were F1, 16 (5.3%) were subtype C and 24 (8%) were mosaics (3 CRF28/CRF29-like). The subtype C and BC recombinants were mainly identified in drug-naïve patients (72.7%) and the heterosexual risk exposure category (86.3%), whereas for subtype B, these values were 69.9% and 57.3%, respectively (p = 0.97 and p = 0.015, respectively). An increasing trend of subtype C and BC recombinants was observed (p < 0.01). Conclusion The HIV-1 subtype C and CRFs seem to have emerged over the last few years in the city of São Paulo, principally among the heterosexual population. These findings may have an impact on preventive measures and vaccine development in Brazil.

Periódicos de Ciência da Informação nas bases de dados internacionais

PO artigo demonstra as interações entre algumas bases de dados internacionais na disponibilização de periódicos da área de Ciência da Informação. Para isso, foram investigadas seis bases de dados com acesso a texto completo dentro da área de Ciência da Informação. Foram elas: Web of Science, Scopus, Library, Information Science & Technology Abstracts, Information Science & Technology Abstracts, Library Literature Information Science – full text e Library Information Science Abstract. No desenvolvimento da pesquisa foram utilizados conceitos, princípios e equações da ‘teoria ingênua dos conjuntos’, o que permitiu observar as bases de dados como conjuntos compostos por elementos, aqui considerados os títulos de periódicos, bem como conferir consistência aos resultados. A análise dos dados foi dividida em três etapas, a saber: a) a primeira priorizou o cruzamento entre as duas maiores bases de dados utilizadas para levantamento bibliográfico (Web of Science e Scopus), seguido do cruzamento com a mais utilizada na Ciência da Informação, a Library and Information Science Abstracts; b) a segunda etapa tratou somente do cruzamento das bases especialistas da área; c) a terceira e última etapa tratou da interseção de todas as bases de dados do estudo. O resultado mostra que 10 títulos de periódicos constituem a interseção dos seis conjuntos de bases de dados. Foi possível identificar, também, o número de periódicos disponibilizados exclusivamente por uma base de dados, demonstrando que as necessidades de pesquisas bibliográficas exaustivas passam, obrigatoriamente, pelo levantamento em todas as bases de dados aqui elencadas.

Liver accumulation of Plasmodium chabaudi-infected red blood cells and modulation of regulatory T Cell and dendritic cell responses

It is postulated that accumulation of malaria-infected Red Blood Cells (iRBCs) in the liver could be a parasitic escape mechanism against full destruction by the host immune system. Therefore, we evaluated the in vivo mechanism of this accumulation and its potential immunological consequences. A massive liver accumulation of P. c. chabaudi AS-iRBCs (PciRBCs) was observed by intravital microscopy along with an over expression of ICAM-1 on day 7 of the infection, as measured by qRT-PCR. Phenotypic changes were also observed in regulatory T cells (Tregs) and dendritic cells (DCs) that were isolated from infected livers, which indicate a functional role for Tregs in the regulation of the liver inflammatory immune response. In fact, the suppressive function of liver-Tregs was in vitro tested, which demonstrated the capacity of these cells to suppress naive T cell activation to the same extent as that observed for spleen-Tregs. On the other hand, it is already known that CD4+ T cells isolated from spleens of protozoan parasite-infected mice are refractory to proliferate in vivo. In our experiments, we observed a similar lack of in vitro proliferative capacity in liver CD4+ T cells that were isolated on day 7 of infection. It is also known that nitric oxide and IL-10 are partially involved in acute phase immunosuppression; we found high expression levels of IL-10 and iNOS mRNA in day 7-infected livers, which indicates a possible role for these molecules in the observed immune suppression. Taken together, these results indicate that malaria parasite accumulation within the liver could be an escape mechanism to avoid sterile immunity sponsored by a tolerogenic environment.

Prototipo de herramienta para el inventariado automático de piezas de Lego basado en visión artificial

Permitida la difusión del código bajo los términos de la licencia BSD de tres cláusulas.

Variazione dei markers di attivata coagulazione indotta dalla terapia infusionale con Infliximab in pazienti affetti da malattie infiammatorie croniche intestinali

INTRODUCTION: A relationship between inflammatory response and coagulation is suggested by many observations. In particular, pro-inflammatory cytokines, such as TNFalpha, promote the activation of coagulation and reduce the production of anticoagulant molecules. It is known that inflammatory bowel diseases show a prothrombotic state and a condition of hypercoagulability. Aim of our study was to evaluate whether anti-TNFalpha therapy induces changes in the levels of coagulation activation markers in IBD patients. MATERIALS AND METHODS: We analyzed 48 plasma samples obtained before and 1 hour after 24 infliximab infusions (5 mg/kg) in 9 IBD patients (5 men and 4 women; mean age: 47.6+17.6 years; 4 Crohn's disease, 4 Ulcerative Colitis,1 Indeterminate Colitis). F1+2 and D-dymer levels were measured in each sample using ELISA methods.The data were statistically analyzed by means of Wilcoxon matched paired test. RESULTS: Median F1+2 levels were markdely reduced 1 hour after anti-TNFα infusion (median pre-infusion levels were 247.0 pmol/L and median post-infusion levels were 185.3 pmol/L) (p<0.002). Median D-dymer levels were also significantly reduced, from 485.2 ng/mL to 427.6 ng/mL (p< 0.001). These modifications were more evident in patients naive for infliximab therapy (p<0.02 for F1+2 and p<0.02 for D-dymer) and in Crohn's disease compared with Ulcerative Colitis patients (p=0.01 for F1+2 and p<0.007 for D-dymer).CONCLUSIONS: Infusion of infliximab significantly reduces the activation of coagulation cascade in IBD patients. This effect is early enough to suggest a direct effect of infliximab on the coagulation cascade and a possible new anti-inflammatory mechanism of action of this molecule.

L'influenza del sonno sull'andamento temporale della consolidazione delle abilità procedurali

Background: It is well known, since the pioneristic observation by Jenkins and Dallenbach (Am J Psychol 1924;35:605-12), that a period of sleep provides a specific advantage for the consolidation of newly acquired informations. Recent research about the possible enhancing effect of sleep on memory consolidation has focused on procedural memory (part of non-declarative memory system, according to Squire’s taxonomy), as it appears the memory sub-system for which the available data are more consistent. The acquisition of a procedural skill follows a typical time course, consisting in a substantial practice-dependent learning followed by a slow, off-line improvement. Sleep seems to play a critical role in promoting the process of slow learning, by consolidating memory traces and making them more stable and resistant to interferences. If sleep is critical for the consolidation of a procedural skill, then an alteration of the organization of sleep should result in a less effective consolidation, and therefore in a reduced memory performance. Such alteration can be experimentally induced, as in a deprivation protocol, or it can be naturally observed in some sleep disorders as, for example, in narcolepsy. In this research, a group of narcoleptic patients, and a group of matched healthy controls, were tested in two different procedural abilities, in order to better define the size and time course of sleep contribution to memory consolidation. Experimental Procedure: A Texture Discrimination Task (Karni & Sagi, Nature 1993;365:250-2) and a Finger Tapping Task (Walker et al., Neuron 2002;35:205-11) were administered to two indipendent samples of drug-naive patients with first-diagnosed narcolepsy with cataplexy (International Classification of Sleep Disorder 2nd ed., 2005), and two samples of matched healthy controls. In the Texture Discrimination task, subjects (n=22) had to learn to recognize a complex visual array on the screen of a personal computer, while in the Finger Tapping task (n=14) they had to press a numeric sequence on a standard keyboard, as quickly and accurately as possible. Three subsequent experimental sessions were scheduled for each partecipant, namely a training session, a first retrieval session the next day, and a second retrieval session one week later. To test for possible circadian effects on learning, half of the subjects performed the training session at 11 a.m. and half at 17 p.m. Performance at training session was taken as a measure of the practice-dependent learning, while performance of subsequent sessions were taken as a measure of the consolidation level achieved respectively after one and seven nights of sleep. Between training and first retrieval session, all participants spent a night in a sleep laboratory and underwent a polygraphic recording. Results and Discussion: In both experimental tasks, while healthy controls improved their performance after one night of undisturbed sleep, narcoleptic patients showed a non statistically significant learning. Despite this, at the second retrieval session either healthy controls and narcoleptics improved their skills. Narcoleptics improved relatively more than controls between first and second retrieval session in the texture discrimination ability, while their performance remained largely lower in the motor (FTT) ability. Sleep parameters showed a grater fragmentation in the sleep of the pathological group, and a different distribution of Stage 1 and 2 NREM sleep in the two groups, being thus consistent with the hypothesis of a lower consolidation power of sleep in narcoleptic patients. Moreover, REM density of the first part of the night of healthy subjects showed a significant correlation with the amount of improvement achieved at the first retrieval session in TDT task, supporting the hypothesis that REM sleep plays an important role in the consolidation of visuo-perceptual skills. Taken together, these results speak in favor of a slower, rather than lower consolidation of procedural skills in narcoleptic patients. Finally, an explanation of the results, based on the possible role of sleep in contrasting the interference provided by task repetition is proposed.

Bedeutung endogener Faktoren für Steady-State-Level und Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen in Säugerzellen

Die endogene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - wie beispielsweise Hydroxyl-Radikale, Superoxid-Radikalanionen, Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff - bei essentiellen Stoffwechselreaktionen in allen aeroben Lebewesen stellt eine potentielle Gefahr für die Integrität der DNA in jeder Zelle dar. ROS generieren in der DNA unter anderem oxidative DNA-Modifikationen (zum größten Teil wahrscheinlich 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)), welche wiederum zu einem Teil zu Mutationen führen.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen vorgenommen, in welchem Ausmaß zum einen die Steady-State-Level oxidativer DNA-Schäden in Säugerzellen zum anderen die Reparaturgeschwindig-keiten solcher DNA-Modifikationen durch verschiedene endogene Faktoren beeinflußt werden.Im Mittelpunkt der Arbeit stand dabei die Charakterisierung der 8-Hydroxyguaninglykosylase der Säugerzellen. Sie ist das Produkt des OGG1-Gens, das erst 1997 kloniert wurde. In transfizierten Zellinien konnte durch eine konstitutive Überexpression des menschlichen OGG1-Gens demonstriert werden, daß die Reparatur von induzierten oxidativen Basenmodifikationen bis zu dreifach beschleunigt wird und daß eine Korrelation zwischen dem Grad der Überexpression und der Reparaturrate besteht. Dagegen waren die Steady-State-Level der oxidativen DNA-Schäden durch die Überexpression unbeeinflußt. Sowohl bei den spontanen Mutationsraten als auch bei den durch oxidative Schädigungen induzierten Mutationsfrequenzen konnte keine Erniedrigung bedingt durch die hOGG1-Überexpression beobachtet werden.Weitere Untersuchungen zur Bedeutung von Ogg1-Protein konnten in Mäusezellen durchgeführt werden, in denen das OGG1-homologe Mäusegen, mOGG1, homozygot inaktiviert (mOGG1(-/-)) worden war. Hierbei konnte gezeigt werden, daß in den mOGG1-defizienten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen (mOGG1(+/+)) eine Reparatur induzierter oxidativer Basenmodifikationen erst nach 8 h einsetzt, während in den Kontrollzellen schon nach 3-4 h 50 % der Modifikationen repariert waren. Die Steady-State-Level oxidativer Modifikationen in mOGG1(-/-)-Zellen waren in immortalisierten, schnell proliferierenden Mäusefibroblasten nur um den Faktor 1.4, in primären Mäusehepatocyten jedoch um den Faktor 2.5 gegenüber den Wildtyp-Zellen erhöht.Inwieweit das menschliche Reparaturprotein Xrcc1 (X-ray repair cross complementing group 1) auch an der Prozessierung oxidativer DNA-Modifikationen beteiligt ist, und ob dabei möglicherweise eine Interaktion mit Ogg1 vorliegt, wurde in der XRCC1-defizienten CHO-Zellinie EM9 untersucht. Dabei wurde ermittelt, daß weder die Steady-State-Level noch die Reparaturkinetiken der oxidativen Basenmodifikationen durch die XRCC1-Defizienz beeinflußt werden. Aufgrund weiterer Ergebnisse kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß das Xrcc1-Protein zumindest am Ligationsschritt während der Reparatur oxidativer DNA-Schäden beteiligt ist.In einem weiteren Schwerpunkt der Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede im Steady-State-Level in Abhängigkeit von Organ-, Gewebe- und Zelltyp auftreten. Dazu wurden Untersuchungen in Bronchialkarzinom-Zellinien verschiedener Subtypen durchgeführt. Des weiteren wurde zur Frage der Zelltyp-Abhängigkeit in der menschlichen Zellinie HL60 der Einfluß des Zelldifferenzierungsstadiums auf die Steady-State-Level untersucht.

Einfluß endogener und exogener Faktoren auf Bildung und Reparatur oxidativer DNA-Schäden

Für die Krebsentstehung sind nach heutigen Vorstellungen Mutationen in bestimmten Genen somatischer Zellen verantwortlich, die ihrerseits durch chemische Modifikationen der DNA (DNA-Schäden) verursacht werden. Von besonderem Interesse als DNA-schädigende Agentien sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die endogen - wie z.B. in der Lipidperoxidation oder mitochondrialen Atmungskette - oder exogen - z.B. durch Arzneimittel oder andere aus der Umwelt stammende Chemikalien - gebildet werden können. Dem Schutz der DNA vor dieser Schädigung und ihren Folgen dienen antioxidative Systeme und DNA-Reparatur, deren Effizienz von verschiedenen Genen der Zelle abhängig ist. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses bestimmter Faktoren auf die Bildung, Inhibierung (antioxidative Wirkung) und Reparatur oxidativer DNA-Schäden. Als Beispiel für exogene Stoffe, die zur Bildung oxidativer DNA-Schäden führen, wurden die Gyrasehemmer Ofloxacin und Norfloxacin nach Bestrahlung mit UV-360 untersucht. Unter Verwendung spezifischer DNA-Reparatur-endonukleasen als Sonden (Fpg-Protein, Endonuklease III, Endonuklease IV, Exonuklease III, T4 Endonuklease V) wurden spezifisch DNA-Modifikationen an zellfreier und zellulärer DNA quantifiziert. Es zeigte sich, daß es sich im Falle des Ofloxacins bei der ultimal mit der DNA reagierenden reaktiven Spezies um Hydroxylradikale handelt, während durch Norfloxacin Singulettsauerstoff entsteht. Durch Zusatz verschiedener Antioxidantien konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Im Gegensatz zu Hydroxylradikalen ist über die DNA-Schäden und Mutationen durch Alkoxyl-Radikale, die endogen bei der Lipidperoxidation entstehen, nichts bekannt. Die Substanz BCBT ([4-[(tert-Butyldioxy)carbonyl]benzyl]-triethyl-ammonium-chlorid) generiert Alkoxyl-Radikale. BCBT + UV-360 induzierte vorwiegend Fpg-sensitive Modifikationen, die durch Bestimmung mittels HPLC/ECD zu 83 ± 18% als 8-Hydroxyguanin identifiziert wurden. Der Vergleich des Einflusses der Zusätze tert-Butanol und Natriumazid auf die Schädigung mit BCBT mit anderen reaktiven Spezies zeigte klar, daß die Schädigung hier über Alkoxyl-Radikale verläuft. Die Analyse und Sequenzierung der durch BCBT induzierten Mutanten zeigte, daß vorwiegend GC->TA Transversionen gebildet werden, die auf 8-oxoG zurückzuführen sind. Auf der Ebene der Antioxidantien wurde der Einfluß des zelleigenen Glutathions untersucht. Mit der Depletion des Glutathion-Gehalts durch Vorbehandlung mit L-Buthionin-SR-sulfoximin (BSO) ging eine Erhöhung des Steady-State-Spiegels in den untersuchten AS52 Zellen einher. Selen ist ein wichtiges Spurenelement und u.a. Bestandteil von Glutathionperoxidasen (GPx). Um die Bedeutung von Selen bei der oxidativer DNA-Modifikationen bzw. deren Inhibierung zu untersuchen, wurden Natriumselenit und Ebselen eingesetzt. Ab einer Konzentration von 50 µM trat durch Natriumselenit eine Erhöhung des Steady-State-Spiegels auf (prooxidativer Effekt). Parallel mit der oxidativen Schädigung der DNA ist eine Erhöhung des zellulären Gehalts an Glutathion feststellbar. Ebselen bedingte in Konzentrationen bis 200 µM keine Erhöhung des Steady-State-Spiegels oder des Gehalts an reduziertem Glutathion. Beide Substanzen waren in der Lage, die durch sichtbares Licht und UV-B-Strahlung induzierten Einzelstrangbrüche zu reduzieren. Mikrokerne, die durch Schädigung mit den Agentien Kaliumbromat, Ro 19-8022 + Licht und Wasserstoffperoxid entstanden, waren ebenso durch Natriumselenit und Ebselen reduzierbar. In dieser Arbeit konnte ferner gezeigt werden, daß p53 keinen Einfluß auf die Reparatur UV-induzierter Modifikationen (Nukleotidexzisionsreparatur) und die Reparatur Fpg-sensitiver Modifikationen (Basenexzisionsreparatur) hat.

Differentielle Zellzykluskontrolle bei Spiraliern und ihre Bedeutung für die Determination der Blastomeren

Bei inäqual furchenden Spiraliern, wie Platynereis dumerilii, entstehen durch die ersten beiden Furchungen vier unterschiedlich große und auch bereits unterschiedlich determinierte Blastomeren. Im allgemeinen ist die größte der vier Blastomeren die Gründerzelle des D-Quadranten (Dorresteijn und Fischer 1988). Dieser Quadrant etabliert die dorsoventrale Körperachse im Keim, indem er das Schicksal benachbarter Blastomeren über Zell-Zell-Interaktionen positionsgerecht bestimmt (Damen und Dictus 1996). Der D-Quadrant erhält bei Platynereis einen überproportional großen Anteil (60%) des gesamten dotterfreien Zytoplasmas im Keim (Dorresteijn 1990). Sein Schicksal wird durch morphogenetische Faktoren innerhalb des dotterfreien Zytoplasmas bestimmt. Der Gehalt an dotterfreiem Zytoplasma bestimmt nicht nur das Schicksal der Blastomeren, sondern korreliert auch direkt mit den jeweils unterschiedlichen Zellzyklusgeschwindigkeiten der Blastomeren. Die plasmareichen Zellen des D-Quadranten, aber auch bereits die Vorläuferzelle CD, teilen sich im Vergleich mit den jeweils anderen Blastomeren im Keim besonders rasch (Dorresteijn 1990). In dieser Arbeit wurde unter verschiedenen Aspekten untersucht (a) inwieweit die Etablierung der dorsoventralen Körperachse von der raschen Proliferation der D-Zellinie abhängt, (b) inwieweit Zellzyklusregulatoren Bestandteil der oben genannten morphogenetischen Faktoren sein könnten und (c) wie die unterschiedlichen Zellzyklusgeschwindigkeiten auf molekularer Ebene reguliert werden.Zum einen wurden die frühen Furchungsstadien von Aplysia californica volumetrisch vermessen. Anders als bei den meisten inäqual furchenden Spiraliern wird bei Aplysia nicht der größte, sondern einer der kleineren embryonalen Quadranten als D-Quadrant determiniert. Ich konnte zeigen, daß die CD-Blastomere (27% des Eivolumens) dennoch, ähnlich wie bei Platynereis, bei der ersten Furchungsteilung überproportional viel dotterfreies Zytoplasma (40%) erhält und so als Vorläuferzelle des D-Quadranten determiniert wird. Bei der zweiten Furchung teilt sich die CD-Blastomere jedoch, anders als bei Platynereis, symmetrisch. Welche der beiden Tochterzellen von CD als definitiver D-Quadrant determiniert wird, erfordert also zusätzliche (induktive?) Mechanismen. Auch bei Aplysia sind die Zellzyklusgeschwindigkeiten der Blastomeren mit ihren jeweiligen Anteilen am dotterfreiem Zytoplasma korreliert. Das Postulat, daß die rasche Proliferation des D-Quadranten und seiner Vorläuferzelle CD für die Etablierung der dorsoventralen Körperachse und für die Determination der Blastomeren in Keimen inäqual furchender Spiralier erforderlich sind, konnte ich zusätzlich bestätigen, indem ich die Teilungsabfolge im Keim von Platynereis mit Hilfe des Cdc2-spezifischen Inhibitors Olomoucin experimentell abänderte. Durch pulse chase-Behandlung mit Olomoucin wurde erreicht, daß die Blastomeren die vierte Mitose, anders als im normalen Keim, synchron einleiteten. Die so behandelten Keime entwickelten sich zu Trochophorae, die keine oder nur eine stark reduzierte dorsoventrale Polarität erkennen ließen. Das dorsoventrale Muster entsteht in Keimen von Spiraliern durch die Organisatorwirkung der Blastomeren 3D und 4d und bei Platynereis eventuell auch 2d (Damen und Dictus 1996, Dorresteijn und Eich 1991). Der Teilungsvorsprung, den diese Blastomeren normalerweise gegenüber anderen Zellinien haben, war in den mit Olomoucin-behandelten Keimen stark vermindert. Dadurch haben diese Blastomeren ihre induktiven Kapazitäten möglicherweise nicht, oder nicht rechtzeitig erwerben können, um die benachbarten Zellen gemäß ihrer Position entlang der dorsoventralen Körperachse zu determinieren. Insofern ist die differentielle Zellzyklusregulation fest in das Determinationsgeschehen integriert. Das bedeutet auch, daß zellzyklusregulierende Faktoren Bestandteil der anfangs genannten

Untersuchungen von intrazellulären Signalwegen bei neuraler Determinierung und Differenzierung in vitro: Einfluß von GAP-43 und Bcl-2

Die PCC7-Mz1-Zellinie stellt ein geeignetes Modell dar, um frühe neurale Determinierungs- und Differenzierungsprozesse unter kontrollierten Bedingungen in vitro zu untersuchen. Aus pluripotenten Stammzellen entwickelt sich nach Behandlung mit dem Morphogen Retinsäure (RA) ein stabiles Muster aus Neuronen, Fibroblasten und Astroglia-Zellen. Parallel stirbt ein reproduzierbarer Anteil der Kultur apoptotisch. Zur näheren Aufklärung der molekularen Vorgänge während der neuralen Entwicklung wurde der Einfluß von zwei Schlüsselmolekülen - dem Proteinkinase C Substrat (PKC) GAP-43 sowie dem antiapoptotischen Bcl-2 Protein - auf die neurale Differenzierung und die damit assoziierten Apoptoseereignisse der PCC7-Mz1-Zellen untersucht. Dazu wurden stabile Zellinien, die eine Überexpression von GAP-43 bzw. von Bcl-2 aufwiesen, hergestellt. GAP-43In PCC7-Mz1-Zellen wurde die Expression von GAP-43 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene innerhalb von 24 Stunden nach Zugabe von RA hochreguliert. GAP-43 war bereits in noch proliferierenden neuronalen Vorläuferzellen als Substrat für PKC und als Interaktionspartner von Calmodulin funktionell. Die Überexpression von GAP-43 in PCC7-Mz1-Zellen förderte die Ausprägung des neuronalen Phänotyps. Das Differenzierungspotential der Mz-GAP-43 Klone war eingeschränkt, da sich nach Induktion mit RA aus den Stammzellen nur noch Neurone, aber keine Fibroblasten und Astroglia-Zellen mehr entwickelten. Die Determinierung für das neuronale Entwicklungsschicksal war in den Mz-GAP-43 Klonen stärker fortgeschritten als in MzN-Klonen, die durch Subklonierung aus PCC7-Mz1-Zellen generiert wurden, da die GAP-43 überexprimierenden Zellen durch Wachstum auf Laminin nicht in den pluripotenten Phänotyp revertiert werden konnten. Aufgrund der Interaktion zwischen GAP-43 und Calmodulin in Stammzellen der Mz-GAP-43 Klone kann man vermuten, daß die neuronalen Determinierungsprozesse über Ca2+/Calmodulin-abhängige Signalwege verlaufen. Da das Gen für den Transkriptionsfaktor NCNF (

Untersuchungen zur Verwendbarkeit von Purinnukleotidgehalten als prognostische Marker bei humanen Mammacarzinomzellen

Ein bei unterschiedlichen Zellinien mit NMR-Spektroskopie beobachteter vorübergehender Anstieg von ATP während Anthracyclinbehandlungen sollte in vitro an Monolayern bzw. Sphäroiden der humanen Brustkrebszellinien T47D, MCF-7, MCF-7adr und MCF-7mdr während 24stündigen Inkubationen mit 10 oder 0,1 µM Doxorubicin systematisch untersucht werden. Wachstumskurven sowie Clonogenitäts- und Vitalitätstests ergaben, daß T47D Zellen wesentlich empfindlicher auf das Medikament reagierten, als die MCF-7 Linie oder deren resistente Subklone. Eine zusätzliche Behandlung mit dem (-Tocopherol-Analogon CR-6 führte zu einer Verstärkung der Doxorubicinwirkung. Licht- oder elektronenmikroskopische Untersuchungen an Monolayern und Sphäroiden zeigten sowohl Apoptosen als auch Nekrosen, wobei Apoptosen vermehrt bei weniger empfindlichen Zellen oder niedriger Dosierung auftraten. Die Quantifizierung der Purinnukleotide erfolgte mit Hilfe der HPLC, bei T47D Sphäroiden zusätzlich mit abbildender Biolumineszenz. Bei sämtlichen Zellinien wurden während der Behandlung mit 10 µM vorübergehende Anstiege aller Purinnukleotide gemessen, wobei GTP höher stieg (78 % der unbehandelten Kontrolle) als ATP (30 %). Der Anstieg war bei T47D Zellen wesentlich höher als bei MCF-7, die MCF-7 Subklone zeigten untereinander keine deutlichen Unterschiede. Bei Sphäroiden war der Effekt etwas geringer als bei Monolayern. Die Inkubation mit 0,1 µM führte zu einem deutlich geringeren Anstieg. Der Effekt korrelierte mit einem massiven vorwiegend nekrotischen Zellsterben.

Untersuchungen zur Zell-Transistor-Kopplung mittels der Voltage-Clamp-Technik

Untersuchungen zur Zell-Transistor Kopplung mittels der Voltage-Clamp TechnikIn der vorliegenden Arbeit wird die extrazelluläre Einkopplung elektrischer Signale von Zellen in Transistoren hinsichtlich der an der Kopplung beteiligten Parameter untersucht. Dafür werden Zellen aus Primärkulturen und von Zell-Linien direkt auf den aktiven Sensorflächen der hergestellten Chips kultiviert. Für die Experimente werden n- und p-Kanal Feldeffekttransistoren (FET) sowie Extended-Gate-Elektroden (EGE) mit Gold- und Titanoberflächen entwickelt.Zur Untersuchung der Kopplungseigenschaften werden die neuronale Zell-Linie SH-SY5Y, die humane Endothel Zell-Linie EA.hy-926 sowie als Primärzellen hippocampale Neuronen und Kardiomyozyten embryonaler und neonataler Ratten eingesetzt. Die Voltage-Clamp Technik erlaubt die Untersuchung spannungsgesteuerter Ionenkanäle in der Zellmembran. Maßgebend für den Signalverlauf des extrazellulär eingekoppelten Signals ist der Ionenstrom von Na+, K+ und Ca2+ durch die Membran im Kontaktbereich zwischen Zelle und Sensor.Die Kopplung kann elektrisch mithilfe eines Ersatzschaltkreises beschrieben werden, der alle beteiligten elektrischen Größen der Membran und der Ionenströme, sowie die Parameter des Kontaktbereichs und des Sensors enthält.Die Simulation der extrazellulären Signale zeigt, dass die beobachteten Signalformen nur durch eine Erhöhung der Ionenkanaldichten und dadurch einer deutlich vergrößerten Leitfähigkeit der Ionenarten im Kontaktbereich gegenüber der freien Membran erklärt werden können.

Quantitative Untersuchungen zur mRNA-Expression verschiedener Neurotransmitterrezeptoren im Verlauf der neuronalen Entwicklung der Zellinie PCC7-Mz1

Die murine embryonale Karzinomazellinie PCC7-Mz1 stellt ein Modell neuronaler Entwicklung dar, da nach RA-Gabe eine Differenzierung in neuronale, gliale und fibroblastoide Phänotypen erfolgt. Um die Expression von Neurotransmitterrezeptoren während der neuronalen Entwicklung zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine quantitative Analyse der Expression verschiedener Neurotransmitterrezeptoren im Verlauf der RA-induzierten Differenzierung der PCC7-Mz1 Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine kompetitive RT-PCR eingesetzt. Als Kompetitor wurde ein synthetisches Gen ( SG) konstruiert, das sich aus den Antisense- und Sense-Primersequenzen zur spezifischen Amplifikation des Dopaminrezeptors D2, des Serotoninrezeptors 5HT3, der GABAA-Untereinheiten ß1 und ß3, der metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR1 und mGluR5, der 5 NMDA-Rezeptoruntereinheiten 1,2a,2b,2c und 2d, der Markerproteine Synaptophysin und GFAP, und der Untereinheiten a3, a4 und a7 des nikotinischen Acetylcholinrezeptors zusammensetzt. Mit diesem SG erfolgten die Quantifizierungen der Rezeptor-mRNA im Sättigungsbereich der PCR. Die erhaltenen Transkriptmengen wurden auf ein Neuron bezogen, wodurch eine Korrelation zur neuronalen Entwicklung erfolgen konnte.

Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie aus dem marinen Schwamm Geodia cydonium

Der evolutionär älteste Tierstamm der Metazoa, die Schwämme (Porifera), bietet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Selbst/Fremd-Erkennung an. Diese Unterscheidung wurde bei der Evolution von einzelligen zu mehrzelligen Tieren wichtig. Schwämme besitzen ein angeborenes Immunsystem. Ob sie auch Vorläufer der Immunrezeptoren aufweisen, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Einen ersten Schritt stellte die Identifizierung weiterer Gene mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen dar. Mit der Isolierung der beiden 'Schwamm-Adhäsionsmoleküle' GCSAML und GCSAMS durch ein Homologiescreening ist dies gelungen. Die Beteiligung dieser Moleküle an einer Immunantwort wurde mit Hilfe von Transplantationsexperimenten untersucht. Die Gewebe von Autotransplantaten fusionierten, während es bei Allotransplantaten zu einer Abstoßung des eingesetzten Gewebes kam. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen sowohl an Geodia cydonium- als auch an Suberites domuncula-Zellen konnte gezeigt werden, daß Moleküle mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen an den Transplantationsprozessen beteiligt sind. Northern Blot-Analysen zeigten die Beteiligung speziell von GCSAML an der Autotransplantation. Western Blot-Analysen bestätigten diese Ergebnisse und weiteten sie auf Allotransplantationen aus. Beide GCSAM-Gene können der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden. GCSAML kann durch die Existenz des sogenannten ITIM-Motives weiter in die spezielle Klasse der inhibitorischen Rezeptoren gruppiert werden und stellt damit einen Vorläufer der Immunrezeptoren dar.