Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae–bacteriophage combination from the caecal effluent of a healthy woman

A recent study characterizing bacteriophage populations within human caecal effluent demonstrated the presence of numerous Podoviridae, Siphoviridae and Myoviridae within this material (Hoyles et al., 2014, Res Microbiol 165, 803–812). Further to this work, anaerobic bacteria were isolated on fastidious anaerobe agar from the caecal effluent of a healthy 31-year-old woman. Ten colonies were selected at random, streaked to purity and screened against the remaining caecal effluent (filter-sterilized, 0.45 μm pore size) in an attempt to isolate lytic bacteriophages. Bacteriophages within the effluent [2×105 ± 2.65×103 (n=3) pfu/ml] were active against five of the isolates, all identified by 16S rRNA gene sequence analysis as Klebsiella pneumoniae. One of the five isolates, L4-FAA5, was characterized further and found to be K. pneumoniae subsp. pneumoniae capsule type K2 rmpA+, and was used to propagate a bacteriophage (which we named KLPN1) to purity. Bacteriophage KLPN1 was a member of the Siphoviridae with a rosette-like tail tip and exhibited depolymerase activity, demonstrated by the formation of plaque-surrounding haloes that increased in size over the course of incubation. When screened against a panel of 21 clinical strains representing unknown K. pneumoniae subsp. pneumoniae capsule types and types K1, K2, K5, K20, K54 and K57, KLPN1 infected only K2 strains, but did not exhibit depolymerase activity against these. Whole-genome sequence analysis of KLPN1 showed the bacteriophage to have a genome of 49,037 bp (50.53 GC mol%) comprising 73 predicted ORFs, of which 22 encoded genes associated with structure, host recognition, packaging, DNA replication and cell lysis. The host recognition-associated gene was a potential depolymerase. This is the first report of the isolation of a bacterium–bacteriophage combination from the human caecum, and only the third member of the Siphoviridae known to infect K. pneumoniae subsp. pneumoniae.

Kroppenstedtia pulmonis sp. nov. and Kroppenstedtia sanguinis sp. nov., isolated from human patients

Three human clinical strains (W9323T , X0209T and X0394) isolated from lung biopsy, blood and cerebral spinal fluid, respectively, were characterized using a polyphasic taxonomic approach. Comparative analysis of the 16S rRNA gene sequences showed the three strains belonged to two novel branches within the genus Kroppenstedtia : 16S rRNA gene sequence analysis of W9323T showed closest sequence similarity to Kroppenstedtia eburnea JFMB- ATET (95.3 %), Kroppenstedtia guangzhouensis GD02T (94.7 %) and strain X0209T (94.6 %); sequence analysis of strain X0209T showed closest sequence similarity to K . eburnea JFMB- ATET (96.4 %) and K. guangzhouensis GD02T (96.0 %). Strains X0209T and X0394 were 99.9 % similar to each other by 16S rRNA gene sequence analysis. The DNA- DNA relatedness was 94.6 %, confirming that X0209T and X0394 belong to the same species. Chemotaxonomic data for strains W9323T and X0209T were consistent with those described for the genus Kroppenstedtia : whole- cell peptidoglycan contained LL- diaminopimelic acid; the major cellular fatty acids were iso- C15 and anteiso- C15 ; and the major menaquinone was MK- 7. Different endospore morphology, carbon utilization profiles, and whole cell wall sugar patterns of strains W9323T and X0209T supported by phylogenetic analysis enabled us to conclude that the strains represent two new species within the genus Kroppenstedtia , for which the names Kroppenstedtia pulmonis sp. nov. (type strain W9323T = DSM 45752T = CCUG 68107T) and Kroppenstedtia sanguinis sp. nov. (type strain X0209T = DSM 45749T = CCUG 38657T) are proposed.

Polymerase Chain Reaction Screening for Fungemia and/or Invasive Fungal Infections in Patients with Hematologic Malignancies

INTRODUCTION: Invasive fungal infections (IFIs) are a life-threatening complication in patients with hematologic malignancies, mainly in acute leukemia patients, following chemotherapy. IFI incidence is increasing, and associated mortality remains high due to unreliable diagnosis. Antifungal drugs are often limited by inadequate antimicrobial spectrum and side effects. Thus, the detection of circulating fungal DNA has been advocated as a rapid, more sensitive diagnostic tool. PATIENTS AND METHODS: Between June 01 and January 03, weekly blood samples (1,311) were screened from 193 patients undergoing intensive myelosuppressive or immunosuppressive therapy. IFI cases were classified according to European Organization for Research and Treatment of Cancer/Mycoses Study Group criteria. Fungal DNA was extracted from whole blood and amplified using polymerase chain reaction (PCR) published primers that bind to the conserved regions of the fungal 18S rRNA gene sequence. In our study, two or more consecutive positive samples were always associated with fungal disease. RESULTS: PCR screening predicted the development of IFI to be 17 days (median). This test had a specificity of 91.1% and a sensitivity of 75%. IFI incidence was 7.8%. DISCUSSION: Therefore, our results confirm the potential usefulness of PCR serial screening and the clinical applicability in everyday routine. PCR screening offers a noninvasive repeatable aid to the diagnosis of IFI.

Caracterização de múltiplos polimorfismos de Pneumocystis Jirovecii por multiplex-PCR/Single base extension

Pneumocystis jirovecii é conhecido por causar infecções específicas no aparelho respiratório de seus hospedeiros, principalmente em doentes imunocomprometidos, manifestando-se por uma pneumonia grave e por vezes fatal, normalmente designada por pneumonia por Pneumocystis. A caracterização da diversidade genética de P. jirovecii tem demonstrado que determinados polimorfismos de base única poderão ser reconhecidos como marcadores moleculares de eleição para o estudo da distribuição geográfica, vias de transmissão, resistência/susceptibilidade a fármacos, factores de virulência e genética populacional de subtipos genéticos. Este estudo teve como objectivo a caracterização de polimorfismos de P. jirovecii, através da metodologia PCR multiplex/Extensão de base única (do inglês single base extension), com a principal finalidade de constatar eventuais associações entre polimorfismos de base única, genótipos multilocus, e dados clínicos e demográficos da infecção. Sessenta e seis espécimes pulmonares, previamente considerados positivos para P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2012, a partir de doentes portugueses imunocomprometidos, foram seleccionados de forma aleatória para este estudo multilocus. PCR multiplex foi utilizada para a amplificação simultânea de três regiões genómicas: subunidade grande do rRNA mitocondrial, superóxido dismutase e dihidropteroato sintetase. Cinco polimorfismos de base única, previamente correlacionados com parâmetros da doença, foram genotipados por extensão de base única: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 e DHPS171. Um total de 330 polimorfismos de base única e 29 genótipos multilocus putativos de P. jirovecii foram identificados e caracterizados nos espécimes pulmonares analisados. Os padrões de distribuição dos polimorfismos foram analisados, sendo considerada a variação temporal e/ou geográfica das suas formas alélicas. Constatou-se grande diversidade genotípica entre os isolados de P. jirovecii que poderá ter influência a nível epidemiológico. Foram observadas associações estatísticas entre mt85/genótipos multilocus e parâmetros demográficos e clínicos. A correlação mais importante verificou-se entre mt85C e cargas parasitárias baixas a moderadas, enquanto mt85T foi associado com cargas parasitárias altas; MLG5, MLG9 e MLG13 foram associados com cargas parasitárias baixas, moderadas e altas, respectivamente. Tais associações demonstram que potenciais marcadores moleculares da infecção por P. jirovecii poderão existir e que polimorfismos/genótipos específicos poderão determinar perfis epidemiológicos da pneumonia por Pneumocystis. A análise genética cruzada permitiu verificar associações entre polimorfismos de base única. Os polimorfismos SOD110T e SOD215C, SOD110C e SOD215T, DHPS165A e DHPS171C, DHPS165G e DHPS171T foram associados estatisticamente. Os genótipos multilocus mais prevalentes foram considerados para o teste recombinatório d1. Dois genótipos multilocus (MLG7 e MLG9) foram observados com elevada frequência, e a análise genética indicou que estes se encontravam sobre-representados na população de P. jirovecii estudada. Estas evidências indicam que o fenómeno de desequilíbrio de ligação e a propagação clonal de subtipos genéticos é frequente, considerando que a espécie P. jirovecii poderá ser representada por uma população com estrutura epidémica. O presente trabalho confirmou a importância do estudo de polimorfismos em P. jirovecii, sugerindo que a caracterização multilocus poderá fornecer informação relevante para a compreensão dos padrões, causas e controlo da infecção, melhorando assim a investigação deste importante patogéneo.

Comportamento biológico "in vitro" de "novas espécies" de Leishmania no Velho Mundo

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo parasita protozoário Leishmania sp. Na Bacia mediterrânica, Leishmania infantum, é a principal espécie causadora de leishmaniose visceral, a forma mais severa da doença, sendo L. major um dos agentes etiológicos da leishmaniose cutânea. Apesar de se considerar que estes parasitas têm uma reprodução essencialmente clonal, nos últimos 20 anos tem vindo a ser descrita a recombinação genética entre diferentes estirpes e espécies, com ocorrência de híbridos naturais, quer no Velho quer no Novo Mundo. Recentemente, em Portugal, foram isoladas e identificadas pela primeira vez, estirpes híbridas de L. infantum/L. major. O presente estudo teve como principais objetivos, a pesquisa de “novas espécies” de Leishmania e a análise do comportamento “in vitro” de estirpes parentais e híbridas de L. infantum e L. major. Numa primeira parte do trabalho efetuou-se a cultura e pesquisa de DNA de Leishmania sp., em amostras de sangue medular de 229 cães provenientes de uma região endémica de Portugal, utilizando diferentes marcadores moleculares (kDNA, ITS1 e SSU rRNA) e protocolos de PCR. Não foi encontrado DNA de espécies híbridas, tendo-se no entanto, identificado DNA de Leishmania sp. em 45,85% (105/229) das amostras, incluindo cães sem sinais clínicos. Na segunda parte do trabalho, realizaram-se diversos ensaios “in vitro” com estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major e parentais L. infantum e L. major. Em condições normais de crescimento, observou-se um padrão de crescimento distinto para cada estirpe estudada. Em condições de “stress” oxidativo, destacou-se uma diferença significativa entre as duas estirpes híbridas estudadas. Em condições de “stress” nutricional, as estirpes não apresentaram diferenças entre si. Após avaliação da suscetibilidade das estirpes na presença de Anfotericina B, todas se mostraram suscetíveis, com concentrações inibitórias (CI50) entre 0.21 e 1.15 μg/mL. Após infeção em linhas celulares monocíticas, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na taxa e intensidade de infeção das estirpes híbridas em comparação às putativas parentais. Os resultados obtidos, contribuíram para um melhor conhecimento sobre o comportamento biológico destas estirpes híbridas naturais L. infantum/L. major. Estas demonstraram um comportamento “in vitro” intermédio, relativamente às estirpes parentais. Estes resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de outros estudos com estas “novas espécies”, nomeadamente estudos de patogenicidade “in vivo” e o papel de biomarcadores de virulência, que permitam um potencial prognóstico da infeção e avaliação do seu risco epidemiológico.

Fungi, bacteria and soil pH: the oxalate-carbonate pathway as a model for metabolic interaction

The oxalatecarbonate pathway involves the oxidation of calcium oxalate to low-magnesium calcite and represents a potential long-term terrestrial sink for atmospheric CO2. In this pathway, bacterial oxalate degradation is associated with a strong local alkalinization and subsequent carbonate precipitation. In order to test whether this process occurs in soil, the role of bacteria, fungi and calcium oxalate amendments was studied using microcosms. In a model system with sterile soil amended with laboratory cultures of oxalotrophic bacteria and fungi, the addition of calcium oxalate induced a distinct pH shift and led to the final precipitation of calcite. However, the simultaneous presence of bacteria and fungi was essential to drive this pH shift. Growth of both oxalotrophic bacteria and fungi was confirmed by qPCR on the frc (oxalotrophic bacteria) and 16S rRNA genes, and the quantification of ergosterol (active fungal biomass) respectively. The experiment was replicated in microcosms with non-sterilized soil. In this case, the bacterial and fungal contribution to oxalate degradation was evaluated by treatments with specific biocides (cycloheximide and bronopol). Results showed that the autochthonous microflora oxidized calcium oxalate and induced a significant soil alkalinization. Moreover, data confirmed the results from the model soil showing that bacteria are essentially responsible for the pH shift, but require the presence of fungi for their oxalotrophic activity. The combined results highlight that the interaction between bacteria and fungi is essential to drive metabolic processes in complex environments such as soil.

Estado reproductivo de la anchoveta peruana engraulis ringens durante los veranos 1996 y 1997

Mediante el análisis histológico de gónadas se muestra la variabilidad del estado reproductivo de la anchoveta peruana en distintas latitudes. En el año 1996 las áreas en las que se observó mayor actividad reproductiva estuvieron entre los grados 4°-14°S y 16° -18°S. El área 14°-16° se caracterizó por el predominio del estado de reposo sexual. En el año 1997 las áreas en las que hubo mayor actividad reproductiva fueron 4°-6°S y 8°-12°S; el estado de reposo sexual fue el predominante. Se observó un mayor porcentaje de hembras en desove en 1996 que en 1997, probablemente debido a que el verano de 1996 fue frío. Las hembras mayores de 14 cm fueron reproductivamente más activas que las de 12 a 14 cm.

Características del ambiente marino frente a la costa peruana

El ambiente marino frente al Perú es modificado considerablemente por eventos transcendentes de características opuestas: El Niño y La Niña, los mismos que se presentan alternadamente, con diferente intensidad y duración. La temperatura presenta sus máximos y mínimos valores en verano e invierno, respectivamente;ambos E:xtremos dela salinidad se registran en el verano; los nutrientes presentan sus mínimos valores en verano y máximos en el invierno, intensificándose el afloramiento. Frente a la costa peruana se presentan masas de aguas superficiales y subsuperficiales procedentes de la región subtropical, tropical, ecuatorial y de la región subantártica. La Corriente Peruana, se subdivide en Corriente Costera Peruana y Corriente Oceánica Peruana. En la capa subsuperficial se presentan la Corriente Peruana Subsuperficial y la Extensión Sur de la Corriente de Cromwell. El afloramiento, mecanismo esencial de la alta producción marina, se produce sobre todo en las zonas de los 4-5°S,7-8°S, 11-12°S y 14-15°S. Durante las últimas tres décadas tres eventos El Niño y dos Niñas de gran intensidad han afectado severamente el ecosistema marino peruano.

Cambios en el área de distribución de la merluza peruana: efecto de la pesquería y El Niño

La distribución y la talla de la merluza Merluccius gayi peruanus, frente a la costa peruana, exhiben dos patrones: (a) La distribución está determinada por la variación de la Corriente de Cromwell, causada por cambios estacionales (invierno - verano) y a efectos interanuales relacionados con El Niño; (b) Las tallas están relacionadas a la latitud, con individuos grandes en el norte y más pequeños al sur. Desde el inicio de la fuerte pesquería de arrastre de fondo en 1973, la merluza peruana ha sufrido reducción en la biomasa, además de cambios en la distribución y en la estructura poblacional. En este estudio se ha utilizado información obtenida en los cruceros de los años 1970, y también la frecuencia de longitudes y características biológicas anotadas por las flotas activas en diferentes latitudes, y colectadas por el Instituto del Mar del Perú (IMARPE) en Paita (5°S), Chimbote (9°S) y Callao (12°S). Los datos sobre distribución de la merluza adulta obtenidos de cruceros científicos en diferentes períodos, y un tratamiento separado de longitudes registradas en varios puertos, permitieron reconstruir la distribución de tallas en la serie de tiempo para los tres puertos de desembarque mencionados. Durante los años 1970 se halló merluzas grandes, con talla media >40 cm (edad 4+), hasta el Callao por el sur. Se discute la presencia de estas tallas en aquella área con relación al efecto directo de las pesquerías combinadas de arrastre y cerco, sobre la biomasa de esta especie y su rango de distribución. Se discuten posibles efectos indirectos sobre la merluza, a corto y largo plazo, ocasionados por cambios en biomasa y distribución de la anchoveta, y por los cambios a largo plazo (decadales) del ambiente físico.

Madurez sexual, frecuencia de desove y fecundidad de la anchoveta peruana durante invierno-primavera de 1997

Analiza tres aspectos importantes en el estudio de la biología reproductiva de la anchoveta Engraulis ringens: el estado reproductivo por grado latitudinal (entre 16° y 5°S), la frecuencia de desove y la fecundidad parcial. El desove fue más intenso en el área comprendida entre los grados 10°S y 12°S. La frecuencia de desove fue 0,071, disminuyendo en 32,0% en comparación al cálculo del año anterior.

Biomasas de especies pelágicas en el mar peruano a comienzos de otoño de 1998. Crucero BIC Humboldt 9803-05 de Tumbes a Tacna

Se estimó la biomasa de las especies pelágicas anchoveta, sardina, jurel, caballa y samasa mediante la técnica Hidroacústica, entre el 20 de marzo y el 7 de mayo de 1998, a bordo del BIC Humboldt, desde Caleta La Cruz, Tumbes hasta Los Palos, Tacna. El diseño para la obtención de datos fue el sistemático paralelo con transectos perpendiculares a la costa con una separación entre ellos de 12 mn. El equipo utilizado fue la ecosonda científica EK-500 SIMRAD de 38 y 120 kHz de frecuencia, en un rango de detección de 3,5 a 400 m de profundidad. Las calibraciones hidroacústicas se realizaron tanto en la isla Lobos de Afuera (6°55,2 'S y 80°43,7 'W) como en el Callao (12°S). La obtención de la biomasa se determinó por el método de estratificación por áreas isoparalitorales. Las ecuaciones de fuerza de blanco utilizadas fueron las determinadas en noviembre de 1997 por MAC LENNAN et al. y, en este crucero, por GUTIÉRREZ y MAC LENNAN.

Condición reproductiva de la anchoveta durante la primavera 2005

Durante el crucero BIC Olaya 0511-12, el rango de LT de la anchoveta fue de 7,0 a 18,0 cm. La mayor actividad desovante se registró en la franja cercana a la costa. Se observó una alta variabilidad por grados latitudinales con algunas zonas importantes de desove (6 - 10°S y 12°S).

Caracterización de la Zona de Mínimo de Oxígeno (ZMO) frente a la costa peruana entre 3°N y 14°S, 1999 - 2009

Se analizaron datos de oxígeno disuelto, frente a las costas del Perú, para comprender las variaciones de la ZMO, caracterizadas por: a) el espesor de esa zona, limitada por las isolíneas de oxígeno de 0,5 mL.L-1; y b) la profundidad de su límite superior en la franja marino costera. Se muestran los resultados de las evaluaciones en la columna de agua, en la bahía de Callao en el periodo 1999 – 2009, y además en enero - febrero 2009 en un estudio de la ZMO, durante el Crucero Meteor 77-4 0901-02: Interacción en el Océano Tropical, Biogeoquímica y Clima. En la zona costera del Callao (12°S) se acentúa la hipoxia; la ZMO se ve restringida por la plataforma y su límite superior más superficial se ubicó a los 2,5 m de profundidad. A partir de la información obtenida en enero–febrero 2009 (Crucero 0901-02) se analizó la variabilidad espacial de la ZMO, en donde se halló un espesor de ~637,8 m, en la sección Punta Falsa (6°S). Se analizó la dinámica de la ZMO y su límite superior, debido al gran interés que ha tomado, por el posible incremento de su espesor, en el contexto de cambio climático, con grandes repercusiones sobre los recursos pesqueros.

Investigación de crustáceos de profundidad en la zona de Pisco - Callao

Entre el 14 y 27 de diciembre del 2005, se efectuó el crucero de investigación de crustáceos de profundidad a bordo del BIC Imarpe VI. Se realizaron 14 lances entre 12°S y 15°S y en dos estratos de profundidad (A: 700-1000 m, B: 1000-1400 m). Las operaciones de pesca se realizaron durante el día. En los experimentos de captura fueron utilizados diferentes tipos de mallas, carnadas y color de la boca de entrada de la nasa. Se registraron 4 especies: Paralomis longipes, Lithodes wiracocha, Lithodes panamensis y Lopholithodes diomedeae, siendo la de mayor incidencia Paralomis longipes. Se capturaron un total de 327 ejemplares con 305 kg. Los mayores rendimientos se registraron en el estrato B en 14°S y se encontraron los mayores tamaños de P. longipes, sin embargo, Lithodes panamensis alcanzó mayores tamaños que P. longipes. La proporción sexual fue favorable a machos. Las hembras de P. longipes en su mayoría portaban huevos. Se observó y estimó la incidencia de parásitos rizocefalos, epibiontes y la frecuencia de muda.

Genomic and transcriptomic analysis of the streptomycin-dependent Mycobacterium tuberculosis strain 18b.

The ability of Mycobacterium tuberculosis to establish a latent infection (LTBI) in humans confounds the treatment of tuberculosis. Consequently, there is a need to discover new therapeutic agents that can kill M. tuberculosis both during active disease and LTBI. The streptomycin-dependent strain of M. tuberculosis, 18b, provides a useful tool for this purpose since upon removal of streptomycin (STR) it enters a non-replicating state that mimics latency both in vitro and in animal models. The 4.41 Mb genome sequence of M. tuberculosis 18b was determined and this revealed the strain to belong to clade 3 of the ancient ancestral lineage of the Beijing family. STR-dependence was attributable to insertion of a single cytosine in the 530 loop of the 16S rRNA and to a single amino acid insertion in the N-terminal domain of initiation factor 3. RNA-seq was used to understand the genetic programme activated upon STR-withdrawal and hence to gain insight into LTBI. This revealed reconfiguration of gene expression and metabolic pathways showing strong similarities between non-replicating 18b and M. tuberculosis residing within macrophages, and with the core stationary phase and microaerophilic responses. The findings of this investigation confirm the validity of 18b as a model for LTBI, and provide insight into both the evolution of tubercle bacilli and the functioning of the ribosome.