Optimized on-line enantioselective capillary electrophoretic method for kinetic and inhibition studies of drug metabolism mediated by cytochrome P450 enzymes.

Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of a chiral drug can significantly differ between application of the racemate and single enantiomers. During drug development, the characteristics of candidate compounds have to be assessed prior to clinical testing. Since biotransformation significantly influences drug actions in an organism, metabolism studies represent a crucial part of such tests. Hence, an optimized and economical capillary electrophoretic method for on-line studies of the enantioselective drug metabolism mediated by cytochrome P450 enzymes was developed. It comprises a diffusion-based procedure, which enables mixing of the enzyme with virtually any compound inside the nanoliter-scale capillary reactor and without the need of additional optimization of mixing conditions. For CYP3A4, ketamine as probe substrate and highly sulfated γ-cyclodextrin as chiral selector, improved separation conditions for ketamine and norketamine enantiomers compared to a previously published electrophoretically mediated microanalysis method were elucidated. The new approach was thoroughly validated for the CYP3A4-mediated N-demethylation pathway of ketamine and applied to the determination of its kinetic parameters and the inhibition characteristics in presence of ketoconazole and dexmedetomidine. The determined parameters were found to be comparable to literature data obtained with different techniques. The presented method constitutes a miniaturized and cost-effective tool, which should be suitable for the assessment of the stereoselective aspects of kinetic and inhibition studies of cytochrome P450-mediated metabolic steps within early stages of the development of a new drug.

Effects of medetomidine and its active enantiomer dexmedetomidine on N-demethylation of ketamine in canines determined in vitro using enantioselective capillary electrophoresis.

Cytochrome P450 (CYP) enzymes catalyze the metabolism of both, the analgesic and anesthetic drug ketamine and the α2 -adrenergic receptor-agonist medetomidine that is used for sedation and analgesia. As racemic medetomidine or its active enantiomer dexmedetomidine are often coadministered with racemic or S-ketamine in animals and dexmedetomidine together with S- or racemic ketamine in humans, drug-drug interactions are likely to occur and have to be characterized. Enantioselective CE with highly sulfated γ-cyclodextrin as chiral selector was employed for analyzing in vitro (i) the kinetics of the N-demethylation of ketamine mediated by canine CYP3A12 and (ii) interactions occurring with racemic medetomidine and dexmedetomidine during coincubation with ketamine and canine liver microsomes (CLM), canine CYP3A12, human liver microsomes (HLM), and human CYP3A4. For CYP3A12 without an inhibitor, Michaelis-Menten kinetics was determined for the single enantiomers of ketamine and substrate inhibition kinetics for racemic ketamine. Racemic medetomidine and dexmedetomidine showed an inhibition of the N-demethylation reaction in the studied canine enzyme systems. Racemic medetomidine is the stronger inhibitor for CLM, whereas there is no difference for CYP3A12. For CLM and CYP3A12, the inhibition of dexmedetomidine is stronger for the R- compared to the S-enantiomer of ketamine, a stereoselectivity that is not observed for CYP3A4. Induction is observed at a low dexmedetomidine concentration with CYP3A4 but not with CYP3A12, CLM, and HLM. Based on these results, S-ketamine combined with dexmedetomidine should be the best option for canines. The enantioselective CE assay with highly sulfated γ-cyclodextrin as chiral selector is an effective tool for determining kinetic and inhibition parameters of metabolic pathways.

Influencia del tiempo de maceración sobre el color, la composición tánica y la astringencia de vinos Cabernet Sauvignon y Malbec de Argentina

El objetivo fue determinar qué tiempo de maceración permite una mayor expresión del color y del cuerpo y una menor astringencia en vinos Cabernet Sauvignon (CS) y Malbec (M), de Mendoza, Argentina. A partir de dos vinificaciones industriales de 20 000 L se llevó a cabo un experimento (n = 3) probando tres tiempos de maceración: 5, 10 y 20 días, mediante sucesivos descubes de 60 L. En los vinos resultantes se determinaron fenoles totales, taninos condensados totales, índice de gelatina, intensidad colorante, matiz, color copigmentado y color polimérico, mediante técnicas de espectrofotometría VIS y UV. Los vinos fueron evaluados por un panel de degustadores expertos. Los CS obtenidos con maceración de 10 y 20 días fueron similares y resultaron superiores a los de 5 días en contenidos de antocianos, color polimérico y taninos. También provocaron sensaciones de concentración y untuosidad mayores. Además resultaron más ásperos, astringentes y secantes que los de 5 días, pero estas sensaciones no alcanzaron notas elevadas. Los vinos CS de 20 días alcanzaron contenidos de polifenoles totales y de taninos no precipitables con gelatina mayores que los CS de 10 días. Los vinos M de 10 lograron mayores intensidades colorantes, polifenoles tales, antocianos, color polimérico y taninos que los de 5 y 20 días. Esto se asoció con sensaciones de concentración y untuosidad intensas y similares a las de los CS de 10 y 20 días pero con menos aspereza, astringencia y secante. Los M de 5 días resultaron muy pobres en atributos y los de 20 días con características intermedias entre los M de 5 y los M de 10 días. Tomando en cuenta las dos variedades y los tres tiempos de maceración, cuanto mayor fue el tiempo de maceración menor fue la proporción de antocianos copigmentados y mayor la de antocianos polimerizados. Los polifenoles totales y los taninos se correlacionaron positivamente con la aspereza, la astringencia, lo secante, la untuosidad y la concentración. Lo secante se asoció negativamente con la proporción de taninos no precipitables con gelatina.

Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos contenidos en las semillas de la vid (vitis vinifera l.)

El propósito de este trabajo es obtener un antioxidante natural a partir de las semillas de uva (Vitis vinifera L.), para emplear en alimentos. Para ello se compararon distintos solventes para la extracción de fenoles de las semillas de la uva, de modo de obtener el extracto más concentrado en compuestos activos con la mínima degradación de su poder antioxidante durante el proceso de obtención. La concentración de fenoles totales de los extractos se determinó por el método Folin Ciocalteu. El poder reductor de los extractos se midió empleando el método de Oyaizu. Una vez seleccionado el solvente más adecuado para la extracción, se analizó la cinética de extracción, optimizando el tiempo de tratamiento. El extracto fue concentrado al vacío, y se veríficó la conservación del poder reductor en el extracto concentrado, por el método de Oyaizu. El extracto de semillas concentrado y sin concentrar se empleó en un sistema real sujeto a oxidación, tal como el jugo de manzanas. El grado de oxidación del jugo se midió por el método de Özoglu. El extracto concentrado fue deshidratado por secado en lecho de espuma y por liofilizado. En ambos casos se verificó el efecto del tratamiento de secado sobre el poder reductor. Finalmente, se evaluó la actividad antioxidante del extracto líquido concentrado de semillas de vid, respecto de otros antioxidantes comerciales como ácido ascórbico y dióxido de azufre. El sustrato oxidable fue el jugo de manzanas, y el grado de oxidación se midió por el método de Özoglu. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de la varianza; cuando no fue posible emplear el mencionado análisis, debido a que no se verificaban los supuestos básicos para su aplicación, se empleó la prueba de Kruskal –Wallis. En todos los casos, se utilizó el programa Statgraphics plus ®4.0. Para obtener un extracto antioxidante a partir de semillas de vid se utilizó una ex-tracción con agua a 90ºC, durante 4 horas. La relación sólido- líquido empleada fue de 1g de semillas enteras por 10 ml de solvente. El extracto obtenido presentaba una concentración de 12,587 mg de fenoles totales por gramo de semillas de uva extractadas y un poder reductor de 1,290 unidades. Como consecuencia del análisis de la cinética de extracción, el tiempo de tratamiento se redujo de 4 horas a 3 horas. La concentración del extracto se realizó al vacío a 60ºC, verificándose un aumen-to del poder reductor en el extracto concentrado, comprobado sobre jugo de manzanas. Comparando el extracto concentrado y el extracto sin concentrar se observa que la concentración de fenoles totales aumentó 29,57 veces, mientras que el poder reductor aumentó 37,39 veces. El deshidratado del extracto por medio del lecho de espuma permitió conservar el poder reductor del mismo, no ocurrió lo mismo en el deshidratado por liofilizado, donde se produjo un deterioro del poder reductor. Para un mismo contenido de fenoles totales agregado al jugo de manzanas, el ex-tracto líquido sin concentrar produjo un 28,4% de inhibición de la oxidación, mientras que el de extracto líquido concentrado produjo un 51,5 % de inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. El extracto de semillas de vid, aplicado como antioxidante en jugo de manzanas, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 31,51%, considerando 24 horas el tiempo de tratamiento. Este desempeño supera al ácido ascórbico, que en iguales condiciones, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 2,6%. Pero en las condiciones de tra-bajo, el dióxido de azufre resulta mejor antioxidante que ambos, ya que logró inhibir el desarrollo de la oxidación en un 97,40 %.

Desarrollo de estándares de calidad para uvas Vitis vinifera L. cv. Malbec y Syrah

El objetivo del trabajo fue desarrollar estándares de calidad de uva basados en atributos físicos y químicos, capaces de predecir la calidad del vino. Se instaló una red de ensayos en Mendoza (Norte, Este y Valle de Uco), San Juan (Valle de Zonda), La Rioja (Chilecito), Catamarca y Salta (Valles Calchaquíes) (Argentina). Se ensayaron niveles de carga de uva (desbrote 30 y 50%, raleo 30 y 50% y testigo) en Malbec y Syrah. En la cosecha, las uvas fueron analizadas (tamaño baya, concentración azucarina, pH, antocianos, catequinas, taninos, fenoles totales) y vinificadas. Los vinos fueron analizados (alcohol, extracto seco, intensidad colorante, matiz, antocianos, catequinas, taninos, fenoles totales, color polimérico) y evaluados por un panel de degustadores. Empleando todos las variables de los vinos, mediante un análisis de componentes principales, se generaron dos índices que resumieron los atributos con mayor peso explicativo de la variabilidad observada (80%); ellos fueron: Riqueza Fenólica (RF, asociado a antocianos, taninos, catequinas, fenoles totales y concentración) y Peligro Oxidativo (PO, asociado a pH, matiz y tonalidad percibida). No existieron diferencias en cuanto a RF entre variedades ni entre niveles de producción de uva. Los vinos con RF mayor y PO menor se consideraron de mayor calidad. Las uvas cultivadas en zonas más frías tuvieron una mayor RF. En Malbec, las zonas frías y los bajos niveles productivos generaron un PO menor. Para cada variedad se desarrollaron predictores para RF y PO del vino. Se usó la regresión múltiple lineal paso a paso, seleccionando las variables de la uva con mayor poder predictivo. Se definieron las funciones de ajuste RFpred (Malbec R2 = 80%; Syrah R2 = 62%) y POpred (Malbec R2 = 80%; Syrah R2 = 62%). Los índices se tradujeron en estándares de calidad que mostraron concordancia entre uvas y vinos. La metodología puede ser válida para otras variedades tintas, pero debe ajustarse para cada caso. Los estándares permitirían asociar un precio a cada calidad y aumentar la transparencia del mercado.

Aceite esencial de orégano : un potencial aditivo alimentario

Se trabajó con aceite esencial obtenido por arrastre por vapor de Origanum x applii (criollo) y Origanum x majoricum (mendocino), cultivados en La Consulta, Mendoza, Argentina. Para evaluar su poder antioxidante y conservante en alimentos se determinó: rendimiento, polifenoles totales, cuantificación de timol y carvacrol mediante cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) y capacidad de secuestro de radicales libres (DPPH). La actividad conservante se evaluó in vitro, por el método de difusión en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patógenas y seis cepas de bacterias lácticas que alteran alimentos. El rendimiento en aceite esencial de estos oréganos oscila entre los valores informados por distintos autores para variedades cultivadas en otras regiones. Se destaca el contenido de polifenoles de ambos en relación con los valores mencionados en la bibliografía para otros Origanum, prevaleciendo el timol sobre el carvacrol. Esto se condice con un superior nivel de secuestro de radicales libres de ambos respecto de los citados en la literatura. Los oréganos de La Consulta inhibieron todas las cepas ensayadas y fueron más efectivos contra Staphylococcus aureus. Lo expuesto corrobora el poder antioxidante y conservante del Origanum x applii y del Origanum x majoricum.

Efecto de la técnica de sangrado sobre la composición fenólica de vinos cv. Malbec

El mercado actual exige, en gran parte, la disponibilidad de vinos estructurados con coloraciones intensas, razón por la cual los enólogos evalúan constantemente diversas variantes tecnológicas tendientes a satisfacer los requerimientos del consumidor. En respuesta a esta necesidad, se estudió la incidencia de la técnica de sangrado (T1, 10%; T2, 20%; T3, 30%) sobre la composición fenólica de vinos cv. Malbec de Mendoza en dos vendimias consecutivas. En 2010 se observó que solo T3 aumentó significativamente el contenido de antocianos en los vinos terminados respecto del control, sin apreciarse un efecto sobre el resto de los parámetros fenólicos evaluados. En cuanto a los compuestos individuales determinados por HPLC- DAD/ESI-MS, los tres tratamientos favorecieron la extracción de los distintos derivados antociánicos y flavonoles, siendo T3 el más significativo. En 2011 se observó una tendencia similar además de un efecto significativo en la intensidad colorante, fenoles totales, proantocianidinas, ácidos hidroxibenzoicos, flavanoles, flavonoles y dihidroflavonoles. Por el contrario, el test triangular mostró la imposibilidad de diferenciar los vinos estudiados a través de un panel entrenado de jueces. Al comparar ambas temporadas, se pudo evidenciar la influencia del factor "año" sobre la composición de los vinos elaborados con y sin aplicación del sangrado. En conclusión, esta práctica enológica puede ser una herramienta útil para aumentar la calidad polifenólica del Malbec y mejorar la capacidad de envejecimiento en la producción de vinos de guarda.

n-Alkanes and lignin in bottom sediments of the West European Basin (area of the battleship Bismark wreck site)

Three bottom sediment cores were collected from the top, slope, and foot of a small topographic high located near the West European continental rise within the Porcupine abyssal plain at the battleship Bismark wreck site. Using high-efficient gas chromatography technique we determined content and examined molecular composition of n-alkane fraction of hydrocarbons and phenol compounds of lignin. n-Alkane and phenol concentrations in bottom sediments of all three cores were low both in values per unit mass of sediments and in organic matter composition that is typical for pelagic deposits of the World Ocean. They vary from 0.07 to 2.01 µg/g of dry sediment and from 0.0001 to 0.01% of TOC; phenol ranges are from 1.43 to 11.1 µg/g and from 0.03 to 0.6%. Non-uniform supply of terrigenous matter to the bottom under conditions of changes in sedimentation environment in different geological epochs is the principal reason for significant variations in n-alkane and lignin concentrations with depth in the cores. Lignin and its derivatives make the main contribution to formation of organic matter composition of the region in study. With respect to n-alkane and lignin concentrations organic matter of deposits of the West European Basin is composed of remains of higher plants and of autochtonous organic matter of marine flora; they have mixed terrigenous-autochtonous (terrigenous-planktonogenic) origin.

Lignin and chemical elements in the surface layer of bottom sediments from the Kandalaksha Bay of the White Sea

Chemical composition of the upper layer of sediments (0-1 cm) in the Kolvits and Knazhaya inlets, and also in the deep-water part of the Kandalaksha Bay is considered. It is shown that silts are richer in Fe, TOC, and heavy metals, than sands. The highest concentration of these elements is found in sediments under mixing zones of riverine and sea waters. Correlations of P, Zn, Cd, and Cu with iron are high, and correlations of Pb and Cu with organic carbon are also high. Very high concentration of Pb in the Kandalaksha Bay indicate technogenic pollution of sediments. Lignin makes significant contribution to formation of organic matter in the sediments. Composition of lignin in bottom sediments of the Kandalaksha Bay is defined by composition of lignin in soils and aerosols. Vanillin and syringyl structures prevail in molecular composition of lignin in bottom sediments. Their sources are coniferous vegetations, soils, and mosses. Ratios of certain types of phenol compounds indicate pollution of the upper layer of sediments by technogenic lignin. Lead and copper correlate well with this technogenic lignin.

Impact of elevated pCO2 on paralytic shellfish poisoning toxin content and composition in Alexandrium tamarense

Ocean acidification is considered a major threat to marine ecosystems and may particularly affect primary producers. Here we investigated the impact of elevated pCO2 on paralytic shellfish poisoning toxin (PST) content and composition in two strains of Alexandrium tamarense, Alex5 and Alex2. Experiments were carried out as dilute batch to keep carbonate chemistry unaltered over time. We observed only minor changes with respect to growth and elemental composition in response to elevated pCO2. For both strains, the cellular PST content, and in particular the associated cellular toxicity, was lower in the high CO2 treatments. In addition, Alex5 showed a shift in its PST composition from a nonsulfated analogue towards less toxic sulfated analogues with increasing pCO2. Transcriptomic analyses suggest that the ability of A. tamarense to maintain cellular homeostasis is predominantly regulated on the post-translational level rather than on the transcriptomic level. Furthermore, genes associated to secondary metabolite and amino acid metabolism in Alex5 were down-regulated in the high CO2 treatment, which may explain the lower PST content. Elevated pCO2 also induced up-regulation of a putative sulfotransferase sxtN homologue and a substantial down-regulation of several sulfatases. Such changes in sulfur metabolism may explain the shift in PST composition towards more sulfated analogues. All in all, our results indicate that elevated pCO2 will have minor consequences for growth and elemental composition, but may potentially reduce the cellular toxicity of A. tamarense.

n-Alkanes and lignin in bottom sediments of the Norwegian Sea

Investigations of bottom sediments from the central and northern parts of the Norwegian Sea including study regions at the Storegga landslide, the Haakon Mosby mud volcano, and Knipovich Ridge were carried out. Concentration of n-alkanes in bottom sediments from these regions ranges from 0.53 to 22.1 µg/g of dry sediments that corresponds to 0.02-1.97% of Corg. Molecular composition of hydrocarbons indicates mixed allochtonous-authochtonous genesis of total organic matter (TOC) formed by hydrobiota and residuals of terrestrial plants. Terrigenous organic mater dominates in bottom sediments. Active redox, microbial and thermolytic processes of organic matter transformation take place in the sedimentary mass. Special character of chromatographic spectra of n-alkane distribution in both low and high-molecular ranges, as well as increased naphtene contents can be interpreted as a sign of oil hydrocarbon generation from maternal organic matter as a result of thermocatalytic reactions within sedimentary mass and their displacement into the upper sedimentary layers. Molecular compositions and concentrations of phenols and lignin were determined in core samples from the Norwegian Sea. Total concentration of phenols in the cores ranges from 8.1 to 101.8 (µg/g of dry sediments that corresponds to 0.15-1.15% of TOC. Lignin concentration was estimated at 21.0-459.0 µg/g of dry sediments (0.59-7.9% of ?org. Phenol compounds of p-hydroxybenzoic, vanillin, syringyl and cinnamyl families as basic components of lignin macromolecules were identified. It was found that sea currents and aerosols are the main contributors of lignin into the abyssal part of the Norwegian Sea.

Macroalgal responses to ocean acidification depend on nutrient and light levels

Ocean acidification may benefit algae that are able to capitalize on increased carbon availability for photosynthesis, but it is expected to have adverse effects on calcified algae through dissolution. Shifts in dominance between primary producers will have knock-on effects on marine ecosystems and will likely vary regionally, depending on factors such as irradiance (light vs. shade) and nutrient levels (oligotrophic vs. eutrophic). Thus experiments are needed to evaluate interactive effects of combined stressors in the field. In this study, we investigated the physiological responses of macroalgae near a CO2 seep in oligotrophic waters off Vulcano (Italy). The algae were incubated in situ at 0.2 m depth using a combination of three mean CO2 levels (500, 700-800 and 1200 µatm CO2), two light levels (100 and 70% of surface irradiance) and two nutrient levels of N, P, and K (enriched vs. non-enriched treatments) in the non-calcified macroalga Cystoseira compressa (Phaeophyceae, Fucales) and calcified Padina pavonica (Phaeophyceae, Dictyotales). A suite of biochemical assays and in vivo chlorophyll a fluorescence parameters showed that elevated CO2 levels benefitted both of these algae, although their responses varied depending on light and nutrient availability. In C. compressa, elevated CO2 treatments resulted in higher carbon content and antioxidant activity in shaded conditions both with and without nutrient enrichment-they had more Chla, phenols and fucoxanthin with nutrient enrichment and higher quantum yield (Fv/Fm) and photosynthetic efficiency (alpha ETR) without nutrient enrichment. In P. pavonica, elevated CO2 treatments had higher carbon content, Fv/Fm, alpha ETR, and Chla regardless of nutrient levels-they had higher concentrations of phenolic compounds in nutrient enriched, fully-lit conditions and more antioxidants in shaded, nutrient enriched conditions. Nitrogen content increased significantly in fertilized treatments, confirming that these algae were nutrient limited in this oligotrophic part of the Mediterranean. Our findings strengthen evidence that brown algae can be expected to proliferate as the oceans acidify where physicochemical conditions, such as nutrient levels and light, permit.