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Abstract The c-myc gene is one of the most frequently mutated oncogenes found in human tumors. c-Myc has been implicated in the regulation of various biological processes including cell cycle progression, cellular growth, differentiation, angiogenesis, immortalization and apoptosis. To assess the normal role of c-Myc in epithelial cell types in vitro and in vivo we have deleted the c-myc gene in keratinocytes and in the adult skin epidermis by conditional Cre/loxP mediated recombination. Similar to what we have previously shown in mouse embryonic fibroblasts acute elimination of c-Myc activity in cultured keratinocytes causes cells to cease proliferation and adapt a flat cell morphology. Mutant cells accumulate in a diploid Ki67neg stage, indicative of a quiescent Go stage. This demonstrates that c-Myc activity is essential to maintain keratinocytes in a productive cell cycle. In addition, mutant keratinocytes showed a defect in Ca2+ induced induction of the differentiation marker Keratin 1 suggesting a role for c-Myc during differentiation. To assess the in vivo role of c-Myc we used a tamoxifen inducible K5::CreERT transgene to delete the c-myc gene in the adult skin epidermis. Unexpectedly, despite strong c-Myc expression in the basal compartment it is not required for maintenance of the skin epidermis in the adult mouse. The epidermis appeared normal with respect to both proliferation and differentiation. In addition, no selection against c-Myc deficient epidermal cells occurred over many months, further confirming that c-Myc is dispensable for normal skin homeostasis. Even more surprising, TPA induced hyperproliferation also occurred in a c-Myc independent manner. Treatment of the skin with the mutagen DMBA prior to TPA is a classical way to induce papillomas by selecting for mutations that lead to dominant activation of the oncogene Ha-Ras. Most interestingly tumor formation was severely inhibited suggesting that tumor progression requires endogenous c-Myc. Further studies are required to address whether the role of c-Myc in the activation of telomerase or the Werner protein, or its role to induce angiogenesis is required for skin tumor progression, In conclusion, this work shows that while c-Myc is not required for maintenance or hyperplasia of mouse epidermis, it is essential for skin tumor progression in collaboration with Ras. R��sum�� Le g��ne c-myc est un des oncog��nes les plus fr��quemment mut��s dans les tumeurs humaines. c-Myc est impliqu�� dans la r��gulation de processus biologiques vari��s, comme la progression du cycle cellulaire, la croissance cellulaire, la diff��renciation, l'angiogen��se, l'immortalisation et l'apoptose. Pour caract��riser le r��le physiologique de c-Myc dans les cellules de type ��pith��lial in vitro et in vivo, le g��ne c-myc a ��t�� d��l��t�� dans des k��ratinocytes primaires et dans l'��piderme de peau de souris adultes par des recombinaisons conditionnelles (syst��me Cre/loxP). De la m��me fa��on que dans les fibroblastes d'embryon de souris, l'��limination aigu�� de l'activit�� de c-Myc dans les k��ratinocytes en culture primaire provoque l'arr��t de la prolif��ration des cellules et leur applatissement morphologique. Les cellules mutantes restent dans un stade diplo��de Ki67neg, indiquant un stade quiescent Go. Cela d��montre que l'activit�� de c-Myc est essentielle pour maintenir les k��ratinocytes dans le cycle cellulaire. De plus, les k��ratinocytes mutants montrent une d��ficience pour le marqueur de diff��renciation K��ratine 1 au cours de la diff��renciation induite par le calcium, sugg��rant un r��le de c-Myc dans la diff��renciation cellulaire. Pour comprendre le r��le de c-Myc in vivo, le transg��ne K5::CreERT inductible par le tamoxifen a ��t�� utilis�� pour d��l��ter le g��ne c-inyc dans l'��piderme de souris adultes. Etonnemment, malgr�� une forte expression de c-Myc dans le compartiment basal de l'��piderme, ce g��ne n'est pas n��cessaire pour la maintenance de l'��piderme de la peau chez la souris adulte. L'��piderme apparait normal avec une prolif��ration et une diff��renciation physiologique des cellules. De plus, il n'y a pas de s��lection contre les cellules ��pidennales c-Myc d��ficientes apr��s plusieurs mois, ce qui confirme que c-Myc n'est pas n��cessaire pour l'hom��ostasie normale de la peau. Encore plus surprenant, une hyperprolif��ration est ��galement induite par du TPA chez les souris mutantes, impliquant une voie de prolif��ration ind��pendante de c-Myc. Le traitement de la peau par le mutag��ne DMBA avant le traitement au TPA est une voie classique d'induction de papillomes, par s��lection de mutations conduisant �� l'activation de l'oncog��ne Ha-Ras. La formation des tumeurs est fortement inhib��e chez les souris mutantes, sugg��rant que la progression des tumeurs n��cessite la pr��sence endog��ne de c-Myc. De nouvelles ��tudes sont n��cessaires pour savoir si c-Myc a un r��le dans l'activation de la t��lom��rase ou de la prot��ine de Werner, ou encore dans l'angiog��n��se, qui sont n��cessaires pour la progression tumorale. En conclusion, ce travail montre que m��me si c-Myc n'est pas n��cessaire pour la maintenance ou l'hyperplasie de la peau de souris, il est essentiel pour la progression des tumeurs de la peau en collaboration avec Ras.
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R��sum�� Les m��canismes qui coordonnent la progression du cycle cellulaire lors de la m��iose avec les ��v��nements du d��veloppement embryonnaire pr��coce, y compris la formation des axes de polarit�� embryonnaire, sont peu compris. Dans le zygote du vers Caenorhabditis elegans, les premiers signes de polarit�� Ant��ro-Post��rieur (A-P) embryonnaire apparaissent apr��s que la m��iose soit termin��e. La nature des prot��ines et des m��canismes mol��culaires qui cassent la sym��trie du zygote n'est pas connue. Nous d��montrons que zyg-11 et cul-2 promeuvent la transition m��taphase - anaphase et la sortie de la phase M lors de la seconde division m��iotique. Nos r��sultats indiquent que ZYG-11 agit comme unit�� recrutant le substrat d'une ligase E3 comprennant CUL-2. Nos r��sultats montrent aussi que le d��lai de sortie de la phase M d��pend de l'accumulation de la Cyclin B, CYB-3. Nous d��montrons que dans des embryons zyg-11(RNAi) ou cul-2(RNAi), une polarit�� invers��e est ��tablie lors du d��lai de m��iosis II. Enfin nous montrons que les d��fauts de cycle cellulaire et ceux de polarit�� peuvent ��tre s��par��s. De plus, nous faisons apparaitre que l'��tablissement d'une polarit�� invers��e pendant le d��lai de m��iose II des embryons zyg-11(RNAi), comme l'��tablissement de la A-P polarit�� des embryons sauvage ne semblent pas requ��rir les microtubules. Nous montrons ��galement les premiers r��sultats d'un crible deux hybrides ainsi qu'un crible g��nomique qui vise �� identifier des g��nes dont l'inactivation augmente ou supprime les d��fauts de mutants pour le g��ne zyg-11, afin d'identifier les g��nes qui int��ragissent avec ZYG-11 pour assumer ses deux fonctions s��parables. Par cons��quent, nos trouvailles sugg��rent un mod��le selon lequel ZYG-11 est une sous-unit�� qui recrute les substrats d'une ligase E3 bas��e sur CUL-2 qui promeut la progression du cycle cellulaire et emp��che l'��tablissement de la polarit�� pendant la m��iose II, et o�� le centrosome agit comme la cl�� qui polarise l'embryon �� la fin de la m��iose. Summary The mechanisms that couple meiotic cell cycle progression to subsequent developmental events, including specification of embryonic axes, are poorly understood. In the one cell stage embryos of Caenorhabditis elegans, the first signs of Antero-Posterior (A-P) polarity appear after meiosis completion. A centrosome ��derived component breaks symmetry of the embryo, but the molecular nature of this polarity signal is not known. We established that zyg-11 and cul-2 promote the metaphase to anaphase transition and M phase exit at meiosis II. Our results indicate that ZYG-11 acts as a substrate recruitment subunit of a CUL-2-based E3 ligase. Moreover, we find that the delayed meiosis II exit of embryos lacking zyg-11 is caused by accumulation of the B-type cyclin, CYB-3. We demonstrate that inverted A-P polarity is established during the meiosis II delay in zyg-11(RNAi) and cul��2(RNAi) embryos. Importantly, we demonstrate that the polarity defects following zyg-11 or cul-2 inactivation can be uncoupled from the cell cycle defects. Furthermore, we found that microtubules appear dispensable for inverted polarity during the meiosis II delay in zyg-11(RNAi) embryos, as well as for A-P polarity during the first mitotic cell cycle in wild-type embryos. We also show the initial results from a comprehensive yeast two hybrid, as well as an RNAi-based functional genomic enhancer and suppressor screen, that may lead to identification of proteins that interact with zyg-11 to ensure the two functions. Our findings suggest a model in which ZYG-11 is a substrate recruitment subunit of an CUL-2-based E3 ligase that promotes cell cycle progression and prevents polarity establishment during meiosis II, and in which the centrosome acts as a cue to polarize the embryo along the AP axis after exit from the meiotic cell cycle.
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Abstract Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) form a family of three nuclear receptors regulating important cellular and metabolic functions. PPARs control gene expression by directly binding to target promoters as heterodimers with the Retinoid X Receptor (RXR), and their transcriptional activity is enhanced upon activation by natural or pharmacological ligands. The binding of PPAR/RXR heterodimers on target promoters allows the anchoring of a series of coactivators and corepressors involved in promoter remodeling and the recruitment of the transcription machinery. The transcriptional output finally depends on a complex interplay between (i) the respective expression levels of PPARs, RXRs and of other nuclear receptors competing for DNA binding and RXR recruitment, (ii) the availability and the nature of PPAR and RXR ligands, (iii) the expression levels and the nature of the different coactivators and corepressors and (iv) the sequence and the epigenetic status of the promoter. Understanding how all these factors and signals integrate and fine-tune transcription remains a challenge but is necessary to understand the specificity of the physiological functions regulated by PPARs. The work presented herein focuses on the molecular mechanisms of PPAR action and aims at understanding how the interactions and mobility of the receptor modulate transcription in the physiological context of a living cell: Such observations in vivo rely on the use of engineered fluorescent protein chimeras and require the development and the application of complementary imaging techniques such as Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Using such techniques, PPARs are shown to reside solely in the nucleus where they are constitutively associated with RXR but transcriptional activation by ligand binding -does not promote the formation of sub-nuclear structures as observed with other nuclear receptors. In addition, the engagement of unliganded PPARs in large complexes of cofactors in living cells provides a molecular basis for their ligand-independent activity. Ligand binding reduces receptor diffusion by promoting the recruitment of coactivators which further enlarge the size of PPAR complexes to acquire full transcriptional competence. Using these molecular approaches, we deciphered the molecular mechanisms through which phthalates, a class of pollutants from the plastic industry, interfere with PPARγ signaling. Mono-ethyl-hexyl-phthalate (MEHP) binding induces the recruitment of a specific subset of cofactors and translates into the expression of a specific subset of target genes, the transcriptional output being strongly conditioned by the differentiation status of the cell. This selective PPARγ modulation induces limited adipogenic effects in cellular models while exposure to phthalates in animal models leads to protective effects on glucose tolerance and diet-induced obesity. These results demonstrate that phthalates influence lipid and carbohydrate metabolism through complex mechanisms which most likely involve PPARγ but also probably PPARα and PPAR��, Altogether, the molecular and physiological demonstration of the interference of pollutants with PPAR action outlines an important role of chemical exposure in metabolic regulations. R��sum�� Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) forment une famille de r��cepteurs nucl��aires qui r��gulent des fonctions cellulaires et m��taboliques importantes. Les PPARs contr��lent l'expression des g��nes en se liant directement �� leurs promoteurs sous forme d'h��t��rodim��res avec les r��cepteurs RXR (Retinoid X Receptor), et leur activit�� transcriptionnelle est stimul��e par la liaison de ligands naturels ou pharmacologiques. L'association des h��t��rodim��res PPAR/RXR avec les promoteurs des g��nes cibles permet le recrutement de coactivateurs et de cor��presseurs qui vont permettre le remodelage de la chromatine et le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Les actions transcriptionnelles du r��cepteur d��pendent toutefois d'interactions complexes qui sont r��gul��es par (i) le niveau d'expression des PPARs, des RXRs et d'autres r��cepteurs nucl��aires entrant en comp��tition pour la liaison �� l'ADN et l'association avec RXR, (ii) la disponibilit�� et la nature de ligands de PPAR et de RXR, (iii) les niveaux d'expression et la nature des diff��rents coactivateurs et cor��presseurs et (iv) la s��quence et le marquage ��pig��n��tique des promoteurs. La compr��hension des m��canismes qui permettent d'int��grer ces aspects pour assurer une r��gulation fine de l'activit�� transcriptionnelle est un d��fi qu'il est n��cessaire de relever pour comprendre la sp��cificit�� des fonctions physiologiques r��gul��es par les PPARs. Ce travail concerne l'��tude des m��canismes d'action mol��culaire des PPARs et vise �� mieux comprendre comment les interactions du r��cepteur avec d'autres prot��ines ainsi que la mobilit�� de ce dernier r��gulent son activit�� transcriptionnelle dans le contexte physiologique des cellules vivantes. De telles observations reposent sur l'emploi de prot��ines fusionn��es �� des prot��ines fluorescentes ainsi que sur le d��veloppement et l'utilisation de techniques d'imagerie compl��mentaires telles que le FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ou la FCS (Fluorescence Corr��lation Spectroscopy). En appliquant ces m��thodes, nous avons pu montrer que les PPARs r��sident toujours dans le noyau o�� ils sont associ��s de mani��re constitutive �� RXR, mais que l'ajout de ligand n'induit pas la formation de structures sub-nucl��aires comme cela a pu ��tre d��crit pour d'autres r��cepteurs nucl��aires. De plus, les PPARs sont engag��s dans de larges complexes prot��iques de cofacteurs en absence de ligand, ce qui procure une explication mol��culaire �� leur activit�� ligand-ind��pendante. La liaison du ligand r��duit la vitesse de diffusion du r��cepteur en induisant le recrutement de coactivateurs qui augmente encore plus la taille des complexes afin d'acqu��rir un potentiel d'activation maximal. En utilisant ces approches mol��culaires, nous avons pu caract��riser les m��canismes permettant aux phtalates, une classe de polluants provenant de l'industrie plastique, d'interf��rer avec PPARγ. La liaison du mono-ethyl-hexyl-phtalate (NERF) �� PPARγ induit un recrutement s��lectif de cofacteurs, se traduisant par l'induction sp��cifique d'un sous-ensemble de g��nes qui varie en fonction du niveau de diff��rentiation cellulaire. La modulation s��lective de PPARγ par le MEHP provoque une adipogen��se mod��r��e dans des mod��les cellulaires alors que l'exposition de mod��les animaux aux phtalates induit des effets b��n��fiques sur la tol��rance au glucose et sur le d��veloppement de l'ob��sit��. Toutefois, les phtalates ont une action complexe sur le m��tabolisme glucido-lipidique en faisant intervenir PPARγ mais aussi probablement PPARα et PPAR��. Cette d��monstration mol��culaire et physiologique de l'interf��rence des polluants avec les r��cepteurs nucl��aires PPAR souligne un r��le important de l'exposition �� de tels compos��s dans les r��gulations m��taboliques.
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RESUME Dans le cadre de l'infection �� VIH-1, deux m��canismes g��n��raux, a) une destruction p��riph��rique massive ou b) un d��faut dans la production p��riph��rique ou centrale de nouvelles cellules, pourraient ��tre �� l'origine de l'��puisement des lymphocytes T CD4. La question soul��ve une importante controverse. Dans cette ��tude, la production thymique et la capacit�� de prolif��ration de lymphocytes T ont ��t�� ��tudi��es conjointement. La production thymique a ��t�� ��valu��e par l'analyse du contenu en cercles d'excision g��n��r��s lors du r��arrangement du r��cepteur aux cellules T (ou TRECs) des cellules T CD4 et CD8 p��riph��riques, provenant de sujets sains VIH-1 n��gatifs (n=120) ou infect��s par le VIH-1 (n=297), au stade pr��coce, interm��diaire et tardif de la phase chronique de la maladie. Au stade pr��coce, nous observons que le contenu en TRECs de la population CD4 est sup��rieur �� celui de la population contr��le. Aucune diff��rence n'est observ��e lors de la phase interm��diaire, alors que le contenu en TRECs est inf��rieur lors de la phase tardive, en comparaison avec le groupe contr��le. Pour les lymphocytes T CD8, le contenu en TRECs reste inf��rieur au groupe contr��le, �� tous les stades de la maladie. Ainsi, au stade pr��coce, la production thymique chercherait �� compenser la perte de lymphocytes T CD4 puis, avec l'��volution de la maladie, cette possibilit�� s'��puiserait. Les profils d'expression des g��nes r��gulateurs du cycle cellulaire pour les cellules T CD4 et CD8 p��riph��riques, obtenus par la m��thode des biopuces d'ADNc (microarray), ont permis l'analyse de la capacit�� de prolif��ration p��riph��rique des lymphocytes T. Trois populations cellulaires ont ��t�� compar��es entre elles : lymphocytes provenant de sujets infect��s par le VIH-1, lymphocytes provenant de sujets VIH-1-n��gatifs et lymphocytes activ��s in vitro provenant de sujets VIH-1-n��gatifs. Les r��sultats montrent, pour les cellules T CD8, un ��tat d'activation et un profil d'expression des g��nes r��gulateurs du cycle cellulaire comparables �� ceux des cellules activ��es in vitro. Le profil d'expression g��n��tique des cellules T CD4, par contre, montre une activation sub-optimale, conjointement �� une forte expression de p53, ce qui pourrait amener �� un bloc en phase G1 du cycle cellulaire ainsi qu'�� une forte apoptose. En conclusion, cette perturbation de la progression du cycle cellulaire des lymphocytes T CD4 p��riph��riques pourrait contribuer �� l'��chec de la restauration du nombre de lymphocytes T CD4 et ceci, malgr�� une production thymique conserv��e dans les stades pr��coces de la maladie, comme d��montr�� par l'analyse du contenu en TRECs.
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Arenaviruses are rodent-born world-wide distributed negative strand RNA viruses that comprise a number of important human pathogens including Lassa virus (LASV) which causes more than 3 00'000 infections annually in Western Africa. Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is the prototypic member of the arenavirus family, which is divided in two major subgroups according to serological properties and geographical distribution, the Old World and New World arenaviruses. The envelope glycoprotein precursors (GPCs) of arenaviruses have to undergo proteolytic processing to acquire biological function and to be incorporated into progeny virions. A cellular enzyme is responsible for this processing: the Subtilisin Kexin Isozyme-1 or Site-1 protease (SKI- 1/S1P). In this thesis we have studied the relationship between SKI-1/S1P and the envelope GPs of arenaviruses. In a first project, we investigated the molecular interactions between SKI-1/SIP and arenavirus GPCs. Using SKI-1/SIP mutants, we confirmed previously published observations locating LCMV GPC and LASV GPC processing in the Late Golgi/TGN and ER/cis-Golgi, respectively. A single mutation in the cleavage site of LCMV was sufficient to re-locate SKI- 1/SIP-mediated processing from the late Golgi/TGN to the ER/cis-Golgi. We then demonstrated that the transmembrane domain, the C-terminal tail and the phosphorylation sites of SKI-1/S1P are dispensable for GPC processing. Additionally we identified a SKI- 1/S1P mutant defective for autoprocessing at site Β, B' that was selectively impaired in processing of viral GPCs but not cellular substrates. We also showed that a soluble variant of SKI-1/SIΡ was unable to cleave envelope GPs at the cell surface when added in the culture medium. This study highlighted a new target for small molecule inhibitors that would specifically impair GPC but not cellular substrate processing. In a second project, we identified and characterized two residues: LASV GPC Y253 and SKI-1/S1P Y285 that are important for the SKI-1/SIP-mediated LASV GPC cleavage. An alignment of GPC sequences revealed a conserved aromatic residue in P7 position in the GPCs of Old World and Clade C of New World arenaviruses. Mutations in GPC at position P7 impaired processing efficiency. In SKI-1/S1P, mutating Y285 into A negatively affected processing of substrates containing aromatic residues in P7, without affecting others. This property could be used to develop specific drugs targeting SKI-1/SIP-mediated cleavage of LASV GPC without affecting cellular substrates. As a third project we studied the role of the SKI-1/SIP-mediated processing and the unusual stable signal peptide (SSP) for the folding and secretion of soluble forms of the ectodomain of LASV and LCMV glycoproteins. We provide evidence that the transmembrane domain and the cytosolic tail are crucial for the stability of the prefusion conformation of arenavirus GP and that the SSP is required for transport and processing of full-length GP, but not the soluble ectodomain per se. Taken together, these results will lead to a better understanding of the complex interactions between arenavirus GPCs and SKI-1/S IP, paving the avenue for the development of novel anti-arenaviral therapeutics. - Les Arenavirus sont des virus �� ARN n��gatif distribu��s mondialement et port��s par les rongeurs. Cette famille de virus comprend des virus hautement pathog��nes pour l'homme comme le virus de Lassa (LASV) qui cause plus de 300Ό00 infections par ann��e en Afrique de l'Ouest. Le virus de la choriom��ningite lymphocytaire (LCMV) est le repr��sentant de cette famille qui est divis��e en deux sous-groupes selon des crit��res s��rologiques et de distributions g��ographiques: arenavirus du Nouveau et de l'Ancien monde. Les glycoprot��ines d'enveloppe de ces virus (GPCs) doivent ��tre cliv��es pour ��tre incorpor��es dans le virus et ainsi lui permettre d'��tre infectieux. Une enzyme cellulaire est responsable de ce clivage : la Subtilisin Kexin Isozyme-1 ou prot��ase Site-1 (SKI-l/SlP). Dans cette th��se, nous avons ��tudi�� la relation entre cette enzyme cellulaire et les GPs des arenavirus. Dans un premier temps, nous avons ��tudi�� les interactions mol��culaires entre SKI- 1/S1P et GPC. A l'aide de mutants de SKI-l/SlP, nous avons confirm�� des r��sultats pr��c��demment publi��s montrant que les glycoprot��ines d'enveloppe de LASV sont cliv��s dans le r��ticulum endoplasmique/cis-Golgi alors que celles de LCMV sont cliv��es dans le Golgi tardif/TGN. Une seule mutation dans le site de clivage de la glycoprot��ine de LCMV est suffisante pour changer le compartiment cellulaire dans lequel est cliv��e cette glycoprot��ine. Ensuite, nous avons d��montr�� que le domaine transmembranaire, la partie cytosolique C-terminale ainsi que les sites de phosphorylations de cette enzyme ne sont pas indispensables pour permettre le clivage de GPC. De plus, nous avons identifi�� un mutant de SKI-l/SlP dans lequel Γ autoprocessing au site B,B' est impossible, incapable de cliver GPC mais toujours pleinement fonctionnelle envers ses substrats cellulaires. Nous avons ��galement d��montr�� qu'une forme soluble de SKI-l/SlP ajout��e dans le milieu de culture n'est pas capable de couper GPC �� la surface de la cellule. Cette ��tude a d��fini une nouvelle cible potentielle pour un m��dicament qui inhiberait le clivage des glycoprot��ines des arenavirus sans affecter les processus normaux de la cellule. Dans un second project, nous avons identifi�� deux acides amin��s, LASV GPC Y253 et SKI-l/SlP Y285, qui sont important pour le clivage de LASV GPC. Un alignement des s��quences de clivage des GPCs a montr�� qu'un r��sidu aromatique est conserv�� en position P7 du site de clivage chez tous les arenavirus de l'Ancien monde et dans le clade C des arenavirus du Nouveau monde. Une mutation de cet acide amin��e dans GPC r��duit l'efficacit�� de clivage par SKI-l/SlP. Mutation de la tyrosine 285 de SKI-l/SlP en alanine affecte n��gativement le clivage des substrats contenant un r��sidu aromatique en position P7 sans affecter les autres. Cette propri��t�� pourrait ��tre utilis��e pour le d��veloppement de m��dicaments sp��cifiques ciblant le clivage de GPC. Finalement, nous avons ��tudi�� le r��le du processing accomplit par SKI-l/SlP et du signal peptide pour le pliage et la s��cr��tion de formes solubles des glycoprot��ines de LASV et LCMV. Nous avons montr�� que le domaine transmembranaire et la partie cytosolique de GP sont crucials pour la stabilit�� de la conformation pre-fusionnelle des GPs et que SSP est n��cessaire pour le transport et le processing de GP, mais pas de son ecto-domaine soluble. En conclusion, les r��sultats obtenus durant cette th��se permettrons de mieux comprendre les interactions complexes entre SKI-l/SlP et les glycoprot��ines des arenavirus, ouvrant le chemin pour le d��veloppement de nouveaux m��dicaments anti-ar��naviraux.
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Objectif : Les ��panchements pleuraux sont fr��quents chez les patients porteurs de cancer et d��terminer s'ils sont de nature tumorale ou non rel��ve d'une grande importance clinique, particuli��rement pour le groupe des carcinomes pulmonaires NON �� petites cellules (NSCLC). Le PET/CT s'est montr�� d'une grande utilit�� et est actuellement indiscutablement reconnu comme outils n��cessaire dans la prise en charge et notamment la stadification et le suivi des cancers, et particuli��rement des cancers pulmonaires. Sa capacit�� �� pouvoir distinguer les ��panchements pleuraux malins des ��panchements pleuraux non tumoraux, �� b��nins �� n'est pas pr��cis��ment connue et n'a pas jusqu'�� pr��sent ��t�� investigu��e de mani��re approfondie. Mat��riel et m��thodes : Nous avons examin�� la captation du FDG (indice SUVmax) des ��panchements pleuraux de 50 PET/CT r��alis��s chez 47 patients (29 hommes, 18 femmes, 60��16 ans) avec ��panchements pleuraux et cancer connu (24 NSCLC, 7 lymphomes, 5 cancer du sein, 4 GIST, 3 m��soth��liomes, 2 cancer ORL, 2 t��ratomes malins, 1 carcinome colorectal, 1 carcinome oesophagien, 1 m��lanome). Ces r��sultats ont ��t�� corr��l��s aux r��sultats des examens cytopathologiques r��alis��s apr��s ponction de ces m��mes ��panchements dans un intervalle m��dian de 21 jours (interquartile range -3 to 23). L'examen du liquide d'��panchement comportait la mesure du pH, la distribution relative des diff��rents ��l��ments cellulaires (macrophages, neutrophils, ��osinophiles, basophiles, lymphocytes, plasmocytes), la num��ration cellulaire et bien entendu pr��sence de cellules tumorales. R��sultats : Parmis les ��panchements, 17 ��taient malins (34%) (6 NSCLC, 5 lymphomes, 2 cancers mammaires, 2 m��soth��liomes, 2 t��ratomes malins). Les SUV ��taient plus ��lev��s dans les ��panchements malins que dans les ��panchements b��nins [3.7 (95%IC 1.8-5.6) vs. 1.7 g/ml (1.5-1.9), p = 0.001], avec une corr��lation entre les ��panchements malins et le SUV (coefficient de Spearman ρ = 0.50, p = 0.001). Il n'a pas ��t�� observ�� de corr��lation entre aucun des autres param��tres cyptopathologiques ou radiologiques analys�� (aire sous la courbe ROC 0.83 �� 0.06). En utilisant un seuil du SUV de 2.2-mg/l, 12 examens PET/CT ��taient interpr��t��s comme positifs and 38 comme n��gatifs avec une sensibilit�� et une sp��cificit��, valeur pr��dictive positive et n��gative de 53%, 91%, 75% and 79% respectivement. Concernant le groupe des NSCLC seulement (n = 24), aire sous la courbe ROC ��tait de 0.95 �� 0.04. Sept examens ��taient consid��r��s comme positifs et 17 comme n��gatifs avec une sensibilit��, une sp��cificit��, valeur pr��dictive positive et n��gative de 83%, 89%, 71 et 94% respectivement. Conclusion : Le PET/CT peut aider �� diff��rencier la nature b��nigne ou maligne des ��panchements avec une haute sp��cificit�� chez les patients avec tumeur connue, en particulier dans un contexte de carcinome NON �� petites cellules.
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Diabetes is a growing epidemic with devastating human, social and economic impact. It is associated with significant changes in plasma concentrations of lipoproteins. We tested the hypothesis that lipoproteins modulate the function and survival of insulin-secreting cells. We first detected the presence of several receptors that participate in the binding and processing of plasma lipoproteins and confirmed the internalization of fluorescent LDL and HDL particles in insulin-secreting β-cells. Purified human VLDL and LDL particles reduced insulin mRNA levels and β-cell proliferation, and induced a dose-dependent increase in the rate of apoptosis. In mice lacking the LDL receptor, islets showed a dramatic decrease in LDL uptake and were partially resistant to apoptosis caused by LDL. VLDL-induced apoptosis of β-cells involved caspase-3 cleavage and reduction in levels of the c-Jun N-terminal (JNK) Interacting Protein-1 (IB1/JIP-1). In contrast, the pro-apoptotic signaling of lipoproteins was antagonized by HDL particles or by a small peptide inhibitor of JNK. The protective effects of HDL were mediated, in part, by inhibition of caspase-3 cleavage and activation of the protein kinase Akt/PKB. Heart disease is a major cause of morbidity and mortality among patients with diabetes. When heart failure is refractory to medical therapy and cannot be improved by electrical resynchronization, percutaneous angioplasty or coronary graft bypass surgery, heart transplantation remains a "last resort" therapy. Nevertheless, it is limited by the side effects of immunosuppressive drugs and chronic rejection. Localized expression of immunomodulatory genes in the donor organ can create a state of immune privilege within the graft, and was performed in rodent hearts by infecting cells with an adenovirus encoding indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), the rate-limiting enzyme in the catabolism of tryptophane. Other strategies are based on genetic manipulation of dendritic cells (DCs) with immunosuppressive genes and in vitro exposure of DCs to agents that prevent their maturation by inflammatory cytokines. Finally, we used 5-bromo-2'-deoxyuridine, which is incorporated into DNA and diluted with cell division, to identify long-term label retaining cells in the adult rodent heart. The majority of these cells were positive for the stem cell antigen-1 (Sca-1) and negative for the endothelial precursor marker CD31. They formed cardiospheres in vitro and showed differentiation potential into mesenchymal cell lineages. When cultured in cardiomyogenic differentiation medium, they expressed cardiac-specific genes. Taken together, these data provide evidence of slow-cycling stem cells in the rodent heart. Chronic shortage of donor organs opens the way to cardiac stem cell therapy in humans, although the long way from animal experimentation to routine therapy in patients may still take several years. - Du diab��te de type 2 �� la maladie coronarienne : trois ��tudes sur les dysfonctions de la cellule s��cr��trice d'insuline induites par les dyslipid��mies, l'immunomodulation dans la transplantation cardiaque, et la th��rapie par des cellules souches myocardiques. Le diab��te de type 2 a pris les dimensions d'une ��pid��mie, avec des cons��quences sociales et ��conomiques dont nous n'avons pas encore pris toute la mesure. La maladie s'accompagne souvent d'une dyslipid��mie caract��ris��e par une hypertriglyc��rid��mie, des taux abaiss��s de cholest��rol HDL, et des concentrations de cholest��rol LDL �� la limite sup��rieure de ce qui est consid��r�� comme acceptable. L'hypoth��se �� la base de cette ��tude est qu'une modification des taux plasmatiques de lipoprot��ines pourrait avoir une influence directe sur la cellule β s��cr��trice d'insuline en modifiant sa fonction, sa dur��e de vie et son taux de r��g��n��ration. Dans un premier temps, nous avons mis en ��vidence, sur la cellule β, la pr��sence de plusieurs r��cepteurs impliqu��s dans la captation des lipoprot��ines. Nous avons confirm�� la fonctionnalit�� de ces r��cepteurs en suivant l'internalisation de LDL et de HDL marqu��s. En pr��sence de VLDL ou de LDL humains, nous avons observ�� une diminution de la transcription du g��ne de l'insuline, une prolif��ration cellulaire r��duite, et une augmentation de l'apoptose, toutes fonctions de la dose et du temps d'exposition. L'apoptose induite par les VLDL passe par une activation de la caspase-3 et une r��duction du taux de la prot��ine IB1/JIP-1 (Islet Brain1/JNK Interacting Protein 1), dont une mutation est associ��e �� une forme monog��nique de diab��te de type 2. Par opposition, les HDL, ainsi que des peptides inhibiteurs de JNK, sont capables de contrer la cascade pro-apoptotique d��clench��e, respectivement, par les LDL et les VLDL. Ces effets protecteurs comprennent l'inhibition du clivage de la caspase-3 et l'activation de la prot��ine kinase Akt/PKB. En conclusion, les lipoprot��ines sont des ��l��ments cl��s de la survie de la cellule β, et pourraient contribuer au dysfonctionnement observ�� dans le pancr��as endocrine au cours du d��veloppement du diab��te. La maladie cardiaque, et plus particuli��rement la maladie coronarienne, est une cause majeure de morbidit�� et de mortalit�� chez les patients atteints de diab��te. Plusieurs strat��gies sont utilis��es quotidiennement pour pallier les atteintes cardiaques: traitements m��dicamenteux, ��lectrom��caniques par resynchronisation ��lectrique, ou commun��ment appel��s �� interventionnels �� lorsqu'ils font appel �� l'angioplastie percutan��e. La revascularisation du myocarde par des pontages coronariens donne ��galement de tr��s bons r��sultats dans certaines situations. Il existe toutefois des cas o�� plus aucune de ces approches n'est suffisante. La transplantation cardiaque est alors la th��rapie de choix pour un nombre restreint de patients. La th��rapie g��nique, en permettant l'expression locale de g��nes immunomodulateurs dans l'organe greff��, permet de diminuer les r��actions de rejet inh��rentes �� toute transplantation (�� l'exception de celles r��alis��es entre deux jumeaux homozygotes). Nous avons appliqu�� chez des rongeurs cette strat��gie en infectant le coeur greff�� avec un ad��novirus codant pour l'enzyme indoleamine 2,3-dioxyg��nase (IDO), une enzyme cl�� dans le catabolisme du tryptophane. Nous avons proc��d�� de mani��re identique in vitro en surexprimant IDO dans les cellules dendritiques, dont le r��le est de pr��senter les antig��nes aux lymphocytes Τ du receveur. Des exp��riences similaires ont ��t�� r��alis��es en traitant les cellules dendritiques avec des substances capables de pr��venir, en partie du moins, leur maturation par des agents pro-inflammatoires. Finalement, nous avons explor�� une strat��gie utilis��e couramment en h��matologie, mais qui n'en est encore qu'�� ses d��buts au niveau cardiaque : la th��rapie par des cellules souches. En traitant des rongeurs avec un marqueur qui s'incorpore dans l'ADN nucl��aire, le 5-bromo- 2'-deoxyuridine, nous avons identifi�� une population cellulaire se divisant rarement, positive en grande partie pour l'antig��ne embryonnaire Sca-1 et n��gative pour le marqueur endoth��lial CD31. En culture, ces cellules forment des cardiosph��res et sont capables de se diff��rencier dans les principaux types tissulaires m��senchymateux. Dans un milieu de differentiation ad��quat, ces cellules expriment des g��nes cardiomyocytaires. En r��sum��, ces donn��es confirment la pr��sence chez le rongeur d'une population r��sidente de pr��curseurs myocardiques. En addenda, on trouvera deux publications relatives �� la cellule β productrice d'insuline. Le premier article d��montre le r��le essentiel jou�� par la complexine dans l'insulino-s��cr��tion, tandis que le second souligne l'importance de la prot��ine IB1/JIP-1 dans la protection contre l'apoptose de la cellule β induite par certaines cytokines.
Resumo:
Abstract: Birds harbor a variety of bacteria on their plumage, some of which can degrade feathers in vitro. Whether these keratinolytic bacteria are active on live birds and can effect feather degradation on birds is debatable. The effect of such bacteria on the body condition and behavior of birds, is unknown. Using a community of feather-degrading bacteria (EB), we investigate the interaction between the activity and load of such bacteria, on the morphology, body condition, and behavior of zebra finches (Taeniopygia guttata). In Chapter 2, we find that the elevated loads of such microbes lead to a reduction in the expression of morphological traits, such as male bill color (a sexually selected trait) and uropygial gland volume, without reducing body mass, or evoking a cellular immune response. We also suggest the presence of a carotenoid based defense response in hosts, to such elevated loads of microbes and document a sex-based difference in the source of carotenoids used for such a response. In Chapter 3, we investigated the effect of EB loads on male mate choice of zebra finches, wherein male choice of females with elevated and un-altered bacterial loads, varied with male size. We found that larger males preferred females with higher bacterial load and smaller males preferred females with lower bacterial load. Chapter 4 demonstrates that the presence of melanin in feathers reduces the growth and activity of the community of feather-degrading bacteria (EB) and that the EB community can effect feather degradation in humid conditions, without broth. Additional results also demonstrate that the EB community consists of bacteria that can attach themselves to feathers on live birds and those that can live freely on avian plumage. Finally, chapter 5 demonstrates that the self-maintenance, social and sexual behaviors of birds are implicated in the infection and horizontal transmission of bacteria. It also suggests a linked oral - faecal - genital mode of transmission of pathogens in birds. These results demonstrate that differential loads of normal flora of vertebrate hosts can effect changes in their morphology and behavior. They also shed light on the role of feather-degrading bacteria in the evolution of melanin polymorphism in birds and suggest that bacteria can be active on live birds. This thesis also highlights the importance of social and, sexual behaviors of birds, in epidemiology. R��sum��: Les Oiseaux ont dans leur plumage diverses bact��ries dont certaines d��gradent les plumes in vitro, n��anmoins. Il n'est pas clair, au vu de pr��c��dentes ��tudes, si ces bact��ries k��ratinolytiques sont actives sur des oiseaux vivants, et si celles-ci d��gradent effectivement le plumage de leur h��te, L'effet de ces bact��ries sur la condition corporelle ainsi que le comportement des oiseaux n'est pas connu. A l'aide d'une communaut�� de bact��ries d��gradant les plumes (EB), non pathog��nes, nous examinons les interactions entre l'activit�� et la charge bact��rienne sur la morphologie, la condition corporelle et le comportement du diamant mandarins (Taeniopygia guttata). Dans le chapitre 2, nous montrons qu'une charge ��lev��e de ces microbes m��ne �� une r��duction de l'expression de certains traits morphologiques, tels que la couleur du bec chez le m��le (un trait soumis �� s��lection sexuelle), ainsi que le volume de la glande uropygienne, sans qu'il y ait une r��duction de la masse corporelle, ni d��clenchement d'une r��ponse immune cellulaire. Nos donn��es sugg��rent la pr��sence d'une d��fense chez l'h��te �� des charges ��lev��es de bact��ries bas��e sur la pr��sence de carot��no��des. Nous montrons, de plus une diff��rence li��e au sexe dans la source des carot��no��des utilis�� pour cette r��ponse. Dans le chapitre 3 nous examinons l'influence de la charge bact��rienne EB sur le choix des m��les chez le diamant mandarins. Des femelles avec une charge bact��rienne normale et augment��e sont choisies par les m��les et ce choix varie avec la taille des m��les. Nous avons mis en ��vidence que les grands m��les pr��f��rent les femelles avec une charge bact��rienne plus ��lev��e. Les petits m��les pr��f��rent les femelles avec une charge bact��rienne r��duite. Le chapitre 4 d��montre que la pr��sence de m��lanine dans les plumes r��duit la croissance et l'activit�� de la communaut�� de bact��ries d��gradant le plumage (EB), et que cette communaut�� EB peut d��grader les plumes dans des conditions humides, sans milieu de culture liquide. De plus nous montrons que cette communaut�� consiste en des bact��ries qui peuvent s'attacher sur les plumes d'oiseaux vivants ainsi que des bact��ries libres. Pour finir nous montrons dans le chapitre 5 que la maintenance corporelle, l'interaction sociale et le comportement sexuel de ces oiseaux sont impliqu��s dans l'infection et la transmission horizontale de ces bact��ries. Nos donn��es sugg��rent une transmission orale-f��cale-g��nitale des pathog��nes chez les oiseaux. Ces r��sultats montrent que des charges diff��rentes de la flore bact��rienne habituelle et non pathog��ne de vert��br��s peuvent affecter leur morphologie et leur comportement. Ils ��claircissent ��galement le r��le des bact��ries d��gradant les plumes dans l'��volution du polymorphisme m��lanique chez les oiseaux et sugg��rent que ces bact��ries peuvent ��tre actives sur des oiseaux vivants. Cette th��se souligne ��galement l'importance du comportement social et sexuel des oiseaux dans l'��pid��miologie.
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Buts de la revue: Les M��dulloblastomes sont des tumeurs rares chez l'adulte. Le traitement habituel comprend une radioth��rapie de tout l'axe cranio-spinal avec ou sans chimioth��rapie. Beaucoup d'efforts sont actuellement entrepris pour mieux comprendre la biologie tumorale, afin de mieux stratifier les patients en diff��rents groupes �� risques et de les traiter en fonction. Cette revue discute les nouveaux facteurs de risques cliniques et mol��culaires qui peuvent aider �� optimiser le traitement des patients adultes avec des m��dulloblastomes. D��couvertes r��centes: Jusqu'�� pr��sent les patients ��taient divis��s en groupes �� bas risque ou �� haut risque sur la base de facteurs cliniques (��ge, maladie r��siduelle apr��s chirurgie, diss��mination dans le syst��me nerveux central et l'histologie). Cette classification devrait ��tre compl��t��e par des facteurs pronostics mol��culaires. Le profilage de l'expression des g��nes a permis d'identifier six sous-groupes mol��culaires de m��dulloblastomes. Le WNT sous-groupe montre une activation des g��nes de la voie de signalisation WNT/wingless avec des mutations fr��quentes du g��ne CNNTB1, une perte du chromosome 6 et une accumulation de β-catenine nucl��aire. Ce sous-groupe est rencontr�� le plus souvent chez les enfants avec des m��dulloblastomes avec une histologie classique. Ils ont un bon pronostic. Une activation de la voie de signalisation du sonic hedgehog montre des mutations fr��quentes des g��nes PTCH et SUFU, une perte du 9q et une positivit�� pour GLI1 et SFRP1 et est rencontr�� plus fr��quemment chez les enfants de moins de 3 ans et chez les adultes. Ce sous-groupe est souvent associ�� �� une histologie de type desmoplastique. D'autre sous-groupes sont moins bien d��limit��s et pr��sentent des caract��ristiques qui se chevauchent. Cependant une amplification MYC/MYCN, un gain du 17p et une histologie de type grandes cellules/anaplasique sont des facteurs de mauvais pronostic. R��sum��: Des nouveaux sous-groupes mol��culaires vont dor��navant aider �� mieux adapter les traitements aux diff��rents groupes de risque et permettront �� d��velopper de nouvelles th��rapies cibl��es. Des ��tudes prospectives et si possibles randomis��es devraient ��tre effectu��es comprenant une stratification dans des sous-groupes mol��culaires, afin d'identifier au mieux le meilleur traitement pour chaque groupe �� risque.
Resumo:
Staphylococcus aureus est un pathog��ne humain majeur ayant d��velopp�� des r��sistances contre la quasi totalit�� des antibiotiques disponibles, incluant la tr��s importante famille des β- lactamines. La r��sistance �� cette classe d'antibiotiques est conf��r��e par la �� Staphylococcal Cassette Chromosome mec �� (SCCmec), qui est un ��l��ment g��n��tique mobile capable de s'ins��rer dans le chromosome bact��rien et capable d'��tre transf��r�� horizontalement chez d'autres staphylocoques. Le m��canisme mol��culaire impliqu�� dans ce transfert horizontal demeure largement inconnu. L'une des premi��res ��tapes du transfert est l'excision du SCC mec du chromosome bact��rien. Cette excision est promue par des enzymes cod��es par l'��l��ment SCCmec lui- m��me et appel��es de ce fait �� Cassette Chromosome Recombinases �� (Ccr). L'un des buts de ce travail de th��se a ��t�� de comprendre la r��gulation de l'expression des g��nes codant pour les Ccr recombinases. En utilisant des outils mol��culaires originaux, nous avons ��t�� en mesure de d��montrer en premier lieu que les Ccr recombinases ��taient exprim��es de fa��on �� bistable ��, c'est �� dire qu'uniquement quelques pourcents de cellules dans une population exprimaient ces g��nes �� un temps donn��. Dans un deuxi��me temps, nous avons ��galement d��montr�� que l'expression de ces g��nes ��tait r��gul��e par des facteurs ��trangers au SCC mec. L'expression bistable des recombinases est un concept important. Effectivement, cela permet �� la majorit�� des cellules d'une population de conserver l'��l��ment SCC mec, alors que seulement une petite fraction le perd afin de le rendre disponible pour un transfert. Ainsi, alors que l'��l��ment SCC mec continue de se propager avec la multiplication des bact��ries Staphylococcus aureus r��sistant �� la m��ticilline (SARM), il peut ��tre simultan��ment transmis �� des souches susceptibles (Staphylococcus aureus susceptible �� la m��ticilline, SASM), entra��nant l'apparition de nouveaux SARM. De fa��on tr��s int��ressante, le fait que cette bistabilit�� est contr��l��e par les bact��ries, et non le SCCmec lui-m��me, montre que la d��cision de transf��rer ou non la cassette SCC mec appartient �� la bact��rie. En cons��quence, il doit exister dans la nature des souches qui sont plus ou moins aptes �� effectuer ce transfert. En nous appuyant sur ces observations, nous avons montr�� que l'excision du SCC mec ��tait effectivement r��gul��e de fa��on tr��s ��troite au cours de la division cellulaire, et ne se passait que pendant un temps limit�� au d��but de la croissance. Ce r��sultat est compatible avec une r��gulation g��n��tique command��e par la densit�� cellulaire, qui pourrait ��tre d��pendante de la production de signaux extracellulaires, du type que l'on rencontre dans le quorum sensing. Les signaux hypoth��tiques entra��nant l'excision du SCC mec restent inconnus �� l'heure actuelle. La connaissance de ces signaux pourrait se r��v��ler tr��s importante afin de d��velopper des strat��gies pour interf��rer avec la diss��mination de la r��sistance au β-lactamines. Deux sujets additionnels ont ��t�� logiquement investigu��s au vu de ces premiers r��sultats. Premi��rement, si certaines souches de SARM sont plus ou moins aptes �� d��clencher l'excision du SCC mec, de m��me certaines souches de SASM devraient ��tre plus ou moins aptes �� acqu��rir cet ��l��ment. Deuxi��mement, afin d'��tudier ces m��canismes de transfert au niveau ��pid��miologique, il nous a ��t�� n��cessaire de d��velopper des outils nous permettant d'explorer le ph��nom��ne �� une plus large ��chelle. Concernant le premier point, il a ��t�� postul�� que certains SASM seraient r��fractaires �� l'int��gration g��nomique d'un SCC mec en raison de polymorphismes particuliers �� proximit�� du site d'insertion chromosomique (attB). En ��tudiant plus de 40 isolais de S. aureus, provenant de porteurs sains, nous avons confirm�� ce polymorphisme dans l'environnement ��'attB. De plus, nous avons pu montrer que ces r��gions polymorphiques ont ��volu�� parall��lement �� des groupes phylog��n��tiques bien connus. Ainsi, si des telles r��gions r��fractaires �� l'int��gration de SCC mec existent, celles-ci devraient s��gr��ger dans des complexes clonaux bien d��finis qui devraient ��tre facilement identifiables au niveau ��pid��miologique. Concernant le second point, nous avons ��t�� capables de construire un syst��me rapporteur de l'excision du SCCmec, en utilisant un plasmide �� faible copie. Ce syst��me consistait en un promoteur fort et un g��ne codant pour une prot��ine verte fluorescente (GFP) sous le contr��le d'un promoteur fort s��par��s �� l'aide d'un ��l��ment SCC artificiel portant trois terminateurs de transcription. Ainsi, la fluorescence ne s'exprime que si l'��l��ment SCC est excis�� du plasmide. Ce syst��me a ��t�� test�� avec succ��s dans plusieurs types de staphylocoques, et est actuellement ��valu�� dans d'autres souches et conditions stimulant ou inhibant l'excision. De mani��re g��n��rale, cette dissertation repr��sente parcours scientifique �� travers plusieurs aspects d'un probl��me de sant�� publique majeur en rapport avec la r��sistance bact��rienne aux antibiotiques. Ce travail s'attaque �� des probl��mes fondamentaux concernant le transfert horizontal de l'��l��ment SCC mec. De plus, il s'int��resse �� des aspects plus g��n��raux de cet ��l��ment g��n��tique mobile qui pourraient se r��v��ler tr��s importants en terme de mouvement de g��nes au sein des staphylocoques, voir d'autres bact��ries gram-positives. Finalement ce travail de th��se met en place le fondamentaux requis pour des recherches futures visant �� interf��rer avec le transfert horizontal de la r��sistance aux β-lactamines. - Staphylococcus aureus is a major human pathogen. Moreover, S. aureus have developed resistance to almost all available antibiotics, including the important family of β-lactam molecules. Intrinsic resistance to β-lactams is conferred by the Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), which is a mobile genomic island that inserts into the staphylococcal chromosome and can be horizontally transferred into other staphylococci. However, little is known about the molecular mechanisms involved in this horizontal transfer into na��ve strains. One of the first steps in SCC mec horizontal transfer is its excision from the chromosome. Excision is mediated by recombinase enzymes that are encoded by SCC mec itself, and named accordingly Ccr recombinases - for Cassette Chromosome recombinases. One goal of this thesis was to understand the regulation these recombinase genes. By using original molecular tools we could demonstrate first that the Ccr recombinases were expressed in a "bistable" manner, i.e. in only few percentages of the bacterial cells at a given time, and second that they were regulated by determinants that were not encoded on the SCC mec element, but elsewhere on the staphylococcal genome. "Bistable" expression Ccr recombinases is an important concept. It allows SCC mec to be excised and thus available for horizontal transfer, while ensuring that only some cells, but not the whole population, loose their valuable SCC mec genes. Thus, while the SCC mec element expands with the multiplication of the MRSA colony, it can simultaneously be transmitted into methicillin-susceptible S. aureus (MSSA), which convert into new MRSA. Most interestingly, the fact that bistability was regulated by the cells, rather than by SCC mec, indicates that it was the choice of the bacteria to trigger or not SCC mec transfer. As a consequence, there must be, in nature, staphylococcal strains that are more or less prone to sustain SCC mec transfer. Following these seminal observations we found that excision was indeed tightly regulated during bacterial division, and occurred only during a limited period of time at the beginning of bacterial growth. This is compatible with cell-density mediated gene regulation, and may depend on the production of extracellular signal molecules that transmit appropriate orders to neighboring cells, such as in quorum sensing. The potential signal triggering SCCmec excision is as yet unknown. However, it could be critical in promoting the horizontal transfer of methicillin resistance, or for the possible development of means to interfere with it. Two additional hypothesis were logically investigated in the view of these first results. First, if some strains of MRSA might be more prone than others to promote SCC mec excision, then some strains of MS SA might be more or less prone to acquire the element as well. Second, to investigate these multiple mechanisms at an epidemiological level, one would need to develop tools amenable to explore S. aureus strains at a larger scale. Regarding the first issue, it was postulated by others that some MSSA might be refractory to SCC mec integration because they had peculiar DNA polymorphisms in the vicinity of the site-specific chromosomal entry point {attB) of SCC mec. By studying >40 S. aureus isolates from healthy carriers, we confirmed the polymorphism of the attB environment. Moreover, we could show that these polymorphic regions co-evolved with well-known phylogenic clonal clusters. Therefore, if SCCwec-refractory attB environments exist, then they would segregate in well- defined S. aureus clonal clusters that would be easy to identify at the epidemiological level. Regarding the second issue, we were able to construct a new excision reporter system in a low copy number S. aureus plasmid. The reporter system consists in a strong promoter driving a green fluorescent protein {gfp) gene, separated by an artificial SCC-like element carrying three transcriptional terminators. Thus, fluorescence is not expressed unless the SCC-like element is excised. The system has been successfully tested in several aureus and non- aureus staphylococci, and is now being applied to more strains and various excision- triggering or inhibiting conditions. Altogether the dissertation is a scientific journey through various aspects of a salient medical problem with regard to antibiotic resistance and public health threat. The research work tackles fundamental issues about the mechanisms of horizontal transfer of the SCC mec element. Moreover, it also addresses more general features of this mobile element, which could be of larger importance with regard to gene trafficking in staphylococci, and maybe other gram-positive bacteria. Finally, the dissertation sets the fundamentals for future work and possible new ways to interfere with the horizontal transfer of methicillin resistance.
Resumo:
Introduction : Les particules de HDL (High Density Lipoprotein) ont des fonctions diverses notamment en raison de leur structure tr��s h��t��rog��ne. Tout d'abord, les HDLs assurent le transport du cholest��rol de la p��riph��rie vers le foie mais sont ��galement dot��es de nombreuses vertus protectrices. Un grand nombre d'��tudes d��montre les m��canismes de protection des HDL sur les cellules endoth��liales. Sachant que les patients diab��tiques ont ses niveaux bas de HDL, le but de cette ��tude est d'investiguer les m��canismes mol��culaires de protection sur la cellule beta pancr��atique. R��sultats : Une ��tude �� microarray �� nous a permis d'obtenir une liste de g��nes r��gul��s par le stress, comme la privation de s��rum, en pr��sence ou en absence de HDL. Parmi ces g��nes, nous nous sommes particuli��rement int��ress��s �� un r��presseur de la synth��se prot��ique �� cap �� -d��pendante, 4EBP1. Dans notre ��tude transcriptomique, les niveaux d'ARNm de 4E-BP1 augmentaient de 30��% dans des conditions sans s��rum alors que les HDLs bloquaient cette ��l��vation. Au niveau prot��ique, les niveaux totaux de 4EBP1 ��taient augment��s dans les conditions de stress et cette ��l��vation ��tait contr��e par les HDLs. D'autres exp��riences de transfection ou d'infection de 4E-BP1 ont montr��s que cette prot��ine ��tait capable d'induire l'apoptose dans les cellules beta, imitant ainsi l'effet de la privation de s��rum. Afin de d��terminer le r��le direct de 4E-BP1 dans la mort cellulaire, ses niveaux ont ��t�� r��duits par interf��rence ARN. Le niveau de mort cellulaire induit par l'absence de s��rum ��tait moins ��lev�� dans des cellules �� taux r��duits de 4EBP1 par RNAi que dans des cellules contr��le. Conclusion : Ces donn��es montrent que les HDL prot��gent les cellules beta suite �� diff��rents stress et que 4E-BP1 est une des prot��ines pro-apoptotiques inhib��es par les HDL. 4E-BP1 est capable d'induire la mort cellulaire dans les cellules b��ta et cette r��ponse peut-��tre r��duite en diminuant l'expression de cette prot��ine. Nos donn��es sugg��rent que 4E-BP1 est une cible potentielle pour le traitement du diab��te.
Resumo:
R��SUM��L'hypertrophie cardiaque repr��sente un m��canisme d'adaptation du myocarde en r��ponse �� diff��rents stress. Sur le long terme, l'hypertrophie cardiaque peut ��voluer vers l'insuffisance cardiaque, l'une des principales causes de morbidit�� et de mortalit�� dans les pays industrialis��s, pour cette raison, la communaut�� scientifique est tr��s int��ress��e �� ��lucider les voies de signalisation qui r��gulent ce ph��nom��ne pathologique dans le coeur.Notre laboratoire a montr�� que AKAP-Lbc, une prot��ine d'ancrage de la prot��ine kinase A (AKAPs), est principalement exprim��e dans le coeur et peut r��guler des processus importants tels que l'hypertrophie des cardiomyocytes.AKAP-Lbc fonctionne comme un facteur d'��change de nucl��otides guanine (GEF) pour la petite Rho-GTPase RhoA. Cette fonction est activ��e par diff��rents r��cepteurs qui activent son domaine Rho-GEF. Des ��tudes r��centes ont d��montr�� que AKAP-Lbc est impliqu��e dans la r��ponse hypertrophique des cardiomyocytes suite �� l'activation des r��cepteurs α1-adr��nergiques. Le but g��n��ral de ce travail de th��se est la caract��risation de la voie de signalisation hypertrophique activ��e par AKAP-Lbc dans les cardiomyocytes.Mes travaux montrent que AKAP-Lbc organise un complexe macromol��culaire, comprenant les prot��ines kinases PKN, MLTK, MKK3 et p38 et active la prot��ine kinase p38 en r��ponse �� l'activation des r��cepteurs α1-adr��nergiques.Nos r��sultats indiquent que cette voie de signalisation au cours de la r��ponse hypertrophique active le facteur de transcription GATA4 et la prot��ine Hsp27.GATA4 est un important facteur de transcription qui r��gule la transcription de plusieurs g��nes au cours de la r��ponse hypertrophique, alors que Hsp27 est une prot��ine chaperonne qui interagit avec le cytosquelette des cardiomyocytes et les prot��ge contre le stress hypertrophique.Pris ensembles, ces ��tudes contribuent �� comprendre comment le complexe de signalisation form�� par AKAP-Lbc r��gule l'hypertrophie dans les cardiomyocytes. Au-del�� de leur int��r��t au niveau biochimique, ces travaux pourraient aussi contribuer �� la compr��hension du ph��nom��ne de l'hypertrophie dans le coeur.
Resumo:
Endothelial cells form a semi-permeable barrier that participates in the exchange of plasma fluids, proteins and cells, and helps to maintain the physiological functions of organs as well as circulatory homeostasis. Vascular permeability and vasodilatation are increased during acute and chronic inflammation, cancer and wound healing. This is mediated by exposure to certain vascular permeability increasing factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF). The peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) belong to the nuclear hormone receptor (NHRs) family of ligand-activated transcription factors. Three isotypes, PPARa, PPARp/5 and PPARy have been identified. They are all expressed in endothelial cells (ECs). Recent data have demonstrated their involvement in important mechanisms for vasculogenesis and angiogenesis, such as cell proliferation/differentiation, directional sensing/migration, and survival. PPARs were reported to modulate the expression of pro-angiogenic soluble factors, such as VEGF-A and may also participate in the regulation of expression of VEGF receptors. The aim of the present work was to elucidate the role of PPARp/δ in endothelial cell functions important for angiogenesis as well as in vascular permeability and vasodilatation. Using organ culture models of mouse aorta expiants, cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and genetically modified mouse models, we studied the consequences of loss and gain of PPARp/5 activity on endothelial cell functions. In the first part of this study, we show that the activation of PPARp/δ promotes EC outgrowth in murine aorta expiants. In vivo we observed that dermal vessel acute permeability in response to VEGF-A stimulation is strongly impaired in PPARfi/δ -I- animals. Additionally, observation of the dermal vessel morphology showed a clear enlargement of the wild-type dermal vessels upon VEGF-A injection, whereas vessels of PPARp/5 -/- animals showed almost no enlargement. The impaired response to VEGF stimulation in the knock-out animals was not due to structural or morphological abnormalities. Based on this data, we suggest that PPARp/5 may act on intracellular signaling cascades in ECs, downstream of the VEGF-A receptor. In the second part of this study, we address the relevance of PPARβ/δ vascular functions in pathophysiological inflammatory conditions, such as delayed- type hypersensitivity (DTH) reaction and anaphylaxis in mice. The DTH reaction is a cell-mediated immune reaction to protein, bacterial and viral antigens, whereas anaphylaxis is the most severe form of allergic reaction. In these in vivo models, we demonstrated that the absence of PPARβ/δ in ECs prevents the formation of severe edema in the DTH reaction, and that Ρ PARβ/δ accelerates recovery following systemic anaphylaxis, at least partially through the control of vascular permeability. Our data not only describe a novel function of PPARβ/δ in vessel permeability and vasodilatation, but also open new routes of research for the development of vessel permeability/vasodilatation regulating agents. - Les cellules endoth��liales qui bordent la face interne des vaisseaux sanguins forment l'endoth��lium, une barri��re semi-perm��able qui r��gule les ��changes de fluides, de prot��ines et de cellules immunes entre la circulation et les organes. L'endoth��lium participe ��galement au maintien de la fonction des organes et de l'hom��ostasie circulatoire. La perm��abilit�� vasculaire augmente dans des situations inflammatoires aigties ou chroniques, dans les tumeurs, et pendant la r��paration de blessures. Cette augmentation de perm��abilit�� est due �� la production de facteurs s��cr��t��s, tels que le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A), la thrombine ou I'histamine. L��s r��cepteurs nucl��aires Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR) sont des facteurs de transcription mis en activit�� par des ligands. Trois isotypes de PPARs, PPARa, ΡΡΑΡβ/δ and PPARy ont ��t�� caract��ris��s. Ils sont exprim��s dans les cellules endoth��liales, et des travaux r��cents ont montr�� qu'ils r��gulent des comportements cellulaires importants pour la vasculogen��se et l'angiogen��se, tels que la prolif��ration, la diff��renciation, la migration, et la survie des cellules. Ils r��gulent ��galement la production de VEGF-A par divers types cellulaires. Le but de ce travail ��tait d'��lucider le r��le de PPARβ/δ dans la r��gulation de la perm��abilit�� vasculaire, plus particuli��rement dans les cellules endoth��liales. Gr��ce �� des cultures d'expiants d'aortes de souris, �� la culture d'une lign��e endoth��liale humaine (HUVECs) et de souris g��n��tiquement modifi��es, nous avons ��tudi�� le r��le de PPARβ/δ dans les cellules endoth��liales, dans des situations gain et perte de fonction du r��cepteur. Dans la premi��re partie de ce travail, nous avons montr�� les propri��t��s pro-angiog��niques de PPARβ/δ dans des explants d'aortes. In vivo, nous avons observ�� l'absence d'hyperperm��abilit�� aigu�� induite par le VEGF-A, la thrombine et I'histamine chez les souris PPARβ/δ -/-. De plus, l'analyse morphologique des vaisseaux dans le derme des souris apr��s stimulation par VEGF- A a confirm�� l'absence de r��ponse �� la stimulation. Ces analyses morphologiques nous ont ��galement permis de montrer que l'absence de r��ponse aigu�� n'��tait pas due �� un d��faut de structure des vaisseaux dermiques chez les souris PPARp/δ -/-. Sur la base de ces r��sultats, nous proposons que PPARp/δ r��gule des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules endoth��liales, voie de signalisation impliqu��es dans la r��gulation de la perm��abilit�� vasculaire: Dans la seconde partie du travail, nous avons ��tudi�� l'importance de la r��gulation de la perm��abilit�� vasculaire par PPARβ/δ dans des situations pathophysiologiques impliquant une hyperperm��abilit�� aigu�� des vaisseaux : une r��action d'hypersensibilit�� cutan��e retard��e d'une part (delayed-type hypersensitivity, DTH), et un choc anaphylactique d'autre part. Dans ces deux mod��les induits exp��rimentalement chez la souris, l'absence de PPARβ/δ pr��vient en partie la formation de l'oed��me inflammatoire local (DTH), et acc��l��re la r��cup��ration (anaphylaxie), au moins partiellement en r��glant la perm��abilit�� vasculaire. Ces r��sultats ouvrent un nouveau champs d'��tude quant au r��le de PPARβ/δ dans les vaisseaux et �� d'��ventuelles applications th��rapeutiques dans des pathologies inflammatoires.
Resumo:
Abstract : Breast cancer incidence rates have increased over the past hundred years, in particular, in Western industrial countries and they continue to rise worldwide. Breast cancer risk has been linked to life exposure to endogenous and exogenous estrogens, and there is increasing concern that exposure to endocrine disruptors which are increasingly accumulating in our environment may also have a role. Using the mouse as model, I have analyzed the physiological role of estrogen signaling in mammary gland development. I have shown that estrogen signaling through the estrogen receptor alpha (ERα) in the mammary epithelium is required for ductal morphogenesis during puberty. Moreover, I have demonstrated that estrogens induce proliferation of mammary epithelial cells through a paracrine mechanism. The presence of estrogen signaling is essential cell intrinsically via ERα or ERβ for the terminal differentiation into milk secreting cells during pregnancy. Furthermore, I have examined how perinatal exposure to the estrogenic plasticizer bisphenol A (BPA) found ubiquitously in consumer goods such as baby bottles formula and beverage containers affects the normal mammary gland development and possibly predispose the mammary gland to tumorigenesis. I have found that C57b16 mice that were exposed, via their drinking water, to several BPA doses ranging from 0.025��g/kg/day to 250��g/kg/day exhibits delayed terminal end bud formation and consequently the ductal outgrowth. Later in life, the mice that were exposed in utero to BPA displayed an increased number of mammary epithelial cells. Acute exposure of 3-week-old mice to BPA can alter gene expression levels of an important estrogen target gene, amphiregulin. Taken together these data are compatible with a scenario in which perinatal BPA exposure may alter mammary gland development by affecting developmental signaling pathways. R��sum�� : Les taux d'incidence des cancers du sein ont augment�� au cours des cent derni��res ann��es en particulier dans les pays industriels occidentaux et ils continuent d'augmenter dans le monde entier. Le risque du cancer du sein a ��t�� corr��l�� �� l'exposition au cours de la vie aux oestrog��nes endog��nes et exog��nes. Il y a une pr��occupation croissante concernant l'exposition aux perturbateurs endocriniens qui ne cessent de s'accumulent dans notre environnement et qui peuvent ��galement avoir un r��le dans l'augmentation des cancers du sein. En utilisant le mod��le de souris, j'ai analys�� le r��le physiologique de la voie de signalisation �� l'oestrog��ne dans le d��veloppement mammaire. J'ai prouv�� que l'oestrog��ne par l'interm��diaire de son r��cepteur alpha (ERα) est indispensable dans l'��pith��lium pour la morphog��n��se du syst��me canalaire pendant la pubert��. De plus, j'ai d��montr�� que les oestrog��nes induisent la prolif��ration des cellules ��pith��liales mammaires par un m��canisme paracrine. La pr��sence de la voie de signalisation �� l'oestrog��ne est essentielle de mani��re intrins��que �� la cellule par l'interm��diaire d'ERα ou ERβ pour la diff��rentiation terminale des cellules ��pith��liales en cellules s��cr��trices de lait pendant la grossesse. En outre, j'ai examin�� comment l'exposition p��rinatale au bisph��nol A (BPA), un plastifiant pr��sentant des propri��t��s ostrog��niques et omnipr��sent dans divers produits d'usage courant tels que les biberons des b��b��s et les r��cipients en plastique, affecte le d��veloppement de la glande mammaire et pr��dispose probablement celle-ci �� la tumorig��n��se. J'ai constat�� que l'exposition p��rinatale �� BPA retarde la formation des bourgeons terminaux et par cons��quent la croissance du syst��me canalaire. Plus tard dans la vie, les souris qui ont ��t�� expos��es dans l'ut��rus au BPA ont montr�� un plus grand nombre de cellules ��pith��liales mammaires. L'exposition aigu�� de souris ��g��es de 3 semaines au BPA perturbe le niveau d'expression d'un g��ne cible important de l'oestrog��ne, l'amphiregulin. Ces donn��es sont compatibles avec un sc��nario dans lequel l'exposition p��rinatale au BPA peut changer le d��veloppement de la glande mammaire en affectant des voies de signalisation d��veloppementales.
Resumo:
1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 R��SUM�� Le r��le de la r��ponse immunitaire inn��e a longtemps ��t�� n��glig�� quant �� l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une r��ponse immune adaptative efficace dirig��e contre un pathog��ne. Si l'importance des r��cepteurs Toll-like (TLR) du syst��me inn�� dans la reconnaissance des virus et bact��ries a ��t�� d��montr��e, son r��le dans la d��fense contre les pathog��nes eucaryotes reste encore tr��s ��lusif. R��cemment, il a ��t�� montr�� que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la r��ponse immunitaire inn��e et adaptative apr��s une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un mod��le marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont r��sistantes �� l'infection et d��veloppent une r��ponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et d��veloppent une r��ponse Th2 induite par IL-4. La diff��rentiation Th1/Th2 est un ��v��nement qui prend place de mani��re d��finitive lors de la premi��re semaine apr��s infection. Les ��v��nements pr��coces promouvant le d��veloppement d'une r��ponse Th1 ou Th2 n'��tant pas connus, l'objectif de ce travail a ��t�� de d��montrer un r��le des TLRs dans l'initiation d'une r��ponse immune inn��e et adaptative suite �� l'infection par L. major. Nous avons d��montr�� que MyD88, une mol��cule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est n��cessaire pour que les souris r��sistantes C57BL/6 d��veloppent une r��ponse Th1 protectrice. L'importance du r��le de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant ��t�� d��montr��e, nous avons privil��gi�� l'analyse de la r��ponse immunitaire suite �� une infection in vivo de souris d��ficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond g��n��tique r��sistant. Les r��sultats obtenus montrent que la pr��sence de ces r��cepteurs n'est pas indispensable pour le contr��le de l'infection et la polarisation d'une r��ponse Th1 caract��ristique de la r��sistance �� L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 d��pendante. L'expression de l'ARNm des diff��rents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et r��sistantes pendant la premi��re semaine d'infection a ��t�� d��termin��e par PCR quantitative en temps r��el. Les r��sultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 ��tait r��gul�� positivement suite �� l'infection par L. major chez les souris r��sistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'��tait d��tectable chez les souris sensibles BALB/c. Le r��le des r��cepteurs TLR7 et TLR9 a donc ��t�� ��valu�� par l'infection par L. major des souris d��ficientes en TLR7 et TLR9 sur fond g��n��tique C57BL/6. Nos r��sultats ont clairement d��montr�� que les souris d��ficientes en TLR7 montrent une r��ponse immunitaire identique �� celle des souris r��sistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au d��veloppement d'une Th1 ainsi qu'au contr��le de la parasit��mie. Paz contre, les souris d��ficientes en TLR9 sur un fond g��n��tique r��sistant ont montr�� une grande variabilit�� dans la r��ponse �� l'infection. En effet, la moiti�� des souris deviennent sensibles �� l'infection, ceci ��tant associ�� �� une diminution dans la production d'IFN-γ et �� une augmentation de la production d'IL-4. Ces r��sultats sugg��rent que TLR9 est impliqu�� dans le contr��le de la l��sion et de la r��ponse immunitaire suite �� l'infection avec L. major. Cependant les r��sultats avec les souris d��ficientes en TLR9 montrant une grande h��t��rog��n��it�� et une balance Th1/Th2 instable, nous avons ��mis l'hypoth��se que les cellules T r��gulatrices pouvaient ��tre impliqu��es dans ce ph��nom��ne. Nous avons effectivement constat�� qu'apr��s d��pl��tion des cellules CD4+CD25+, les souris d��ficientes en TLR9 d��veloppent des l��sions aussi grandes que les souris BALB/c apr��s infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le m��me que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extr��ment bas. Les m��canismes r��gulateurs impliqu��s dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en ��vidence l'importance du TLR9 dans le d��veloppement d'une r��ponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus n��cessaire pour la r��sistance �� l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire r��pandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutan��e et de 1 �� 1,5 million de nouveaux cas par ann��e. Plus de 12 millions de personnes sont affect��es par la maladie et 350 millions de personnes sont une population �� risque. Un mod��le marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a ��t�� ��tabli qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observ��s dans le cas de la leishmaniose cutan��e chez l'homme. L'analyse de la r��ponse immunitaire dans les souris infect��es par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont r��sistantes �� l'infection et d��veloppent une r��ponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et d��veloppent une r��ponse de type Th2. La r��ponse immune adaptative dans le mod��le d'infection avec L. major �� ��t�� largement ��tudi��e. Cependant, les ��v��nements pr��coces d��terminants pour le d��veloppement d'une r��ponse Th1 ou Th2 restent encore tr��s flous. R��cemment, plusieurs publications ont montr�� que les r��cepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer �� l'initiation de la r��ponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de th��se, nous avons ��tudi�� le r��le de MyD88, une mol��cule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la r��ponse immune suite �� une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement r��sistantes �� l'infection avec L. major deviennent sensibles et d��veloppent des l��sions importantes. Ces souris ne sont plus capables de d��velopper une r��ponse Thl, normalement caract��ristique de leur ph��notype r��sistant. Nous avons ensuite tent�� de comprendre quels TLRs, plus pr��cis��ment, pouvait ��tre impliqu�� dans ce processus. Malgr�� quelques ��vidences d��montrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un r��le important dans l'initiation d'une r��ponse immunitaire adaptative �� Leishmania, nous avons montr�� que, in vivo apr��s infection avec L. major, la d��ficience d'un de ces r��cepteurs n'��tait pas suffisante �� faire basculer la r��ponse immunitaire. Les souris C57BL/6 d��ficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contr��ler l'��volution de la maladie. De plus, ces souris, malgr�� l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite r��ponse Thl. Etant donn�� que TLR2 et TLR4 n'��taient pas essentiels pour la r��sistance �� la maladie, nous avons analys�� les TLRs, parmi les 12 d��crits qui pouvaient ��tre indispensables au d��veloppement d'une r��ponse de type Th1 associ��e �� la r��sistance �� l'infection par Leishmania. Nos exp��riences ont montr�� que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 ��tait modul��e suite �� l'infection par L. major chez la souris r��sistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'��tait visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un r��le dans la r��ponse immunitaire au parasite, nous avons ��tudi�� l'��volution de l'infection dans les souris d��ficientes en TLR7 et TLR9. Nos r��sultats ont clairement d��montr�� que TLR7 n'��tait pas indispensable �� la r��sistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des cons��quences radicales sur le contr��le de la l��sion et de la r��ponse immunitaire suite �� l'infection avec L. major. Ce travail r��v��le ainsi l'importance du TLR9 dans le d��veloppement d'une r��ponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus n��cessaire pour la r��sistance �� l'infection. Il est a not�� que nos r��sultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activit�� adjuvante importante dans la pr��paration de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compr��hension des m��canismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le d��veloppement de vaccins th��rapeutiques efficaces.