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Abstract The c-myc gene is one of the most frequently mutated oncogenes found in human tumors. c-Myc has been implicated in the regulation of various biological processes including cell cycle progression, cellular growth, differentiation, angiogenesis, immortalization and apoptosis. To assess the normal role of c-Myc in epithelial cell types in vitro and in vivo we have deleted the c-myc gene in keratinocytes and in the adult skin epidermis by conditional Cre/loxP mediated recombination. Similar to what we have previously shown in mouse embryonic fibroblasts acute elimination of c-Myc activity in cultured keratinocytes causes cells to cease proliferation and adapt a flat cell morphology. Mutant cells accumulate in a diploid Ki67neg stage, indicative of a quiescent Go stage. This demonstrates that c-Myc activity is essential to maintain keratinocytes in a productive cell cycle. In addition, mutant keratinocytes showed a defect in Ca2+ induced induction of the differentiation marker Keratin 1 suggesting a role for c-Myc during differentiation. To assess the in vivo role of c-Myc we used a tamoxifen inducible K5::CreERT transgene to delete the c-myc gene in the adult skin epidermis. Unexpectedly, despite strong c-Myc expression in the basal compartment it is not required for maintenance of the skin epidermis in the adult mouse. The epidermis appeared normal with respect to both proliferation and differentiation. In addition, no selection against c-Myc deficient epidermal cells occurred over many months, further confirming that c-Myc is dispensable for normal skin homeostasis. Even more surprising, TPA induced hyperproliferation also occurred in a c-Myc independent manner. Treatment of the skin with the mutagen DMBA prior to TPA is a classical way to induce papillomas by selecting for mutations that lead to dominant activation of the oncogene Ha-Ras. Most interestingly tumor formation was severely inhibited suggesting that tumor progression requires endogenous c-Myc. Further studies are required to address whether the role of c-Myc in the activation of telomerase or the Werner protein, or its role to induce angiogenesis is required for skin tumor progression, In conclusion, this work shows that while c-Myc is not required for maintenance or hyperplasia of mouse epidermis, it is essential for skin tumor progression in collaboration with Ras. Rsum Le gne c-myc est un des oncognes les plus frquemment muts dans les tumeurs humaines. c-Myc est impliqu dans la rgulation de processus biologiques varis, comme la progression du cycle cellulaire, la croissance cellulaire, la diffrenciation, l'angiogense, l'immortalisation et l'apoptose. Pour caractriser le rle physiologique de c-Myc dans les cellules de type pithlial in vitro et in vivo, le gne c-myc a t dlt dans des kratinocytes primaires et dans l'piderme de peau de souris adultes par des recombinaisons conditionnelles (systme Cre/loxP). De la mme faon que dans les fibroblastes d'embryon de souris, l'limination aigu de l'activit de c-Myc dans les kratinocytes en culture primaire provoque l'arrt de la prolifration des cellules et leur applatissement morphologique. Les cellules mutantes restent dans un stade diplode Ki67neg, indiquant un stade quiescent Go. Cela dmontre que l'activit de c-Myc est essentielle pour maintenir les kratinocytes dans le cycle cellulaire. De plus, les kratinocytes mutants montrent une dficience pour le marqueur de diffrenciation Kratine 1 au cours de la diffrenciation induite par le calcium, suggrant un rle de c-Myc dans la diffrenciation cellulaire. Pour comprendre le rle de c-Myc in vivo, le transgne K5::CreERT inductible par le tamoxifen a t utilis pour dlter le gne c-inyc dans l'piderme de souris adultes. Etonnemment, malgr une forte expression de c-Myc dans le compartiment basal de l'piderme, ce gne n'est pas ncessaire pour la maintenance de l'piderme de la peau chez la souris adulte. L'piderme apparait normal avec une prolifration et une diffrenciation physiologique des cellules. De plus, il n'y a pas de slection contre les cellules pidennales c-Myc dficientes aprs plusieurs mois, ce qui confirme que c-Myc n'est pas ncessaire pour l'homostasie normale de la peau. Encore plus surprenant, une hyperprolifration est galement induite par du TPA chez les souris mutantes, impliquant une voie de prolifration indpendante de c-Myc. Le traitement de la peau par le mutagne DMBA avant le traitement au TPA est une voie classique d'induction de papillomes, par slection de mutations conduisant l'activation de l'oncogne Ha-Ras. La formation des tumeurs est fortement inhibe chez les souris mutantes, suggrant que la progression des tumeurs ncessite la prsence endogne de c-Myc. De nouvelles tudes sont ncessaires pour savoir si c-Myc a un rle dans l'activation de la tlomrase ou de la protine de Werner, ou encore dans l'angiognse, qui sont ncessaires pour la progression tumorale. En conclusion, ce travail montre que mme si c-Myc n'est pas ncessaire pour la maintenance ou l'hyperplasie de la peau de souris, il est essentiel pour la progression des tumeurs de la peau en collaboration avec Ras.

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Rsum Les mcanismes qui coordonnent la progression du cycle cellulaire lors de la miose avec les vnements du dveloppement embryonnaire prcoce, y compris la formation des axes de polarit embryonnaire, sont peu compris. Dans le zygote du vers Caenorhabditis elegans, les premiers signes de polarit Antro-Postrieur (A-P) embryonnaire apparaissent aprs que la miose soit termine. La nature des protines et des mcanismes molculaires qui cassent la symtrie du zygote n'est pas connue. Nous dmontrons que zyg-11 et cul-2 promeuvent la transition mtaphase - anaphase et la sortie de la phase M lors de la seconde division miotique. Nos rsultats indiquent que ZYG-11 agit comme unit recrutant le substrat d'une ligase E3 comprennant CUL-2. Nos rsultats montrent aussi que le dlai de sortie de la phase M dpend de l'accumulation de la Cyclin B, CYB-3. Nous dmontrons que dans des embryons zyg-11(RNAi) ou cul-2(RNAi), une polarit inverse est tablie lors du dlai de miosis II. Enfin nous montrons que les dfauts de cycle cellulaire et ceux de polarit peuvent tre spars. De plus, nous faisons apparaitre que l'tablissement d'une polarit inverse pendant le dlai de miose II des embryons zyg-11(RNAi), comme l'tablissement de la A-P polarit des embryons sauvage ne semblent pas requrir les microtubules. Nous montrons galement les premiers rsultats d'un crible deux hybrides ainsi qu'un crible gnomique qui vise identifier des gnes dont l'inactivation augmente ou supprime les dfauts de mutants pour le gne zyg-11, afin d'identifier les gnes qui intragissent avec ZYG-11 pour assumer ses deux fonctions sparables. Par consquent, nos trouvailles suggrent un modle selon lequel ZYG-11 est une sous-unit qui recrute les substrats d'une ligase E3 base sur CUL-2 qui promeut la progression du cycle cellulaire et empche l'tablissement de la polarit pendant la miose II, et o le centrosome agit comme la cl qui polarise l'embryon la fin de la miose. Summary The mechanisms that couple meiotic cell cycle progression to subsequent developmental events, including specification of embryonic axes, are poorly understood. In the one cell stage embryos of Caenorhabditis elegans, the first signs of Antero-Posterior (A-P) polarity appear after meiosis completion. A centrosome derived component breaks symmetry of the embryo, but the molecular nature of this polarity signal is not known. We established that zyg-11 and cul-2 promote the metaphase to anaphase transition and M phase exit at meiosis II. Our results indicate that ZYG-11 acts as a substrate recruitment subunit of a CUL-2-based E3 ligase. Moreover, we find that the delayed meiosis II exit of embryos lacking zyg-11 is caused by accumulation of the B-type cyclin, CYB-3. We demonstrate that inverted A-P polarity is established during the meiosis II delay in zyg-11(RNAi) and cul2(RNAi) embryos. Importantly, we demonstrate that the polarity defects following zyg-11 or cul-2 inactivation can be uncoupled from the cell cycle defects. Furthermore, we found that microtubules appear dispensable for inverted polarity during the meiosis II delay in zyg-11(RNAi) embryos, as well as for A-P polarity during the first mitotic cell cycle in wild-type embryos. We also show the initial results from a comprehensive yeast two hybrid, as well as an RNAi-based functional genomic enhancer and suppressor screen, that may lead to identification of proteins that interact with zyg-11 to ensure the two functions. Our findings suggest a model in which ZYG-11 is a substrate recruitment subunit of an CUL-2-based E3 ligase that promotes cell cycle progression and prevents polarity establishment during meiosis II, and in which the centrosome acts as a cue to polarize the embryo along the AP axis after exit from the meiotic cell cycle.

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Abstract Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) form a family of three nuclear receptors regulating important cellular and metabolic functions. PPARs control gene expression by directly binding to target promoters as heterodimers with the Retinoid X Receptor (RXR), and their transcriptional activity is enhanced upon activation by natural or pharmacological ligands. The binding of PPAR/RXR heterodimers on target promoters allows the anchoring of a series of coactivators and corepressors involved in promoter remodeling and the recruitment of the transcription machinery. The transcriptional output finally depends on a complex interplay between (i) the respective expression levels of PPARs, RXRs and of other nuclear receptors competing for DNA binding and RXR recruitment, (ii) the availability and the nature of PPAR and RXR ligands, (iii) the expression levels and the nature of the different coactivators and corepressors and (iv) the sequence and the epigenetic status of the promoter. Understanding how all these factors and signals integrate and fine-tune transcription remains a challenge but is necessary to understand the specificity of the physiological functions regulated by PPARs. The work presented herein focuses on the molecular mechanisms of PPAR action and aims at understanding how the interactions and mobility of the receptor modulate transcription in the physiological context of a living cell: Such observations in vivo rely on the use of engineered fluorescent protein chimeras and require the development and the application of complementary imaging techniques such as Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Using such techniques, PPARs are shown to reside solely in the nucleus where they are constitutively associated with RXR but transcriptional activation by ligand binding -does not promote the formation of sub-nuclear structures as observed with other nuclear receptors. In addition, the engagement of unliganded PPARs in large complexes of cofactors in living cells provides a molecular basis for their ligand-independent activity. Ligand binding reduces receptor diffusion by promoting the recruitment of coactivators which further enlarge the size of PPAR complexes to acquire full transcriptional competence. Using these molecular approaches, we deciphered the molecular mechanisms through which phthalates, a class of pollutants from the plastic industry, interfere with PPARγ signaling. Mono-ethyl-hexyl-phthalate (MEHP) binding induces the recruitment of a specific subset of cofactors and translates into the expression of a specific subset of target genes, the transcriptional output being strongly conditioned by the differentiation status of the cell. This selective PPARγ modulation induces limited adipogenic effects in cellular models while exposure to phthalates in animal models leads to protective effects on glucose tolerance and diet-induced obesity. These results demonstrate that phthalates influence lipid and carbohydrate metabolism through complex mechanisms which most likely involve PPARγ but also probably PPARα and PPAR, Altogether, the molecular and physiological demonstration of the interference of pollutants with PPAR action outlines an important role of chemical exposure in metabolic regulations. Rsum Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) forment une famille de rcepteurs nuclaires qui rgulent des fonctions cellulaires et mtaboliques importantes. Les PPARs contrlent l'expression des gnes en se liant directement leurs promoteurs sous forme d'htrodimres avec les rcepteurs RXR (Retinoid X Receptor), et leur activit transcriptionnelle est stimule par la liaison de ligands naturels ou pharmacologiques. L'association des htrodimres PPAR/RXR avec les promoteurs des gnes cibles permet le recrutement de coactivateurs et de corpresseurs qui vont permettre le remodelage de la chromatine et le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Les actions transcriptionnelles du rcepteur dpendent toutefois d'interactions complexes qui sont rgules par (i) le niveau d'expression des PPARs, des RXRs et d'autres rcepteurs nuclaires entrant en comptition pour la liaison l'ADN et l'association avec RXR, (ii) la disponibilit et la nature de ligands de PPAR et de RXR, (iii) les niveaux d'expression et la nature des diffrents coactivateurs et corpresseurs et (iv) la squence et le marquage pigntique des promoteurs. La comprhension des mcanismes qui permettent d'intgrer ces aspects pour assurer une rgulation fine de l'activit transcriptionnelle est un dfi qu'il est ncessaire de relever pour comprendre la spcificit des fonctions physiologiques rgules par les PPARs. Ce travail concerne l'tude des mcanismes d'action molculaire des PPARs et vise mieux comprendre comment les interactions du rcepteur avec d'autres protines ainsi que la mobilit de ce dernier rgulent son activit transcriptionnelle dans le contexte physiologique des cellules vivantes. De telles observations reposent sur l'emploi de protines fusionnes des protines fluorescentes ainsi que sur le dveloppement et l'utilisation de techniques d'imagerie complmentaires telles que le FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ou la FCS (Fluorescence Corrlation Spectroscopy). En appliquant ces mthodes, nous avons pu montrer que les PPARs rsident toujours dans le noyau o ils sont associs de manire constitutive RXR, mais que l'ajout de ligand n'induit pas la formation de structures sub-nuclaires comme cela a pu tre dcrit pour d'autres rcepteurs nuclaires. De plus, les PPARs sont engags dans de larges complexes protiques de cofacteurs en absence de ligand, ce qui procure une explication molculaire leur activit ligand-indpendante. La liaison du ligand rduit la vitesse de diffusion du rcepteur en induisant le recrutement de coactivateurs qui augmente encore plus la taille des complexes afin d'acqurir un potentiel d'activation maximal. En utilisant ces approches molculaires, nous avons pu caractriser les mcanismes permettant aux phtalates, une classe de polluants provenant de l'industrie plastique, d'interfrer avec PPARγ. La liaison du mono-ethyl-hexyl-phtalate (NERF) PPARγ induit un recrutement slectif de cofacteurs, se traduisant par l'induction spcifique d'un sous-ensemble de gnes qui varie en fonction du niveau de diffrentiation cellulaire. La modulation slective de PPARγ par le MEHP provoque une adipogense modre dans des modles cellulaires alors que l'exposition de modles animaux aux phtalates induit des effets bnfiques sur la tolrance au glucose et sur le dveloppement de l'obsit. Toutefois, les phtalates ont une action complexe sur le mtabolisme glucido-lipidique en faisant intervenir PPARγ mais aussi probablement PPARα et PPAR. Cette dmonstration molculaire et physiologique de l'interfrence des polluants avec les rcepteurs nuclaires PPAR souligne un rle important de l'exposition de tels composs dans les rgulations mtaboliques.

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RESUME Dans le cadre de l'infection VIH-1, deux mcanismes gnraux, a) une destruction priphrique massive ou b) un dfaut dans la production priphrique ou centrale de nouvelles cellules, pourraient tre l'origine de l'puisement des lymphocytes T CD4. La question soulve une importante controverse. Dans cette tude, la production thymique et la capacit de prolifration de lymphocytes T ont t tudies conjointement. La production thymique a t value par l'analyse du contenu en cercles d'excision gnrs lors du rarrangement du rcepteur aux cellules T (ou TRECs) des cellules T CD4 et CD8 priphriques, provenant de sujets sains VIH-1 ngatifs (n=120) ou infects par le VIH-1 (n=297), au stade prcoce, intermdiaire et tardif de la phase chronique de la maladie. Au stade prcoce, nous observons que le contenu en TRECs de la population CD4 est suprieur celui de la population contrle. Aucune diffrence n'est observe lors de la phase intermdiaire, alors que le contenu en TRECs est infrieur lors de la phase tardive, en comparaison avec le groupe contrle. Pour les lymphocytes T CD8, le contenu en TRECs reste infrieur au groupe contrle, tous les stades de la maladie. Ainsi, au stade prcoce, la production thymique chercherait compenser la perte de lymphocytes T CD4 puis, avec l'volution de la maladie, cette possibilit s'puiserait. Les profils d'expression des gnes rgulateurs du cycle cellulaire pour les cellules T CD4 et CD8 priphriques, obtenus par la mthode des biopuces d'ADNc (microarray), ont permis l'analyse de la capacit de prolifration priphrique des lymphocytes T. Trois populations cellulaires ont t compares entre elles : lymphocytes provenant de sujets infects par le VIH-1, lymphocytes provenant de sujets VIH-1-ngatifs et lymphocytes activs in vitro provenant de sujets VIH-1-ngatifs. Les rsultats montrent, pour les cellules T CD8, un tat d'activation et un profil d'expression des gnes rgulateurs du cycle cellulaire comparables ceux des cellules actives in vitro. Le profil d'expression gntique des cellules T CD4, par contre, montre une activation sub-optimale, conjointement une forte expression de p53, ce qui pourrait amener un bloc en phase G1 du cycle cellulaire ainsi qu' une forte apoptose. En conclusion, cette perturbation de la progression du cycle cellulaire des lymphocytes T CD4 priphriques pourrait contribuer l'chec de la restauration du nombre de lymphocytes T CD4 et ceci, malgr une production thymique conserve dans les stades prcoces de la maladie, comme dmontr par l'analyse du contenu en TRECs.

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Arenaviruses are rodent-born world-wide distributed negative strand RNA viruses that comprise a number of important human pathogens including Lassa virus (LASV) which causes more than 3 00'000 infections annually in Western Africa. Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is the prototypic member of the arenavirus family, which is divided in two major subgroups according to serological properties and geographical distribution, the Old World and New World arenaviruses. The envelope glycoprotein precursors (GPCs) of arenaviruses have to undergo proteolytic processing to acquire biological function and to be incorporated into progeny virions. A cellular enzyme is responsible for this processing: the Subtilisin Kexin Isozyme-1 or Site-1 protease (SKI- 1/S1P). In this thesis we have studied the relationship between SKI-1/S1P and the envelope GPs of arenaviruses. In a first project, we investigated the molecular interactions between SKI-1/SIP and arenavirus GPCs. Using SKI-1/SIP mutants, we confirmed previously published observations locating LCMV GPC and LASV GPC processing in the Late Golgi/TGN and ER/cis-Golgi, respectively. A single mutation in the cleavage site of LCMV was sufficient to re-locate SKI- 1/SIP-mediated processing from the late Golgi/TGN to the ER/cis-Golgi. We then demonstrated that the transmembrane domain, the C-terminal tail and the phosphorylation sites of SKI-1/S1P are dispensable for GPC processing. Additionally we identified a SKI- 1/S1P mutant defective for autoprocessing at site Β, B' that was selectively impaired in processing of viral GPCs but not cellular substrates. We also showed that a soluble variant of SKI-1/SIΡ was unable to cleave envelope GPs at the cell surface when added in the culture medium. This study highlighted a new target for small molecule inhibitors that would specifically impair GPC but not cellular substrate processing. In a second project, we identified and characterized two residues: LASV GPC Y253 and SKI-1/S1P Y285 that are important for the SKI-1/SIP-mediated LASV GPC cleavage. An alignment of GPC sequences revealed a conserved aromatic residue in P7 position in the GPCs of Old World and Clade C of New World arenaviruses. Mutations in GPC at position P7 impaired processing efficiency. In SKI-1/S1P, mutating Y285 into A negatively affected processing of substrates containing aromatic residues in P7, without affecting others. This property could be used to develop specific drugs targeting SKI-1/SIP-mediated cleavage of LASV GPC without affecting cellular substrates. As a third project we studied the role of the SKI-1/SIP-mediated processing and the unusual stable signal peptide (SSP) for the folding and secretion of soluble forms of the ectodomain of LASV and LCMV glycoproteins. We provide evidence that the transmembrane domain and the cytosolic tail are crucial for the stability of the prefusion conformation of arenavirus GP and that the SSP is required for transport and processing of full-length GP, but not the soluble ectodomain per se. Taken together, these results will lead to a better understanding of the complex interactions between arenavirus GPCs and SKI-1/S IP, paving the avenue for the development of novel anti-arenaviral therapeutics. - Les Arenavirus sont des virus ARN ngatif distribus mondialement et ports par les rongeurs. Cette famille de virus comprend des virus hautement pathognes pour l'homme comme le virus de Lassa (LASV) qui cause plus de 300Ό00 infections par anne en Afrique de l'Ouest. Le virus de la choriomningite lymphocytaire (LCMV) est le reprsentant de cette famille qui est divise en deux sous-groupes selon des critres srologiques et de distributions gographiques: arenavirus du Nouveau et de l'Ancien monde. Les glycoprotines d'enveloppe de ces virus (GPCs) doivent tre clives pour tre incorpores dans le virus et ainsi lui permettre d'tre infectieux. Une enzyme cellulaire est responsable de ce clivage : la Subtilisin Kexin Isozyme-1 ou protase Site-1 (SKI-l/SlP). Dans cette thse, nous avons tudi la relation entre cette enzyme cellulaire et les GPs des arenavirus. Dans un premier temps, nous avons tudi les interactions molculaires entre SKI- 1/S1P et GPC. A l'aide de mutants de SKI-l/SlP, nous avons confirm des rsultats prcdemment publis montrant que les glycoprotines d'enveloppe de LASV sont clivs dans le rticulum endoplasmique/cis-Golgi alors que celles de LCMV sont clives dans le Golgi tardif/TGN. Une seule mutation dans le site de clivage de la glycoprotine de LCMV est suffisante pour changer le compartiment cellulaire dans lequel est clive cette glycoprotine. Ensuite, nous avons dmontr que le domaine transmembranaire, la partie cytosolique C-terminale ainsi que les sites de phosphorylations de cette enzyme ne sont pas indispensables pour permettre le clivage de GPC. De plus, nous avons identifi un mutant de SKI-l/SlP dans lequel Γ autoprocessing au site B,B' est impossible, incapable de cliver GPC mais toujours pleinement fonctionnelle envers ses substrats cellulaires. Nous avons galement dmontr qu'une forme soluble de SKI-l/SlP ajoute dans le milieu de culture n'est pas capable de couper GPC la surface de la cellule. Cette tude a dfini une nouvelle cible potentielle pour un mdicament qui inhiberait le clivage des glycoprotines des arenavirus sans affecter les processus normaux de la cellule. Dans un second project, nous avons identifi deux acides amins, LASV GPC Y253 et SKI-l/SlP Y285, qui sont important pour le clivage de LASV GPC. Un alignement des squences de clivage des GPCs a montr qu'un rsidu aromatique est conserv en position P7 du site de clivage chez tous les arenavirus de l'Ancien monde et dans le clade C des arenavirus du Nouveau monde. Une mutation de cet acide amine dans GPC rduit l'efficacit de clivage par SKI-l/SlP. Mutation de la tyrosine 285 de SKI-l/SlP en alanine affecte ngativement le clivage des substrats contenant un rsidu aromatique en position P7 sans affecter les autres. Cette proprit pourrait tre utilise pour le dveloppement de mdicaments spcifiques ciblant le clivage de GPC. Finalement, nous avons tudi le rle du processing accomplit par SKI-l/SlP et du signal peptide pour le pliage et la scrtion de formes solubles des glycoprotines de LASV et LCMV. Nous avons montr que le domaine transmembranaire et la partie cytosolique de GP sont crucials pour la stabilit de la conformation pre-fusionnelle des GPs et que SSP est ncessaire pour le transport et le processing de GP, mais pas de son ecto-domaine soluble. En conclusion, les rsultats obtenus durant cette thse permettrons de mieux comprendre les interactions complexes entre SKI-l/SlP et les glycoprotines des arenavirus, ouvrant le chemin pour le dveloppement de nouveaux mdicaments anti-arnaviraux.

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Objectif : Les panchements pleuraux sont frquents chez les patients porteurs de cancer et dterminer s'ils sont de nature tumorale ou non relve d'une grande importance clinique, particulirement pour le groupe des carcinomes pulmonaires NON petites cellules (NSCLC). Le PET/CT s'est montr d'une grande utilit et est actuellement indiscutablement reconnu comme outils ncessaire dans la prise en charge et notamment la stadification et le suivi des cancers, et particulirement des cancers pulmonaires. Sa capacit pouvoir distinguer les panchements pleuraux malins des panchements pleuraux non tumoraux, bnins n'est pas prcisment connue et n'a pas jusqu' prsent t investigue de manire approfondie. Matriel et mthodes : Nous avons examin la captation du FDG (indice SUVmax) des panchements pleuraux de 50 PET/CT raliss chez 47 patients (29 hommes, 18 femmes, 6016 ans) avec panchements pleuraux et cancer connu (24 NSCLC, 7 lymphomes, 5 cancer du sein, 4 GIST, 3 msothliomes, 2 cancer ORL, 2 tratomes malins, 1 carcinome colorectal, 1 carcinome oesophagien, 1 mlanome). Ces rsultats ont t corrls aux rsultats des examens cytopathologiques raliss aprs ponction de ces mmes panchements dans un intervalle mdian de 21 jours (interquartile range -3 to 23). L'examen du liquide d'panchement comportait la mesure du pH, la distribution relative des diffrents lments cellulaires (macrophages, neutrophils, osinophiles, basophiles, lymphocytes, plasmocytes), la numration cellulaire et bien entendu prsence de cellules tumorales. Rsultats : Parmis les panchements, 17 taient malins (34%) (6 NSCLC, 5 lymphomes, 2 cancers mammaires, 2 msothliomes, 2 tratomes malins). Les SUV taient plus levs dans les panchements malins que dans les panchements bnins [3.7 (95%IC 1.8-5.6) vs. 1.7 g/ml (1.5-1.9), p = 0.001], avec une corrlation entre les panchements malins et le SUV (coefficient de Spearman ρ = 0.50, p = 0.001). Il n'a pas t observ de corrlation entre aucun des autres paramtres cyptopathologiques ou radiologiques analys (aire sous la courbe ROC 0.83 0.06). En utilisant un seuil du SUV de 2.2-mg/l, 12 examens PET/CT taient interprts comme positifs and 38 comme ngatifs avec une sensibilit et une spcificit, valeur prdictive positive et ngative de 53%, 91%, 75% and 79% respectivement. Concernant le groupe des NSCLC seulement (n = 24), aire sous la courbe ROC tait de 0.95 0.04. Sept examens taient considrs comme positifs et 17 comme ngatifs avec une sensibilit, une spcificit, valeur prdictive positive et ngative de 83%, 89%, 71 et 94% respectivement. Conclusion : Le PET/CT peut aider diffrencier la nature bnigne ou maligne des panchements avec une haute spcificit chez les patients avec tumeur connue, en particulier dans un contexte de carcinome NON petites cellules.

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Diabetes is a growing epidemic with devastating human, social and economic impact. It is associated with significant changes in plasma concentrations of lipoproteins. We tested the hypothesis that lipoproteins modulate the function and survival of insulin-secreting cells. We first detected the presence of several receptors that participate in the binding and processing of plasma lipoproteins and confirmed the internalization of fluorescent LDL and HDL particles in insulin-secreting β-cells. Purified human VLDL and LDL particles reduced insulin mRNA levels and β-cell proliferation, and induced a dose-dependent increase in the rate of apoptosis. In mice lacking the LDL receptor, islets showed a dramatic decrease in LDL uptake and were partially resistant to apoptosis caused by LDL. VLDL-induced apoptosis of β-cells involved caspase-3 cleavage and reduction in levels of the c-Jun N-terminal (JNK) Interacting Protein-1 (IB1/JIP-1). In contrast, the pro-apoptotic signaling of lipoproteins was antagonized by HDL particles or by a small peptide inhibitor of JNK. The protective effects of HDL were mediated, in part, by inhibition of caspase-3 cleavage and activation of the protein kinase Akt/PKB. Heart disease is a major cause of morbidity and mortality among patients with diabetes. When heart failure is refractory to medical therapy and cannot be improved by electrical resynchronization, percutaneous angioplasty or coronary graft bypass surgery, heart transplantation remains a "last resort" therapy. Nevertheless, it is limited by the side effects of immunosuppressive drugs and chronic rejection. Localized expression of immunomodulatory genes in the donor organ can create a state of immune privilege within the graft, and was performed in rodent hearts by infecting cells with an adenovirus encoding indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), the rate-limiting enzyme in the catabolism of tryptophane. Other strategies are based on genetic manipulation of dendritic cells (DCs) with immunosuppressive genes and in vitro exposure of DCs to agents that prevent their maturation by inflammatory cytokines. Finally, we used 5-bromo-2'-deoxyuridine, which is incorporated into DNA and diluted with cell division, to identify long-term label retaining cells in the adult rodent heart. The majority of these cells were positive for the stem cell antigen-1 (Sca-1) and negative for the endothelial precursor marker CD31. They formed cardiospheres in vitro and showed differentiation potential into mesenchymal cell lineages. When cultured in cardiomyogenic differentiation medium, they expressed cardiac-specific genes. Taken together, these data provide evidence of slow-cycling stem cells in the rodent heart. Chronic shortage of donor organs opens the way to cardiac stem cell therapy in humans, although the long way from animal experimentation to routine therapy in patients may still take several years. - Du diabte de type 2 la maladie coronarienne : trois tudes sur les dysfonctions de la cellule scrtrice d'insuline induites par les dyslipidmies, l'immunomodulation dans la transplantation cardiaque, et la thrapie par des cellules souches myocardiques. Le diabte de type 2 a pris les dimensions d'une pidmie, avec des consquences sociales et conomiques dont nous n'avons pas encore pris toute la mesure. La maladie s'accompagne souvent d'une dyslipidmie caractrise par une hypertriglycridmie, des taux abaisss de cholestrol HDL, et des concentrations de cholestrol LDL la limite suprieure de ce qui est considr comme acceptable. L'hypothse la base de cette tude est qu'une modification des taux plasmatiques de lipoprotines pourrait avoir une influence directe sur la cellule β scrtrice d'insuline en modifiant sa fonction, sa dure de vie et son taux de rgnration. Dans un premier temps, nous avons mis en vidence, sur la cellule β, la prsence de plusieurs rcepteurs impliqus dans la captation des lipoprotines. Nous avons confirm la fonctionnalit de ces rcepteurs en suivant l'internalisation de LDL et de HDL marqus. En prsence de VLDL ou de LDL humains, nous avons observ une diminution de la transcription du gne de l'insuline, une prolifration cellulaire rduite, et une augmentation de l'apoptose, toutes fonctions de la dose et du temps d'exposition. L'apoptose induite par les VLDL passe par une activation de la caspase-3 et une rduction du taux de la protine IB1/JIP-1 (Islet Brain1/JNK Interacting Protein 1), dont une mutation est associe une forme monognique de diabte de type 2. Par opposition, les HDL, ainsi que des peptides inhibiteurs de JNK, sont capables de contrer la cascade pro-apoptotique dclenche, respectivement, par les LDL et les VLDL. Ces effets protecteurs comprennent l'inhibition du clivage de la caspase-3 et l'activation de la protine kinase Akt/PKB. En conclusion, les lipoprotines sont des lments cls de la survie de la cellule β, et pourraient contribuer au dysfonctionnement observ dans le pancras endocrine au cours du dveloppement du diabte. La maladie cardiaque, et plus particulirement la maladie coronarienne, est une cause majeure de morbidit et de mortalit chez les patients atteints de diabte. Plusieurs stratgies sont utilises quotidiennement pour pallier les atteintes cardiaques: traitements mdicamenteux, lectromcaniques par resynchronisation lectrique, ou communment appels interventionnels lorsqu'ils font appel l'angioplastie percutane. La revascularisation du myocarde par des pontages coronariens donne galement de trs bons rsultats dans certaines situations. Il existe toutefois des cas o plus aucune de ces approches n'est suffisante. La transplantation cardiaque est alors la thrapie de choix pour un nombre restreint de patients. La thrapie gnique, en permettant l'expression locale de gnes immunomodulateurs dans l'organe greff, permet de diminuer les ractions de rejet inhrentes toute transplantation ( l'exception de celles ralises entre deux jumeaux homozygotes). Nous avons appliqu chez des rongeurs cette stratgie en infectant le coeur greff avec un adnovirus codant pour l'enzyme indoleamine 2,3-dioxygnase (IDO), une enzyme cl dans le catabolisme du tryptophane. Nous avons procd de manire identique in vitro en surexprimant IDO dans les cellules dendritiques, dont le rle est de prsenter les antignes aux lymphocytes Τ du receveur. Des expriences similaires ont t ralises en traitant les cellules dendritiques avec des substances capables de prvenir, en partie du moins, leur maturation par des agents pro-inflammatoires. Finalement, nous avons explor une stratgie utilise couramment en hmatologie, mais qui n'en est encore qu' ses dbuts au niveau cardiaque : la thrapie par des cellules souches. En traitant des rongeurs avec un marqueur qui s'incorpore dans l'ADN nuclaire, le 5-bromo- 2'-deoxyuridine, nous avons identifi une population cellulaire se divisant rarement, positive en grande partie pour l'antigne embryonnaire Sca-1 et ngative pour le marqueur endothlial CD31. En culture, ces cellules forment des cardiosphres et sont capables de se diffrencier dans les principaux types tissulaires msenchymateux. Dans un milieu de differentiation adquat, ces cellules expriment des gnes cardiomyocytaires. En rsum, ces donnes confirment la prsence chez le rongeur d'une population rsidente de prcurseurs myocardiques. En addenda, on trouvera deux publications relatives la cellule β productrice d'insuline. Le premier article dmontre le rle essentiel jou par la complexine dans l'insulino-scrtion, tandis que le second souligne l'importance de la protine IB1/JIP-1 dans la protection contre l'apoptose de la cellule β induite par certaines cytokines.

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Abstract: Birds harbor a variety of bacteria on their plumage, some of which can degrade feathers in vitro. Whether these keratinolytic bacteria are active on live birds and can effect feather degradation on birds is debatable. The effect of such bacteria on the body condition and behavior of birds, is unknown. Using a community of feather-degrading bacteria (EB), we investigate the interaction between the activity and load of such bacteria, on the morphology, body condition, and behavior of zebra finches (Taeniopygia guttata). In Chapter 2, we find that the elevated loads of such microbes lead to a reduction in the expression of morphological traits, such as male bill color (a sexually selected trait) and uropygial gland volume, without reducing body mass, or evoking a cellular immune response. We also suggest the presence of a carotenoid based defense response in hosts, to such elevated loads of microbes and document a sex-based difference in the source of carotenoids used for such a response. In Chapter 3, we investigated the effect of EB loads on male mate choice of zebra finches, wherein male choice of females with elevated and un-altered bacterial loads, varied with male size. We found that larger males preferred females with higher bacterial load and smaller males preferred females with lower bacterial load. Chapter 4 demonstrates that the presence of melanin in feathers reduces the growth and activity of the community of feather-degrading bacteria (EB) and that the EB community can effect feather degradation in humid conditions, without broth. Additional results also demonstrate that the EB community consists of bacteria that can attach themselves to feathers on live birds and those that can live freely on avian plumage. Finally, chapter 5 demonstrates that the self-maintenance, social and sexual behaviors of birds are implicated in the infection and horizontal transmission of bacteria. It also suggests a linked oral - faecal - genital mode of transmission of pathogens in birds. These results demonstrate that differential loads of normal flora of vertebrate hosts can effect changes in their morphology and behavior. They also shed light on the role of feather-degrading bacteria in the evolution of melanin polymorphism in birds and suggest that bacteria can be active on live birds. This thesis also highlights the importance of social and, sexual behaviors of birds, in epidemiology. Rsum: Les Oiseaux ont dans leur plumage diverses bactries dont certaines dgradent les plumes in vitro, nanmoins. Il n'est pas clair, au vu de prcdentes tudes, si ces bactries kratinolytiques sont actives sur des oiseaux vivants, et si celles-ci dgradent effectivement le plumage de leur hte, L'effet de ces bactries sur la condition corporelle ainsi que le comportement des oiseaux n'est pas connu. A l'aide d'une communaut de bactries dgradant les plumes (EB), non pathognes, nous examinons les interactions entre l'activit et la charge bactrienne sur la morphologie, la condition corporelle et le comportement du diamant mandarins (Taeniopygia guttata). Dans le chapitre 2, nous montrons qu'une charge leve de ces microbes mne une rduction de l'expression de certains traits morphologiques, tels que la couleur du bec chez le mle (un trait soumis slection sexuelle), ainsi que le volume de la glande uropygienne, sans qu'il y ait une rduction de la masse corporelle, ni dclenchement d'une rponse immune cellulaire. Nos donnes suggrent la prsence d'une dfense chez l'hte des charges leves de bactries base sur la prsence de carotnodes. Nous montrons, de plus une diffrence lie au sexe dans la source des carotnodes utilis pour cette rponse. Dans le chapitre 3 nous examinons l'influence de la charge bactrienne EB sur le choix des mles chez le diamant mandarins. Des femelles avec une charge bactrienne normale et augmente sont choisies par les mles et ce choix varie avec la taille des mles. Nous avons mis en vidence que les grands mles prfrent les femelles avec une charge bactrienne plus leve. Les petits mles prfrent les femelles avec une charge bactrienne rduite. Le chapitre 4 dmontre que la prsence de mlanine dans les plumes rduit la croissance et l'activit de la communaut de bactries dgradant le plumage (EB), et que cette communaut EB peut dgrader les plumes dans des conditions humides, sans milieu de culture liquide. De plus nous montrons que cette communaut consiste en des bactries qui peuvent s'attacher sur les plumes d'oiseaux vivants ainsi que des bactries libres. Pour finir nous montrons dans le chapitre 5 que la maintenance corporelle, l'interaction sociale et le comportement sexuel de ces oiseaux sont impliqus dans l'infection et la transmission horizontale de ces bactries. Nos donnes suggrent une transmission orale-fcale-gnitale des pathognes chez les oiseaux. Ces rsultats montrent que des charges diffrentes de la flore bactrienne habituelle et non pathogne de vertbrs peuvent affecter leur morphologie et leur comportement. Ils claircissent galement le rle des bactries dgradant les plumes dans l'volution du polymorphisme mlanique chez les oiseaux et suggrent que ces bactries peuvent tre actives sur des oiseaux vivants. Cette thse souligne galement l'importance du comportement social et sexuel des oiseaux dans l'pidmiologie.

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Buts de la revue: Les Mdulloblastomes sont des tumeurs rares chez l'adulte. Le traitement habituel comprend une radiothrapie de tout l'axe cranio-spinal avec ou sans chimiothrapie. Beaucoup d'efforts sont actuellement entrepris pour mieux comprendre la biologie tumorale, afin de mieux stratifier les patients en diffrents groupes risques et de les traiter en fonction. Cette revue discute les nouveaux facteurs de risques cliniques et molculaires qui peuvent aider optimiser le traitement des patients adultes avec des mdulloblastomes. Dcouvertes rcentes: Jusqu' prsent les patients taient diviss en groupes bas risque ou haut risque sur la base de facteurs cliniques (ge, maladie rsiduelle aprs chirurgie, dissmination dans le systme nerveux central et l'histologie). Cette classification devrait tre complte par des facteurs pronostics molculaires. Le profilage de l'expression des gnes a permis d'identifier six sous-groupes molculaires de mdulloblastomes. Le WNT sous-groupe montre une activation des gnes de la voie de signalisation WNT/wingless avec des mutations frquentes du gne CNNTB1, une perte du chromosome 6 et une accumulation de β-catenine nuclaire. Ce sous-groupe est rencontr le plus souvent chez les enfants avec des mdulloblastomes avec une histologie classique. Ils ont un bon pronostic. Une activation de la voie de signalisation du sonic hedgehog montre des mutations frquentes des gnes PTCH et SUFU, une perte du 9q et une positivit pour GLI1 et SFRP1 et est rencontr plus frquemment chez les enfants de moins de 3 ans et chez les adultes. Ce sous-groupe est souvent associ une histologie de type desmoplastique. D'autre sous-groupes sont moins bien dlimits et prsentent des caractristiques qui se chevauchent. Cependant une amplification MYC/MYCN, un gain du 17p et une histologie de type grandes cellules/anaplasique sont des facteurs de mauvais pronostic. Rsum: Des nouveaux sous-groupes molculaires vont dornavant aider mieux adapter les traitements aux diffrents groupes de risque et permettront dvelopper de nouvelles thrapies cibles. Des tudes prospectives et si possibles randomises devraient tre effectues comprenant une stratification dans des sous-groupes molculaires, afin d'identifier au mieux le meilleur traitement pour chaque groupe risque.

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Staphylococcus aureus est un pathogne humain majeur ayant dvelopp des rsistances contre la quasi totalit des antibiotiques disponibles, incluant la trs importante famille des β- lactamines. La rsistance cette classe d'antibiotiques est confre par la Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), qui est un lment gntique mobile capable de s'insrer dans le chromosome bactrien et capable d'tre transfr horizontalement chez d'autres staphylocoques. Le mcanisme molculaire impliqu dans ce transfert horizontal demeure largement inconnu. L'une des premires tapes du transfert est l'excision du SCC mec du chromosome bactrien. Cette excision est promue par des enzymes codes par l'lment SCCmec lui- mme et appeles de ce fait Cassette Chromosome Recombinases (Ccr). L'un des buts de ce travail de thse a t de comprendre la rgulation de l'expression des gnes codant pour les Ccr recombinases. En utilisant des outils molculaires originaux, nous avons t en mesure de dmontrer en premier lieu que les Ccr recombinases taient exprimes de faon bistable , c'est dire qu'uniquement quelques pourcents de cellules dans une population exprimaient ces gnes un temps donn. Dans un deuxime temps, nous avons galement dmontr que l'expression de ces gnes tait rgule par des facteurs trangers au SCC mec. L'expression bistable des recombinases est un concept important. Effectivement, cela permet la majorit des cellules d'une population de conserver l'lment SCC mec, alors que seulement une petite fraction le perd afin de le rendre disponible pour un transfert. Ainsi, alors que l'lment SCC mec continue de se propager avec la multiplication des bactries Staphylococcus aureus rsistant la mticilline (SARM), il peut tre simultanment transmis des souches susceptibles (Staphylococcus aureus susceptible la mticilline, SASM), entranant l'apparition de nouveaux SARM. De faon trs intressante, le fait que cette bistabilit est contrle par les bactries, et non le SCCmec lui-mme, montre que la dcision de transfrer ou non la cassette SCC mec appartient la bactrie. En consquence, il doit exister dans la nature des souches qui sont plus ou moins aptes effectuer ce transfert. En nous appuyant sur ces observations, nous avons montr que l'excision du SCC mec tait effectivement rgule de faon trs troite au cours de la division cellulaire, et ne se passait que pendant un temps limit au dbut de la croissance. Ce rsultat est compatible avec une rgulation gntique commande par la densit cellulaire, qui pourrait tre dpendante de la production de signaux extracellulaires, du type que l'on rencontre dans le quorum sensing. Les signaux hypothtiques entranant l'excision du SCC mec restent inconnus l'heure actuelle. La connaissance de ces signaux pourrait se rvler trs importante afin de dvelopper des stratgies pour interfrer avec la dissmination de la rsistance au β-lactamines. Deux sujets additionnels ont t logiquement investigus au vu de ces premiers rsultats. Premirement, si certaines souches de SARM sont plus ou moins aptes dclencher l'excision du SCC mec, de mme certaines souches de SASM devraient tre plus ou moins aptes acqurir cet lment. Deuximement, afin d'tudier ces mcanismes de transfert au niveau pidmiologique, il nous a t ncessaire de dvelopper des outils nous permettant d'explorer le phnomne une plus large chelle. Concernant le premier point, il a t postul que certains SASM seraient rfractaires l'intgration gnomique d'un SCC mec en raison de polymorphismes particuliers proximit du site d'insertion chromosomique (attB). En tudiant plus de 40 isolais de S. aureus, provenant de porteurs sains, nous avons confirm ce polymorphisme dans l'environnement 'attB. De plus, nous avons pu montrer que ces rgions polymorphiques ont volu paralllement des groupes phylogntiques bien connus. Ainsi, si des telles rgions rfractaires l'intgration de SCC mec existent, celles-ci devraient sgrger dans des complexes clonaux bien dfinis qui devraient tre facilement identifiables au niveau pidmiologique. Concernant le second point, nous avons t capables de construire un systme rapporteur de l'excision du SCCmec, en utilisant un plasmide faible copie. Ce systme consistait en un promoteur fort et un gne codant pour une protine verte fluorescente (GFP) sous le contrle d'un promoteur fort spars l'aide d'un lment SCC artificiel portant trois terminateurs de transcription. Ainsi, la fluorescence ne s'exprime que si l'lment SCC est excis du plasmide. Ce systme a t test avec succs dans plusieurs types de staphylocoques, et est actuellement valu dans d'autres souches et conditions stimulant ou inhibant l'excision. De manire gnrale, cette dissertation reprsente parcours scientifique travers plusieurs aspects d'un problme de sant publique majeur en rapport avec la rsistance bactrienne aux antibiotiques. Ce travail s'attaque des problmes fondamentaux concernant le transfert horizontal de l'lment SCC mec. De plus, il s'intresse des aspects plus gnraux de cet lment gntique mobile qui pourraient se rvler trs importants en terme de mouvement de gnes au sein des staphylocoques, voir d'autres bactries gram-positives. Finalement ce travail de thse met en place le fondamentaux requis pour des recherches futures visant interfrer avec le transfert horizontal de la rsistance aux β-lactamines. - Staphylococcus aureus is a major human pathogen. Moreover, S. aureus have developed resistance to almost all available antibiotics, including the important family of β-lactam molecules. Intrinsic resistance to β-lactams is conferred by the Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), which is a mobile genomic island that inserts into the staphylococcal chromosome and can be horizontally transferred into other staphylococci. However, little is known about the molecular mechanisms involved in this horizontal transfer into nave strains. One of the first steps in SCC mec horizontal transfer is its excision from the chromosome. Excision is mediated by recombinase enzymes that are encoded by SCC mec itself, and named accordingly Ccr recombinases - for Cassette Chromosome recombinases. One goal of this thesis was to understand the regulation these recombinase genes. By using original molecular tools we could demonstrate first that the Ccr recombinases were expressed in a "bistable" manner, i.e. in only few percentages of the bacterial cells at a given time, and second that they were regulated by determinants that were not encoded on the SCC mec element, but elsewhere on the staphylococcal genome. "Bistable" expression Ccr recombinases is an important concept. It allows SCC mec to be excised and thus available for horizontal transfer, while ensuring that only some cells, but not the whole population, loose their valuable SCC mec genes. Thus, while the SCC mec element expands with the multiplication of the MRSA colony, it can simultaneously be transmitted into methicillin-susceptible S. aureus (MSSA), which convert into new MRSA. Most interestingly, the fact that bistability was regulated by the cells, rather than by SCC mec, indicates that it was the choice of the bacteria to trigger or not SCC mec transfer. As a consequence, there must be, in nature, staphylococcal strains that are more or less prone to sustain SCC mec transfer. Following these seminal observations we found that excision was indeed tightly regulated during bacterial division, and occurred only during a limited period of time at the beginning of bacterial growth. This is compatible with cell-density mediated gene regulation, and may depend on the production of extracellular signal molecules that transmit appropriate orders to neighboring cells, such as in quorum sensing. The potential signal triggering SCCmec excision is as yet unknown. However, it could be critical in promoting the horizontal transfer of methicillin resistance, or for the possible development of means to interfere with it. Two additional hypothesis were logically investigated in the view of these first results. First, if some strains of MRSA might be more prone than others to promote SCC mec excision, then some strains of MS SA might be more or less prone to acquire the element as well. Second, to investigate these multiple mechanisms at an epidemiological level, one would need to develop tools amenable to explore S. aureus strains at a larger scale. Regarding the first issue, it was postulated by others that some MSSA might be refractory to SCC mec integration because they had peculiar DNA polymorphisms in the vicinity of the site-specific chromosomal entry point {attB) of SCC mec. By studying >40 S. aureus isolates from healthy carriers, we confirmed the polymorphism of the attB environment. Moreover, we could show that these polymorphic regions co-evolved with well-known phylogenic clonal clusters. Therefore, if SCCwec-refractory attB environments exist, then they would segregate in well- defined S. aureus clonal clusters that would be easy to identify at the epidemiological level. Regarding the second issue, we were able to construct a new excision reporter system in a low copy number S. aureus plasmid. The reporter system consists in a strong promoter driving a green fluorescent protein {gfp) gene, separated by an artificial SCC-like element carrying three transcriptional terminators. Thus, fluorescence is not expressed unless the SCC-like element is excised. The system has been successfully tested in several aureus and non- aureus staphylococci, and is now being applied to more strains and various excision- triggering or inhibiting conditions. Altogether the dissertation is a scientific journey through various aspects of a salient medical problem with regard to antibiotic resistance and public health threat. The research work tackles fundamental issues about the mechanisms of horizontal transfer of the SCC mec element. Moreover, it also addresses more general features of this mobile element, which could be of larger importance with regard to gene trafficking in staphylococci, and maybe other gram-positive bacteria. Finally, the dissertation sets the fundamentals for future work and possible new ways to interfere with the horizontal transfer of methicillin resistance.

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Introduction : Les particules de HDL (High Density Lipoprotein) ont des fonctions diverses notamment en raison de leur structure trs htrogne. Tout d'abord, les HDLs assurent le transport du cholestrol de la priphrie vers le foie mais sont galement dotes de nombreuses vertus protectrices. Un grand nombre d'tudes dmontre les mcanismes de protection des HDL sur les cellules endothliales. Sachant que les patients diabtiques ont ses niveaux bas de HDL, le but de cette tude est d'investiguer les mcanismes molculaires de protection sur la cellule beta pancratique. Rsultats : Une tude microarray nous a permis d'obtenir une liste de gnes rguls par le stress, comme la privation de srum, en prsence ou en absence de HDL. Parmi ces gnes, nous nous sommes particulirement intresss un rpresseur de la synthse protique cap -dpendante, 4EBP1. Dans notre tude transcriptomique, les niveaux d'ARNm de 4E-BP1 augmentaient de 30% dans des conditions sans srum alors que les HDLs bloquaient cette lvation. Au niveau protique, les niveaux totaux de 4EBP1 taient augments dans les conditions de stress et cette lvation tait contre par les HDLs. D'autres expriences de transfection ou d'infection de 4E-BP1 ont montrs que cette protine tait capable d'induire l'apoptose dans les cellules beta, imitant ainsi l'effet de la privation de srum. Afin de dterminer le rle direct de 4E-BP1 dans la mort cellulaire, ses niveaux ont t rduits par interfrence ARN. Le niveau de mort cellulaire induit par l'absence de srum tait moins lev dans des cellules taux rduits de 4EBP1 par RNAi que dans des cellules contrle. Conclusion : Ces donnes montrent que les HDL protgent les cellules beta suite diffrents stress et que 4E-BP1 est une des protines pro-apoptotiques inhibes par les HDL. 4E-BP1 est capable d'induire la mort cellulaire dans les cellules bta et cette rponse peut-tre rduite en diminuant l'expression de cette protine. Nos donnes suggrent que 4E-BP1 est une cible potentielle pour le traitement du diabte.

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RSUML'hypertrophie cardiaque reprsente un mcanisme d'adaptation du myocarde en rponse diffrents stress. Sur le long terme, l'hypertrophie cardiaque peut voluer vers l'insuffisance cardiaque, l'une des principales causes de morbidit et de mortalit dans les pays industrialiss, pour cette raison, la communaut scientifique est trs intresse lucider les voies de signalisation qui rgulent ce phnomne pathologique dans le coeur.Notre laboratoire a montr que AKAP-Lbc, une protine d'ancrage de la protine kinase A (AKAPs), est principalement exprime dans le coeur et peut rguler des processus importants tels que l'hypertrophie des cardiomyocytes.AKAP-Lbc fonctionne comme un facteur d'change de nuclotides guanine (GEF) pour la petite Rho-GTPase RhoA. Cette fonction est active par diffrents rcepteurs qui activent son domaine Rho-GEF. Des tudes rcentes ont dmontr que AKAP-Lbc est implique dans la rponse hypertrophique des cardiomyocytes suite l'activation des rcepteurs α1-adrnergiques. Le but gnral de ce travail de thse est la caractrisation de la voie de signalisation hypertrophique active par AKAP-Lbc dans les cardiomyocytes.Mes travaux montrent que AKAP-Lbc organise un complexe macromolculaire, comprenant les protines kinases PKN, MLTK, MKK3 et p38 et active la protine kinase p38 en rponse l'activation des rcepteurs α1-adrnergiques.Nos rsultats indiquent que cette voie de signalisation au cours de la rponse hypertrophique active le facteur de transcription GATA4 et la protine Hsp27.GATA4 est un important facteur de transcription qui rgule la transcription de plusieurs gnes au cours de la rponse hypertrophique, alors que Hsp27 est une protine chaperonne qui interagit avec le cytosquelette des cardiomyocytes et les protge contre le stress hypertrophique.Pris ensembles, ces tudes contribuent comprendre comment le complexe de signalisation form par AKAP-Lbc rgule l'hypertrophie dans les cardiomyocytes. Au-del de leur intrt au niveau biochimique, ces travaux pourraient aussi contribuer la comprhension du phnomne de l'hypertrophie dans le coeur.

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Endothelial cells form a semi-permeable barrier that participates in the exchange of plasma fluids, proteins and cells, and helps to maintain the physiological functions of organs as well as circulatory homeostasis. Vascular permeability and vasodilatation are increased during acute and chronic inflammation, cancer and wound healing. This is mediated by exposure to certain vascular permeability increasing factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF). The peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) belong to the nuclear hormone receptor (NHRs) family of ligand-activated transcription factors. Three isotypes, PPARa, PPARp/5 and PPARy have been identified. They are all expressed in endothelial cells (ECs). Recent data have demonstrated their involvement in important mechanisms for vasculogenesis and angiogenesis, such as cell proliferation/differentiation, directional sensing/migration, and survival. PPARs were reported to modulate the expression of pro-angiogenic soluble factors, such as VEGF-A and may also participate in the regulation of expression of VEGF receptors. The aim of the present work was to elucidate the role of PPARp/δ in endothelial cell functions important for angiogenesis as well as in vascular permeability and vasodilatation. Using organ culture models of mouse aorta expiants, cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and genetically modified mouse models, we studied the consequences of loss and gain of PPARp/5 activity on endothelial cell functions. In the first part of this study, we show that the activation of PPARp/δ promotes EC outgrowth in murine aorta expiants. In vivo we observed that dermal vessel acute permeability in response to VEGF-A stimulation is strongly impaired in PPARfi/δ -I- animals. Additionally, observation of the dermal vessel morphology showed a clear enlargement of the wild-type dermal vessels upon VEGF-A injection, whereas vessels of PPARp/5 -/- animals showed almost no enlargement. The impaired response to VEGF stimulation in the knock-out animals was not due to structural or morphological abnormalities. Based on this data, we suggest that PPARp/5 may act on intracellular signaling cascades in ECs, downstream of the VEGF-A receptor. In the second part of this study, we address the relevance of PPARβ/δ vascular functions in pathophysiological inflammatory conditions, such as delayed- type hypersensitivity (DTH) reaction and anaphylaxis in mice. The DTH reaction is a cell-mediated immune reaction to protein, bacterial and viral antigens, whereas anaphylaxis is the most severe form of allergic reaction. In these in vivo models, we demonstrated that the absence of PPARβ/δ in ECs prevents the formation of severe edema in the DTH reaction, and that Ρ PARβ/δ accelerates recovery following systemic anaphylaxis, at least partially through the control of vascular permeability. Our data not only describe a novel function of PPARβ/δ in vessel permeability and vasodilatation, but also open new routes of research for the development of vessel permeability/vasodilatation regulating agents. - Les cellules endothliales qui bordent la face interne des vaisseaux sanguins forment l'endothlium, une barrire semi-permable qui rgule les changes de fluides, de protines et de cellules immunes entre la circulation et les organes. L'endothlium participe galement au maintien de la fonction des organes et de l'homostasie circulatoire. La permabilit vasculaire augmente dans des situations inflammatoires aigties ou chroniques, dans les tumeurs, et pendant la rparation de blessures. Cette augmentation de permabilit est due la production de facteurs scrts, tels que le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A), la thrombine ou I'histamine. Ls rcepteurs nuclaires Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR) sont des facteurs de transcription mis en activit par des ligands. Trois isotypes de PPARs, PPARa, ΡΡΑΡβ/δ and PPARy ont t caractriss. Ils sont exprims dans les cellules endothliales, et des travaux rcents ont montr qu'ils rgulent des comportements cellulaires importants pour la vasculogense et l'angiogense, tels que la prolifration, la diffrenciation, la migration, et la survie des cellules. Ils rgulent galement la production de VEGF-A par divers types cellulaires. Le but de ce travail tait d'lucider le rle de PPARβ/δ dans la rgulation de la permabilit vasculaire, plus particulirement dans les cellules endothliales. Grce des cultures d'expiants d'aortes de souris, la culture d'une ligne endothliale humaine (HUVECs) et de souris gntiquement modifies, nous avons tudi le rle de PPARβ/δ dans les cellules endothliales, dans des situations gain et perte de fonction du rcepteur. Dans la premire partie de ce travail, nous avons montr les proprits pro-angiogniques de PPARβ/δ dans des explants d'aortes. In vivo, nous avons observ l'absence d'hyperpermabilit aigu induite par le VEGF-A, la thrombine et I'histamine chez les souris PPARβ/δ -/-. De plus, l'analyse morphologique des vaisseaux dans le derme des souris aprs stimulation par VEGF- A a confirm l'absence de rponse la stimulation. Ces analyses morphologiques nous ont galement permis de montrer que l'absence de rponse aigu n'tait pas due un dfaut de structure des vaisseaux dermiques chez les souris PPARp/δ -/-. Sur la base de ces rsultats, nous proposons que PPARp/δ rgule des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules endothliales, voie de signalisation impliques dans la rgulation de la permabilit vasculaire: Dans la seconde partie du travail, nous avons tudi l'importance de la rgulation de la permabilit vasculaire par PPARβ/δ dans des situations pathophysiologiques impliquant une hyperpermabilit aigu des vaisseaux : une raction d'hypersensibilit cutane retarde d'une part (delayed-type hypersensitivity, DTH), et un choc anaphylactique d'autre part. Dans ces deux modles induits exprimentalement chez la souris, l'absence de PPARβ/δ prvient en partie la formation de l'oedme inflammatoire local (DTH), et acclre la rcupration (anaphylaxie), au moins partiellement en rglant la permabilit vasculaire. Ces rsultats ouvrent un nouveau champs d'tude quant au rle de PPARβ/δ dans les vaisseaux et d'ventuelles applications thrapeutiques dans des pathologies inflammatoires.

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Abstract : Breast cancer incidence rates have increased over the past hundred years, in particular, in Western industrial countries and they continue to rise worldwide. Breast cancer risk has been linked to life exposure to endogenous and exogenous estrogens, and there is increasing concern that exposure to endocrine disruptors which are increasingly accumulating in our environment may also have a role. Using the mouse as model, I have analyzed the physiological role of estrogen signaling in mammary gland development. I have shown that estrogen signaling through the estrogen receptor alpha (ERα) in the mammary epithelium is required for ductal morphogenesis during puberty. Moreover, I have demonstrated that estrogens induce proliferation of mammary epithelial cells through a paracrine mechanism. The presence of estrogen signaling is essential cell intrinsically via ERα or ERβ for the terminal differentiation into milk secreting cells during pregnancy. Furthermore, I have examined how perinatal exposure to the estrogenic plasticizer bisphenol A (BPA) found ubiquitously in consumer goods such as baby bottles formula and beverage containers affects the normal mammary gland development and possibly predispose the mammary gland to tumorigenesis. I have found that C57b16 mice that were exposed, via their drinking water, to several BPA doses ranging from 0.025g/kg/day to 250g/kg/day exhibits delayed terminal end bud formation and consequently the ductal outgrowth. Later in life, the mice that were exposed in utero to BPA displayed an increased number of mammary epithelial cells. Acute exposure of 3-week-old mice to BPA can alter gene expression levels of an important estrogen target gene, amphiregulin. Taken together these data are compatible with a scenario in which perinatal BPA exposure may alter mammary gland development by affecting developmental signaling pathways. Rsum : Les taux d'incidence des cancers du sein ont augment au cours des cent dernires annes en particulier dans les pays industriels occidentaux et ils continuent d'augmenter dans le monde entier. Le risque du cancer du sein a t corrl l'exposition au cours de la vie aux oestrognes endognes et exognes. Il y a une proccupation croissante concernant l'exposition aux perturbateurs endocriniens qui ne cessent de s'accumulent dans notre environnement et qui peuvent galement avoir un rle dans l'augmentation des cancers du sein. En utilisant le modle de souris, j'ai analys le rle physiologique de la voie de signalisation l'oestrogne dans le dveloppement mammaire. J'ai prouv que l'oestrogne par l'intermdiaire de son rcepteur alpha (ERα) est indispensable dans l'pithlium pour la morphognse du systme canalaire pendant la pubert. De plus, j'ai dmontr que les oestrognes induisent la prolifration des cellules pithliales mammaires par un mcanisme paracrine. La prsence de la voie de signalisation l'oestrogne est essentielle de manire intrinsque la cellule par l'intermdiaire d'ERα ou ERβ pour la diffrentiation terminale des cellules pithliales en cellules scrtrices de lait pendant la grossesse. En outre, j'ai examin comment l'exposition prinatale au bisphnol A (BPA), un plastifiant prsentant des proprits ostrogniques et omniprsent dans divers produits d'usage courant tels que les biberons des bbs et les rcipients en plastique, affecte le dveloppement de la glande mammaire et prdispose probablement celle-ci la tumorignse. J'ai constat que l'exposition prinatale BPA retarde la formation des bourgeons terminaux et par consquent la croissance du systme canalaire. Plus tard dans la vie, les souris qui ont t exposes dans l'utrus au BPA ont montr un plus grand nombre de cellules pithliales mammaires. L'exposition aigu de souris ges de 3 semaines au BPA perturbe le niveau d'expression d'un gne cible important de l'oestrogne, l'amphiregulin. Ces donnes sont compatibles avec un scnario dans lequel l'exposition prinatale au BPA peut changer le dveloppement de la glande mammaire en affectant des voies de signalisation dveloppementales.

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1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RSUM Le rle de la rponse immunitaire inne a longtemps t nglig quant l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une rponse immune adaptative efficace dirige contre un pathogne. Si l'importance des rcepteurs Toll-like (TLR) du systme inn dans la reconnaissance des virus et bactries a t dmontre, son rle dans la dfense contre les pathognes eucaryotes reste encore trs lusif. Rcemment, il a t montr que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la rponse immunitaire inne et adaptative aprs une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont rsistantes l'infection et dveloppent une rponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et dveloppent une rponse Th2 induite par IL-4. La diffrentiation Th1/Th2 est un vnement qui prend place de manire dfinitive lors de la premire semaine aprs infection. Les vnements prcoces promouvant le dveloppement d'une rponse Th1 ou Th2 n'tant pas connus, l'objectif de ce travail a t de dmontrer un rle des TLRs dans l'initiation d'une rponse immune inne et adaptative suite l'infection par L. major. Nous avons dmontr que MyD88, une molcule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est ncessaire pour que les souris rsistantes C57BL/6 dveloppent une rponse Th1 protectrice. L'importance du rle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant t dmontre, nous avons privilgi l'analyse de la rponse immunitaire suite une infection in vivo de souris dficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond gntique rsistant. Les rsultats obtenus montrent que la prsence de ces rcepteurs n'est pas indispensable pour le contrle de l'infection et la polarisation d'une rponse Th1 caractristique de la rsistance L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dpendante. L'expression de l'ARNm des diffrents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et rsistantes pendant la premire semaine d'infection a t dtermine par PCR quantitative en temps rel. Les rsultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 tait rgul positivement suite l'infection par L. major chez les souris rsistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'tait dtectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rle des rcepteurs TLR7 et TLR9 a donc t valu par l'infection par L. major des souris dficientes en TLR7 et TLR9 sur fond gntique C57BL/6. Nos rsultats ont clairement dmontr que les souris dficientes en TLR7 montrent une rponse immunitaire identique celle des souris rsistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au dveloppement d'une Th1 ainsi qu'au contrle de la parasitmie. Paz contre, les souris dficientes en TLR9 sur un fond gntique rsistant ont montr une grande variabilit dans la rponse l'infection. En effet, la moiti des souris deviennent sensibles l'infection, ceci tant associ une diminution dans la production d'IFN-γ et une augmentation de la production d'IL-4. Ces rsultats suggrent que TLR9 est impliqu dans le contrle de la lsion et de la rponse immunitaire suite l'infection avec L. major. Cependant les rsultats avec les souris dficientes en TLR9 montrant une grande htrognit et une balance Th1/Th2 instable, nous avons mis l'hypothse que les cellules T rgulatrices pouvaient tre impliques dans ce phnomne. Nous avons effectivement constat qu'aprs dpltion des cellules CD4+CD25+, les souris dficientes en TLR9 dveloppent des lsions aussi grandes que les souris BALB/c aprs infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le mme que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrment bas. Les mcanismes rgulateurs impliqus dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en vidence l'importance du TLR9 dans le dveloppement d'une rponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus ncessaire pour la rsistance l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire rpandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutane et de 1 1,5 million de nouveaux cas par anne. Plus de 12 millions de personnes sont affectes par la maladie et 350 millions de personnes sont une population risque. Un modle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a t tabli qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observs dans le cas de la leishmaniose cutane chez l'homme. L'analyse de la rponse immunitaire dans les souris infectes par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont rsistantes l'infection et dveloppent une rponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et dveloppent une rponse de type Th2. La rponse immune adaptative dans le modle d'infection avec L. major t largement tudie. Cependant, les vnements prcoces dterminants pour le dveloppement d'une rponse Th1 ou Th2 restent encore trs flous. Rcemment, plusieurs publications ont montr que les rcepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer l'initiation de la rponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thse, nous avons tudi le rle de MyD88, une molcule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la rponse immune suite une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement rsistantes l'infection avec L. major deviennent sensibles et dveloppent des lsions importantes. Ces souris ne sont plus capables de dvelopper une rponse Thl, normalement caractristique de leur phnotype rsistant. Nous avons ensuite tent de comprendre quels TLRs, plus prcisment, pouvait tre impliqu dans ce processus. Malgr quelques vidences dmontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rle important dans l'initiation d'une rponse immunitaire adaptative Leishmania, nous avons montr que, in vivo aprs infection avec L. major, la dficience d'un de ces rcepteurs n'tait pas suffisante faire basculer la rponse immunitaire. Les souris C57BL/6 dficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrler l'volution de la maladie. De plus, ces souris, malgr l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite rponse Thl. Etant donn que TLR2 et TLR4 n'taient pas essentiels pour la rsistance la maladie, nous avons analys les TLRs, parmi les 12 dcrits qui pouvaient tre indispensables au dveloppement d'une rponse de type Th1 associe la rsistance l'infection par Leishmania. Nos expriences ont montr que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 tait module suite l'infection par L. major chez la souris rsistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'tait visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rle dans la rponse immunitaire au parasite, nous avons tudi l'volution de l'infection dans les souris dficientes en TLR7 et TLR9. Nos rsultats ont clairement dmontr que TLR7 n'tait pas indispensable la rsistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des consquences radicales sur le contrle de la lsion et de la rponse immunitaire suite l'infection avec L. major. Ce travail rvle ainsi l'importance du TLR9 dans le dveloppement d'une rponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus ncessaire pour la rsistance l'infection. Il est a not que nos rsultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activit adjuvante importante dans la prparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure comprhension des mcanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le dveloppement de vaccins thrapeutiques efficaces.