Ankylosing spondylitis: genomic and functional characterization of candidate genes and their repercussion in clinical practice

RESUMO: Introdução: A espondilite anquilosante (EA) é uma doença inflamatória crónica caracterizada pela inflamação das articulações sacroilíacas e da coluna. A anquilose progressiva motiva uma deterioração gradual da função física e da qualidade de vida. O diagnóstico e o tratamento precoces podem contribuir para um melhor prognóstico. Neste contexto, a identificação de biomarcadores, assume-se como sendo muito útil para a prática clínica e representa hoje um grande desafio para a comunidade científica. Objetivos: Este estudo teve como objetivos: 1 - caracterizar a EA em Portugal; 2 - investigar possíveis associações entre genes, MHC e não-MHC, com a suscetibilidade e as características fenotípicas da EA; 3 - identificar genes candidatos associados a EA através da tecnologia de microarray. Material e Métodos: Foram recrutados doentes com EA, de acordo com os critérios modificados de Nova Iorque, nas consultas de Reumatologia dos diferentes hospitais participantes. Colecionaram-se dados demográficos, clínicos e radiológicos e colhidas amostras de sangue periférico. Selecionaram-se de forma aleatória, doentes HLA-B27 positivos, os quais foram tipados em termos de HLA classe I e II por PCR-rSSOP. Os haplótipos HLA estendidos foram estimados pelo algoritmo Expectation Maximization com recurso ao software Arlequin v3.11. As variantes alélicas dos genes IL23R, ERAP1 e ANKH foram estudadas através de ensaios de discriminação alélica TaqMan. A análise de associação foi realizada utilizando testes da Cochrane-Armitage e de regressão linear, tal como implementado pelo PLINK, para variáveis qualitativas e quantitativas, respetivamente. O estudo de expressão génica foi realizado por Illumina HT-12 Whole-Genome Expression BeadChips. Os genes candidatos foram validados usando qPCR-based TaqMan Low Density Arrays (TLDAs). Resultados: Foram incluídos 369 doentes (62,3% do sexo masculino, com idade média de 45,4 ± 13,2 anos, duração média da doença de 11,4 ± 10,5 anos). No momento da avaliação, 49,9% tinham doença axial, 2,4% periférica, 40,9% mista e 7,1% entesopática. A uveíte anterior aguda (33,6%) foi a manifestação extra-articular mais comum. Foram positivos para o HLA-B27, 80,3% dos doentes. Os haplótipo A*02/B*27/Cw*02/DRB1*01/DQB1*05 parece conferir suscetibilidade para a EA, e o A*02/B*27/Cw*01/DRB1*08/DQB1*04 parece conferir proteção em termos de atividade, repercussão funcional e radiológica da doença. Três variantes (2 para IL23R e 1 para ERAP1) mostraram significativa associação com a doença, confirmando a associação destes genes com a EA na população Portuguesa. O mesmo não se verificou com as variantes estudadas do ANKH. Não se verificou associação entre as variantes génicas não-MHC e as manifestações clínicas da EA. Foi identificado um perfil de expressão génica para a EA, tendo sido validados catorze genes - alguns têm um papel bem documentado em termos de inflamação, outros no metabolismo da cartilagem e do osso. Conclusões: Foi estabelecido um perfil demográfico e clínico dos doentes com EA em Portugal. A identificação de variantes génicas e de um perfil de expressão contribuem para uma melhor compreensão da sua fisiopatologia e podem ser úteis para estabelecer modelos com relevância em termos de diagnóstico, prognóstico e orientação terapêutica dos doentes. -----------ABSTRACT: Background: Ankylosing Spondylitis (AS) is a chronic inflammatory disorder characterized by inflammation in the spine and sacroiliac joints leading to progressive joint ankylosis and in progressive deterioration of physical function and quality of life. An early diagnosis and early therapy may contribute to a better prognosis. The identification of biomarkers would be helpful and represents a great challenge for the scientific community. Objectives: The present study had the following aims: 1- to characterize the pattern of AS in Portuguese patients; 2- to investigate MHC and non-MHC gene associations with susceptibility and phenotypic features of AS and; 3- to identify candidate genes associated with AS by means of whole-genome microarray. Material and Methods: AS was defined in accordance to the modified New York criteria and AS cases were recruited from hospital outcares patient clinics. Demographic and clinical data were recorded and blood samples collected. A random group of HLA-B27 positive patients and controls were selected and typed for HLA class I and II by PCR-rSSOP. The extended HLA haplotypes were estimated by Expectation Maximization Algorithm using Arlequin v3.11 software. Genotyping of IL23R, ERAP1 and ANKH allelic variants was carried out with TaqMan allelic discrimination assays. Association analysis was performed using the Cochrane-Armitage and linear regression tests as implemented in PLINK, for dichotomous and quantitative variables, respectively. Gene expression profile was carried out using Illumina HT-12 Whole-Genome Expression BeadChips and candidate genes were validated using qPCR-based TaqMan Low Density Arrays (TLDAs). Results: A total of 369 patients (62.3% male; mean age 45.4±13.2 years; mean disease duration 11.4±10.5 years), were included. Regarding clinical disease pattern, at the time of assessment, 49.9% had axial disease, 2.4% peripheral disease, 40.9% mixed disease and 7.1% isolated enthesopathic disease. Acute anterior uveitis (33.6%) was the most common extra-articular manifestation. 80.3% of AS patients were HLA-B27 positive. The haplotype A*02/B*27/Cw*02/DRB1*01/DQB1*05 seems to confer susceptibility to AS, whereas A*02/B*27/Cw*01/DRB1*08/DQB1*04 seems to provide protection in terms of disease activity, functional and radiological repercussion. Three markers (two for IL23R and one for ERAP1) showed significant single-locus disease associations. Association of these genes with AS in the Portuguese population was confirmed, whereas ANKH markers studied did not show an association with AS. No association was seen between non-MHC genes and clinical manifestations of AS. A gene expression signature for AS was established; among the fourteen validated genes, a number of them have a well-documented inflammatory role or in modulation of cartilage and bone metabolism. Conclusions: A demographic and clinical profile of patients with AS in Portugal was established. Identification of genetic variants of target genes as well as gene expression signatures could provide a better understanding of AS pathophysiology and could be useful to establish models with relevance in terms of susceptibility, prognosis, and potential therapeutic guidance.

Resistência do betão à compressão em cubos VS cilindros

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil- Perfil de Estruturas

Resistência aos Antibióticos em Neisseria Gonorrhoeae - Passado, Presente e Futuro

Introdução: A resistência aos antibióticos em Neisseria gonorrhoeae tem-se revelado um importante problema de saúde pública mundial, estando a levantar grandes dificuldades em termos de opções terapêuticas em alguns países. Objectivo: Rever o panorama (nacional e internacional) da resistência aos antibióticos em Neisseria gonorrhoeae. Material e Métodos: Pesquisa de artigos em revistas nacionais e internacionais (estas últimas com indexação na Pubmed/Medline e redigidas em inglês). Utilizaram-se como palavras chave: “Neisseria gonorrhoeae antibiotic resistance”. Resultados: As cefalosporinas de terceira geração (ceftriaxone e cefixima), associadas ou não à azitromicina, substituíram as fluoroquinolonas como fármacos de primeira linha no tratamento da gonorreia. Os relatos de resistência às cefalosporinas são ainda relativamente escassos; contudo, o aumento da concentração inibitória mínima (CIM), traduzido pela diminuição da sensibilidade a esta classe de antibióticos, tem vindo a ser regularmente descrita. Por outro lado, a resistência à azitromicina foi relatada em vários países. Em Portugal, já foram reportados casos de Neisseria gonorrhoeae resistentes à azitromicina mas não às cefalosporinas. Porém, estirpes com diminuição da sensibilidade às cefalosporinas foram já detetadas. Conclusão: Novas alternativas terapêuticas são indispensáveis para o tratamento das infeções por Neisseria gonorrhoeae, bem como condutas adequadas por parte dos médicos e dos doentes e seus contactantes.

New mechanisms that regulate the expression of genes implicated in the process of ketogenesis

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Estudo da resistência estrutural remanescente de painéis reforçados sujeitos à encurvadura

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.

DETECTION OF VIRULENCE GENES IN ENVIRONMENTAL STRAINS OF Vibrio cholerae FROM ESTUARIES IN NORTHEASTERN BRAZIL

The objectives of this study were to detect the presence of Vibrio cholerae in tropical estuaries (Northeastern Brazil) and to search for virulence factors in the environmental isolates. Water and sediment samples were inoculated onto a vibrio-selective medium (TCBS), and colonies with morphological resemblance to V. cholerae were isolated. The cultures were identified phenotypically using a dichotomous key based on biochemical characteristics. The total DNA extracted was amplified by PCR to detect ompW and by multiplex PCR to detect the virulence genes ctx, tcp, zot and rfbO1. The results of the phenotypic and genotypic identification were compared. Nine strains of V. cholerae were identified phenotypically, five of which were confirmed by detection of the species-specific gene ompW. The dichotomous key was efficient at differentiating environmental strains of V. cholerae. Strains of V. cholerae were found in all four estuaries, but none possessed virulence genes.

Estudo da Resistência Mecânica do Betão com Agregado Cerâmico Vermelho

Os sectores da construção e demolição de edifícios são responsáveis por um elevado volume de produção de resíduos. Estes resíduos são normalmente direcionados para aterros, que se encontram, neste momento, sobrelotados. Esta falta de capacidade de receção de resíduos tem como consequência imediata o aumento dos valores monetários associados ao depósito destes materiais excedentários. Com a elevada produção destes resíduos torna-se importante a sua reciclagem e reutilização. No caso da Engenharia Civil, uma grande produtora de resíduos, seria ainda mais interessante o seu reaproveitamento imediato na área. Nesta investigação, pretendeu-se avaliar o desempenho mecânico de betões com diferentes percentagens de agregados cerâmicos vermelhos. Essa investigação passou numa fase inicial pelo estado fresco do betão, de forma a analisar a sua trabalhabilidade. Na fase seguinte, analisou-se no estado endurecido, a resistência à compressão e resistência à tração por compressão diametral. Para concretização deste objetivo produziram-se três tipos de betões: um de referência (areia fina e brita fina), um betão com incorporação de agregados finos e grossos de cerâmica vermelha, juntamente com a areia fina e a brita fina, e o terceiro, um betão com a substituição total da areia fina por cerâmica fina. A realização desta investigação, demostrou que os betões com a incorporação de agregado cerâmico vermelho apresentam resultados de boa qualidade, sendo plausível a sua utilização em estruturas.

Estudo da resistência e mecanismos de dano em juntas adesivas entre materiais compósitos com defeitos de adesão

A necessidade de utilizar métodos de ligação entre componentes de forma mais rápida, eficaz e com melhores resultados tem causado a crescente utilização das juntas adesivas, em detrimento dos métodos tradicionais de ligação. A utilização das juntas adesivas tem vindo a aumentar em diversas aplicações industriais por estas apresentarem vantagens, das quais se destacam a redução de peso, redução de concentrações de tensões e facilidade de fabrico. No entanto, uma das limitações das juntas adesivas é a dificuldade em prever a resistência da junta após fabrico e durante a sua vida útil devido à presença de defeitos no adesivo. Os defeitos são normalmente gerados pela preparação inadequada das juntas ou degradação do adesivo devido ao ambiente (por exemplo, humidade), reduzindo a qualidade da ligação e influenciando a resistência da junta. Neste trabalho é apresentado um estudo experimental e numérico de juntas de sobreposição simples (JSS) com a inclusão de defeitos centrados na camada de adesivo para comprimentos de sobreposição (LO) diferentes. Os adesivos utilizados foram o Araldite® AV138, apresentado como sendo frágil, e o adesivo Sikaforce® 7752, intitulado como adesivo dúctil. A parte experimental consistiu no ensaio à tração das diferentes JSS permitindo a obtenção das curvas força-deslocamento (P-δ). A análise numérica por modelos de dano coesivo (MDC) foi realizada para analisar as tensões de arrancamento ((σy) e as tensões de corte (τxy) na camada adesiva, para estudar a variável de dano do MDC durante o processo de rotura e para avaliar a capacidade dos MDC na previsão da resistência da junta. Constatou-se um efeito significativo dos defeitos de diferentes dimensões na resistência das juntas, que também depende do tipo de adesivo utilizado e do valor de LO. Os modelos numéricos permitiram a descrição detalhada do comportamento das juntas e previsão de resistência, embora para o adesivo dúctil a utilização de uma lei coesiva triangular tenha provocado alguma discrepância relativamente aos resultados experimentais.

Estudo numérico da adequação de diferentes tipos de leis coesivas na previsão da resistência de juntas adesivas por Modelos de Dano Coesivo

O uso de ligações adesivas aumentou significativamente nos últimos anos e é hoje em dia uma técnica de ligação dominante na indústria aeronáutica e automóvel. As ligações adesivas visam substituir os métodos tradicionais de fixação mecânicos na união de estruturas. A melhoria ao longo dos anos de vários modelos de previsão de dano, nomeadamente através do Método de Elementos Finitos (MEF), tem ajudado ao desenvolvimento desta técnica de ligação. Os Modelos de Dano coesivo (MDC), usados em conjunto com MEF, são uma ferramenta viável para a previsão de resistência de juntas adesivas. Os MDC combinam critérios da resistência dos materiais para a iniciação do dano e conceitos da mecânica da fratura para a propagação da fenda. Existem diversas formas de leis coesivas possíveis de aplicar em simulações por MDC, em função do comportamento expectável dos materiais que estão a ser simulados. Neste trabalho, estudou-se numericamente o efeito de diversas formas de leis coesivas na previsão no comportamento de juntas adesivas, nomeadamente nas curvas forçadeslocamento (P-) de ensaios Double-Cantilever Beam para caracterização à tração e ensaios End-Notched Flexure para caraterização ao corte. Também se estudou a influência dos parâmetros coesivos à tração e corte nas curvas P- dos referidos ensaios. Para o Araldite®AV138 à tração e ao corte, a lei triangular é a que melhor prevê o comportamento do adesivo. Para a previsão da resistência de ambos os adesivos Araldite® 2015 e SikaForce® 7752, a lei trapezoidal é a que melhor se adequa, confirmando assim que esta lei é a que melhor caracteriza o comportamento de dano de adesivos tipicamente dúcteis. O estudo dos parâmetros revelou influência distinta na previsão do comportamento das juntas, embora com bastantes semelhanças entre os diferentes tipos de adesivos.

Comparação de técnicas analíticas e numéricas para previsão de resistência de juntas adesivas de sobreposição simples

As juntas adesivas têm vindo a ser usadas em diversas áreas e contam com inúmeras aplicações práticas. Devido ao fácil e rápido fabrico, as juntas de sobreposição simples (JSS) são um tipo de configuração bastante comum. O aumento da resistência, a redução de peso e a resistência à corrosão são algumas das vantagens que este tipo de junta oferece relativamente aos processos de ligação tradicionais. Contudo, a concentração de tensões nas extremidades do comprimento da ligação é uma das principais desvantagens. Existem poucas técnicas de dimensionamento precisas para a diversidade de ligações que podem ser encontradas em situações reais, o que constitui um obstáculo à utilização de juntas adesivas em aplicações estruturais. O presente trabalho visa comparar diferentes métodos analíticos e numéricos na previsão da resistência de JSS com diferentes comprimentos de sobreposição (LO). O objectivo fundamental é avaliar qual o melhor método para prever a resistência das JSS. Foram produzidas juntas adesivas entre substratos de alumínio utilizando um adesivo époxido frágil (Araldite® AV138), um adesivo epóxido moderadamente dúctil (Araldite® 2015), e um adesivo poliuretano dúctil (SikaForce® 7888). Consideraram-se diferentes métodos analíticos e dois métodos numéricos: os Modelos de Dano Coesivo (MDC) e o Método de Elementos Finitos Extendido (MEFE), permitindo a análise comparativa. O estudo possibilitou uma percepção crítica das capacidades de cada método consoante as características do adesivo utilizado. Os métodos analíticos funcionam apenas relativamente bem em condições muito específicas. A análise por MDC com lei triangular revelou ser um método bastante preciso, com excepção de adesivos que sejam bastante dúcteis. Por outro lado, a análise por MEFE demonstrou ser uma técnica pouco adequada, especialmente para o crescimento de dano em modo misto.

Regulation of autoimmune neuroinflammation by stress-responsive genes

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

AMINOGLYCOSIDE RESISTANCE GENES IN Pseudomonas aeruginosa ISOLATES FROM CUMANA, VENEZUELA

The enzymatic modification of aminoglycosides by aminoglycoside-acetyltransferases (AAC), aminoglycoside-adenyltransferases (AAD), and aminoglycoside-phosphotransferases (APH), is the most common resistance mechanism in P. aeruginosa and these enzymes can be coded on mobile genetic elements that contribute to their dispersion. One hundred and thirty seven P. aeruginosa isolates from the University Hospital, Cumana, Venezuela (HUAPA) were evaluated. Antimicrobial susceptibility was determined by the disk diffusion method and theaac, aadB and aph genes were detected by PCR. Most of the P. aeruginosa isolates (33/137) were identified from the Intensive Care Unit (ICU), mainly from discharges (96/137). The frequency of resistant P. aeruginosaisolates was found to be higher for the aminoglycosides tobramycin and amikacin (30.7 and 29.9%, respectively). Phenotype VI, resistant to these antibiotics, was the most frequent (14/49), followed by phenotype I, resistant to all the aminoglycosides tested (12/49). The aac(6´)-Ib,aphA1 and aadB genes were the most frequently detected, and the simultaneous presence of several resistance genes in the same isolate was demonstrated. Aminoglycoside resistance in isolates ofP. aeruginosa at the HUAPA is partly due to the presence of the aac(6´)-Ib, aphA1 andaadB genes, but the high rates of antimicrobial resistance suggest the existence of several mechanisms acting together. This is the first report of aminoglycoside resistance genes in Venezuela and one of the few in Latin America.

Avaliação do ensaio de pull-out na estimativa da resistência à compressão do betão em idades jovens

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil – Perfil Estruturas

PERFORMANCE OF CONVENTIONAL PCRs BASED ON PRIMERS DIRECTED TO NUCLEAR AND MITOCHONDRIAL GENES FOR THE DETECTION AND IDENTIFICATION OF Leishmania spp.

In visceral leishmaniasis, the detection of the agent is of paramount importance to identify reservoirs of infection. Here, we evaluated the diagnostic attributes of PCRs based on primers directed to cytochrome-B (cytB), cytochrome-oxidase-subunit II (coxII), cytochrome-C (cytC), and the minicircle-kDNA. Although PCRs directed to cytB, coxII, cytC were able to detect different species of Leishmania, and the nucleotide sequence of their amplicons allowed the unequivocal differentiation of species, the analytical and diagnostic sensitivity of these PCRs were much lower than the analytical and diagnostic sensitivity of the kDNA-PCR. Among the 73 seropositive animals, the asymptomatic dogs had spleen and bone marrow samples collected and tested; only two animals were positive by PCRs based on cytB, coxII, and cytC, whereas 18 were positive by the kDNA-PCR. Considering the kDNA-PCR results, six dogs had positive spleen and bone marrow samples, eight dogs had positive bone marrow results but negative results in spleen samples and, in four dogs, the reverse situation occurred. We concluded that PCRs based on cytB, coxII, and cytC can be useful tools to identify Leishmania species when used in combination with automated sequencing. The discordance between the results of the kDNA-PCR in bone marrow and spleen samples may indicate that conventional PCR lacks sensitivity for the detection of infected dogs. Thus, primers based on the kDNA should be preferred for the screening of infected dogs.