Un rôle pour les protéines de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles chez Arabidopsis thaliana

Le maintien de la stabilité du génome est essentiel pour la propagation de l’information génétique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possèdent des systèmes de prévention des dommages et des réarrangements de l’ADN et nos connaissances sur ces processus découlent principalement de l’étude des génomes bactériens et nucléaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systèmes de protection des génomes d’organelles. Cette étude révèle l’importance des protéines liant l’ADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilité du génome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilité du génome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. L’absence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molécules rearrangées produites par recombinaison non-homologue médiée par des régions de microhomologie. Ce mécanisme est similaire au “microhomology-mediated break-induced replication” (MMBIR) retrouvé chez les bactéries, la levure et l’humain. Nous montrons également que les organelles de plantes peuvent réparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La délétion de différents membres de la famille Whirly entraîne une accumulation importante de réarrangements dans le génome des organelles suite à l’induction de bris double-brin. Ces résultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la réparation fidèle des génomes d’organelles. En se basant sur des données biologiques et structurales, nous proposons un modèle où les Whirlies modulent la disponibilité de l’ADN simple-brin, régulant ainsi le choix des voies de réparation et permettant le maintien de la stabilité du génome des organelles. Les divers aspects de ce modèle seront testés au cours d’expériences futures ce qui mènera à une meilleure compréhension du maintien de la stabilité du génome des organelles.

Effets de l’alcoolisme fœtal sur le développement du corps genouillé latéral du singe

L’exposition du fœtus à l’éthanol est reconnue comme étant la principale cause de maladies évitables lors du développement. Une forte exposition à l’alcool durant la gestation peut occasionner des dysmorphies cranio-faciales et des retards mentaux, ainsi que des troubles d’apprentissages et du comportement. Le développement du système visuel est également perturbé chez une grande majorité d’enfants qui ont été exposés à l’alcool. Lorsque les doses prises sont élevées, le système visuel peut présenter une panoplie de symptômes comme une augmentation de la tortuosité des vaisseaux rétiniens, de la myopie, de l’hypermétropie, du strabisme et une hypoplasie du nerf optique. Cependant, très peu d’études se sont penchées sur les effets de plus faibles doses sur le développement du système visuel du primate. Le singe est un excellent modèle pour étudier le système visuel car il possède plusieurs similitudes avec l’humain tant au niveau développemental qu’au niveau structurel. De plus, le singe utilisé, le Chlrocebus aethiops sabeus, possède l’avantage que des individus de cette espèce ont une consommation naturelle et volontaire à l’alcool. Une étude (Clarren et al., 1990) a suggéré qu’une faible exposition à l’alcool du fœtus du primate non humain occasionnait une diminution du nombre de cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). Étant donné que le corps genouillé latéral dorsal (CGLd) reçoit la plupart de ses intrants de la rétine, il est raisonnable d’assumer que les couches rétino-récipientes du CGLd devraient être aussi affectées. Nous avons alors émis l’hypothèse que le CGLd devrait également subir une diminution du nombre de neurones. Pour la première fois, nous avons utilisé une méthode stéréologique pour quantifier le nombre de cellules dans les couches parvo- (P) et magnocellulaires (M) du CGLd. Contrairement à notre hypothèse de départ, nous n’avons pas observé de diminution dans le nombre global de neurones dans le CGLd des animaux exposés à l’alcool par rapport à des sujets contrôles, ni une diminution de son volume. Nous avons toutefois observé une diminution de la taille du corps cellulaire seulement dans la population M du CGLd. Ces résultats suggèrent que le système visuel est affecté par une faible exposition à l’alcool durant son développement qui devrait se traduire sur le comportement par des déficits dans les fonctions de la voie M.

Polysaccharide-based Polyion Complex Micelles as New Delivery Systems for Hydrophilic Cationic Drugs

Les micelles polyioniques ont émergé comme des systèmes prometteurs de relargage de médicaments hydrophiles ioniques. Le but de cette étude était le développement des micelles polyioniques à base de dextrane pour la relargage de médicaments hydrophiles cationiques utilisant une nouvelle famille de copolymères bloc carboxymethyldextran-poly(éthylène glycol) (CMD-PEG). Quatre copolymères CMD-PEG ont été préparés dont deux copolymères identiques en termes de longueurs des blocs de CMD et de PEG mais différent en termes de densité de charges du bloc CMD; et deux autres copolymères dans lesquels les blocs chargés sont les mêmes mais dont les blocs de PEG sont différents. Les propriétés d’encapsulation des micelles CMD-PEG ont été évaluées avec différentes molécules cationiques: le diminazène (DIM), un médicament cationique modèle, le chlorhydrate de minocycline (MH), un analogue semi-synthétique de la tétracycline avec des propriétés neuro-protectives prometteuses et différents antibiotiques aminoglycosidiques. La cytotoxicité des copolymères CMD-PEG a été évaluée sur différentes lignées cellulaires en utilisant le test MTT et le test du Bleu Alamar. La formation de micelles des copolymères de CMD-PEG a été caractérisée par différentes techniques telles que la spectroscopie RMN 1H, la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et la titration calorimétrique isotherme (ITC). Le taux de relargage des médicaments et l’activité pharmacologique des micelles contenant des médicaments ont aussi été évalués. Les copolymères CMD-PEG n'ont induit aucune cytotoxicité dans les hépatocytes humains et dans les cellules microgliales murines (N9) après 24 h incubation pour des concentrations allant jusqu’à 15 mg/mL. Les interactions électrostatiques entre les copolymères de CMD-PEG et les différentes drogues cationiques ont amorcé la formation de micelles polyioniques avec un coeur composé du complexe CMD-médicaments cationiques et une couronne composée de PEG. Les propriétés des micelles DIM/CMDPEG ont été fortement dépendantes du degré de carboxyméthylation du bloc CMD. Les micelles de CMD-PEG de degré de carboxyméthylation du bloc CMD ≥ 60 %, ont incorporé jusqu'à 64 % en poids de DIM et ont résisté à la désintégration induite par les sels et ceci jusqu'à 400 mM NaCl. Par contre, les micelles de CMD-PEG de degré de carboxyméthylation ~ 30% avaient une plus faible teneur en médicament (~ 40 % en poids de DIM) et se désagrégeaient à des concentrations en sel inférieures (∼ 100 mM NaCl). Le copolymère de CMD-PEG qui a montré les propriétés micellaires les plus satisfaisantes a été sélectionné comme système de livraison potentiel de chlorhydrate de minocycline (MH) et d’antibiotiques aminoglycosidiques. Les micelles CMD-PEG encapsulantes de MH ou d’aminoglycosides ont une petite taille (< 200 nm de diamètre), une forte capacité de chargement (≥ 50% en poids de médicaments) et une plus longue période de relargage de médicament. Ces micelles furent stables en solution aqueuse pendant un mois; après lyophilisation et en présence d'albumine sérique bovine. De plus, les micelles ont protégé MH contre sa dégradation en solutions aqueuses. Les micelles encapsulant les drogues ont maintenu les activités pharmacologiques de ces dernières. En outre, les micelles MH réduisent l’inflammation induite par les lipopolysaccharides dans les cellules microgliales murines (N9). Les micelles aminoglycosides ont été quant à elles capable de tuer une culture bactérienne test. Toutefois les micelles aminoglycosides/CMDPEG furent instables dans les conditions physiologiques. Les propriétés des micelles ont été considérablement améliorées par des modifications hydrophobiques de CMD-PEG. Ainsi, les micelles aminoglycosides/dodecyl-CMD-PEG ont montré une taille plus petite et une meilleure stabilité aux conditions physiologiques. Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude montrent que CMD-PEG copolymères sont des systèmes prometteurs de relargage de médicaments cationiques.

Regulation of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT expression and activity in testicular cholesterol metabolism in mink and in mouse following experimental genetic deletion

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule.

Les polymorphismes des gènes encodant les protéines apoptotiques Bim et Bax : leur rôle dans la réponse thérapeutique chez les enfants ayant la leucémie lymphoblastique aiguë

INTRODUCTION Des réponses thérapeutiques variables aux glucocorticoïdes (GCs) sont observées parmi les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les protéines Bax et Bim ont déjà montré un rôle important dans l’apoptose des cellules leucémiques. L’expression de Bax était plus basse chez les patients leucémiques résistants au médicament, de même une sensibilité diminuée aux GCs a été associée avec une expression réduite de Bim. La différence dans l’expression pourrait être due à des polymorphismes présents dans ces gènes et donc être associés avec la résistance aux GCs. MÉTHODE Dix-huit polymorphismes en régions régulatrices, 2 polymorphismes exoniques et 7 polymorphismes en région 3’UTR de ces gènes ont été analysés chez les témoins (n=50) et ont permis de déterminer un nombre minimal de polymorphismes suffisants pour définir les haplotypes (tagSNPs). Ces 8 polymorphismes ont ensuite été génotypés chez 286 enfants atteints de la LLA et ont été testés pour l’issue de la maladie par l’analyse de survie. RÉSULTATS Une survie sans évènement et une survie sans rechute diminuées ont été observées pour l’haplotype 3 (p=0,03 et p=0,02). Une survie globale diminuée a été associée avec l’homozygotie pour l’allèle exonique T298C>T (p=0,03), de même que pour les haplotypes 1 et 4 (p=0,04 et p=0,02) du gène Bim. CONCLUSION Les polymorphismes ont été associés avec une survie diminuée chez des enfants atteints de LLA. Il reste à tester d’autres polymorphismes présents dans ces deux gènes ainsi qu’à définir leurs fonctions afin de comprendre leurs rôles dans la réponse aux GCs.

Caractérisation du risque associé au virus de l'hépatite E chez le porc

Dans cette étude, la bile d’un porc canadien naturellement infecté par une souche du virus de l’hépatite E (VHE) a été utilisée afin d’inoculer deux groupes de porcelets. Dans l’étude précoce (E), 4 porcelets âgés de 4 semaines et exempts de pathogènes spécifiques (SPF), ont été suivis jusqu’à 14 jours post-inoculation (pi). Dans l’étude tardive (L), 9 porcelets ont été suivis à chaque semaine jusqu’à l’abattage, soit 120 jours pi. À la nécropsie, la présence du VHE a été évaluée dans différents organes à 7, 14 et 120 jours pi. Des porcelets témoins (E=2 et L=3) ont été inoculés par de la bile exempte de VHE. Le virus a persisté chez certains animaux jusqu’à 84 à 105 jours pi dans le sérum malgré la présence d’anticorps IgG anti-VHE dans le sang, suggérant une virémie prolongée. L’excrétion virale dans les fèces s’est étalée également sur une période de 105 jours pi chez certains animaux. De plus, la détection de l’ARN viral dans les organes évalués s’est révélée presque nulle à l’âge d’abattage à l’exception de quelques vésicules biliaires, alors qu’on retrouvait l’ARN viral dans plusieurs organes à 7 et 14 jours pi. Pour évaluer la distribution du VHE chez les porcs commerciaux du Québec, un échantillonnage de porcs de trois abattoirs a été réalisé. Environ 100 échantillons de sang, fèces, foies et bile provenant des mêmes animaux en processus d’abattage ont été prélevés dans chacun des abattoirs, sur des porcs destinés à la consommation humaine. La détection de l’ARN viral et des anticorps du VHE a été réalisée à l’aide d’une RT-PCR nichée et d’un test ELISA adapté pour déceler les anticorps porcins anti-VHE. Chez les porcs d’abattoir, 12,9 % des échantillons de bile contenaient de l’ARN viral du VHE, alors que la détection virale était moindre dans les autres organes. Une séroprévalence en IgG de 26,0 % a été obtenue pour les sérums porcins analysés. Une analyse phylogénétique des différentes souches isolées pendant l’étude a démontré qu’elles sont du génotype 3. Ces données indiquent une exposition potentielle des travailleurs de l’industrie porcine au VHE porcin, notamment par les fèces, le sang et les organes et également pour les consommateurs par le biais des foies.

Analyse fonctionnelle de deux nouvelles mutations récessives de l’AQP2 impliquées dans le diabète insipide néphrogénique par expression dans les ovocytes de Xenopus laevis

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives.

Caractérisation de l’apoptose observée dans le système limbique après une ischémie myocardique transitoire chez le rat

Au niveau clinique, il a été observé que de 15 à 30 % des patients qui ont subi un infarctus du myocarde développent une dépression majeure. De plus, la population atteinte de dépression post-infarctus présente un risque de mortalité de trois à quatre fois plus élevé, et ce, en comparaison avec la population non dépressive post-infarctus. Dans un modèle de rat développé pour étudier la dépression post-infarctus, des cellules apoptotiques ont été retrouvées au niveau du système limbique. Il apparaît que les cytokines seraient en partie responsables de cette mort cellulaire qui relie le cœur en ischémie et le système nerveux central. Donc, les objectifs de cette thèse sont : 1) de caractériser spatialement et temporellement la survenue de la mort cellulaire par apoptose dans les structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde ; 2) de déterminer l’effet de l’anti-inflammatoire celecoxib sur cette apoptose observée au niveau de l’amygdale et de déterminer l’implication de l’enzyme COX-2 ; 3) de déterminer l’implication de la cytokine pro-inflammatoire TNF-α dans l’apoptose observée au niveau des structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde. Afin d’atteindre ces objectifs, les rats ont subi une ischémie de 40 minutes, suivi d’une période de reperfusion qui varie d’un protocole à l’autre (15 minutes, 24, 48, 72 heures ou 7 jours). De plus, en fonction du protocole, ces rats ont été traités avec soit du célécoxib (inhibiteur sélectif de la COX-2), soit avec du PEG sTNF-R1 (inhibiteur du TNF-α). À la suite de ces protocoles, les rats ont été sacrifiés, la taille de l’infarctus a été déterminée et les différentes structures cérébrales du système limbique prélevées. Des tests biochimiques propres à chaque protocole ont été réalisés afin de documenter l'apoptose. Il a alors été observé qu’aucun des deux traitements ne présentait d’effet sur la taille de l’infarctus. L’étude de l’apoptose dans le système limbique a révélé que : 1) le processus apoptotique se mettait en place dans l’hippocampe dès les 15 premières minutes de reperfusion suivant l’infarctus du myocarde et que ce processus était spatialement dynamique dans le système limbique jusqu’au septième jour postreperfusion ; 2) il est apparu que la COX-2 était impliquée dans l'apoptose du système limbique ; 3) il a été observé que le TNF-α périphérique était impliqué dans ce processus apoptotique après 72 heures de reperfusion en activant la voie extrinsèque de l'apoptose. Ces résultats ont permis de caractériser la survenue de l’apoptose au niveau du système limbique chez le rat à la suite d’un infarctus du myocarde et de documenter l'implication de la COX-2 et du TNF-α dans ce processus. Bien que ces résultats n’apportent pas de schémas thérapeutiques clairs ou de mécanismes physiopathologiques globaux ces derniers permettent une meilleure compréhension de la relation existante entre le cœur et le système nerveux central dans le cadre de l’infarctus du myocarde. De manière moins spécifique ils précisent la relation entre le système inflammatoire et le système nerveux central.

The Na+/H+ exchanger Nhx1 of Saccharomyces cerevisiae is essential to limit drug toxicity

Nhx1 est un antiport vacuolaire de Na+/H+ chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nhx1 joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie ionique du cytoplasme de la cellule. En effet, la mutation du gène NHX1 chez la levure nhx1Δ entraîne une perte de l’homéostasie cellulaire quand les cellules sont cultivées dans un milieu de faible osmolarité. Ce travail rapporte pour la première fois, et contrairement à la cellule parentale, que la mutation du gène NHX1 a pour effet une sensibilité du mutant nhx1Δ à une variété des drogues et des agents cationiques et anioniques lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu riche. En outre, dans ces conditions de culture, aucune sensibilité n’a été observée chez le mutant nhx1Δ quand les cellules sont traitées avec différentes concentrations de sel. Nous avons aussi démontré que la sensibilité du mutant nhx1Δ aux différents agents ainsi que la sécrétion de l’enzyme carboxypeptidase Y observé chez ce mutant n’ont pas été restauré lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux avec différents pH ou avec différentes concentrations de sel. Enfin, une analyse génétique a révélé que le mutant nhx1Δ montre un phénotype distinct d’autres mutants qui ont un défaut dans le trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi quand ces cellules sont traitées avec différents agents. Cette analyse prouve que la sensibilité de nhx1Δ aux différents agents n’est pas liée au trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi.

Identification des réseaux transcriptionnnels de résistance aux antifongiques chez Candida albicans

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif.

Implication du récepteur aux cannabinoïdes CB2 dans le développement de la voie rétinothalamique

Durant le développement du système visuel, les cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) envoient des axones qui seront influencés par divers signaux guidant leur cône de croissance, permettant ainsi la navigation des axones vers leurs cibles terminales. Les endocannabinoïdes, des dérivés lipidiques activant les récepteurs aux cannabinoides (CB1 et CB2), sont présents de manière importante au cours du développement. Nous avons démontré que le récepteur CB2 est exprimé à différents points du tractus visuel durant le développement du hamster. L’injection d’agonistes et d’agonistes inverses pour le récepteur CB2 a modifié l’aire du cône de croissance et le nombre de filopodes présents à sa surface. De plus, l’injection d’un gradient d’agoniste du récepteur CB2 produit la répulsion du cône de croissance tandis qu’un analogue de l’AMPc (db-AMPc) produit son attraction. Les effets du récepteur CB2 sur le cône de croissance sont produits en modulant l’activité de la protéine kinase A(PKA), influençant la présence à la membrane cellulaire d’un récepteur à la nétrine-1 nommé Deleted in Colorectal Cancer (DCC). Notamment, pour que le récepteur CB2 puisse moduler le guidage du cône de croissance, la présence fonctionnelle du récepteur DCC est essentielle.. Suite à une injection intra-occulaire d’un agoniste inverse du récepteur CB2, nous avons remarqué une augmentation de la longueur des branches collatérales des axones rétiniens au niveau du LTN (noyau lateral terminal). Nous avons également remarqué une diminution de la ségrégation des projections ganglionnaires au niveau du dLGN, le noyau genouillé lateral dorsal, chez les animaux transgéniques cnr2-/-, ayant le gène codant pour le récepteur CB2 inactif. Nos données suggèrent l’implication des endocannabinoïdes et de leur récepteur CB2 dans la modulation des processus de navigation axonale et de ségrégation lors du développement du système visuel.

Caractérisation moléculaire de la modulation spatio-temporelle des fonctions du phagosome

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées.

Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.

Mécanisme de leucémogénèse par les oncogènes SCL et LMO1

La leucémie lymphoïde représente 30% de tous les cancers chez l’enfant. SCL (« Stem cell leukemia ») et LMO1/2 (« LIM only protein ») sont les oncogènes les plus fréquemment activés dans les leucémies aiguës des cellules T chez l'enfant (T-ALL). L’expression ectopique de ces deux oncoprotéines dans le thymus de souris transgéniques induit un blocage de la différenciation des cellules T suivie d’une leucémie agressive qui reproduit la maladie humaine. Afin de définir les voies génétiques qui collaborent avec ces oncogènes pour induire des leucémies T-ALL, nous avons utilisé plusieurs approches. Par une approche de gène candidat, nous avons premièrement identifié le pTalpha, un gène crucial pour la différenciation des cellules T, comme cible directe des hétérodimères E2AHEB dans les thymocytes immatures. De plus, nous avons montré que pendant la différenciation normale des thymocytes, SCL inhibe la fonction E2A et HEB et qu’un dosage entre les protéines E2A, HEB et SCL détermine l’expression du pTalpha. Deuxièmement, par l’utilisation d’une approche globale et fonctionnelle, nous avons identifié de nouveaux gènes cibles des facteurs de transcription E2A et HEB et montré que SCL et LMO1 affectent la différenciation thymocytaire au stade préleucémique en inhibant globalement l’activité transcriptionnelle des protéines E par un mécanisme dépendant de la liaison à l’ADN. De plus, nous avons découvert que les oncogènes SCL et LMO1 sont soit incapables d’inhiber totalement l’activité suppresseur de tumeur des protéines E ou agissent par une voie d’induction de la leucémie différente de la perte de fonction des protéines E. Troisièmement, nous avons trouvé que Notch1, un gène retrouvé activé dans la majorité des leucémies T-ALL chez l’enfant, opère dans la même voie génétique que le pré-TCR pour collaborer avec les oncogènes SCL et LMO1 lors du processus de leucémogénèse. De plus, cette collaboration entre des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation normales et importantes pour la détermination de la destinée cellulaire pourraient expliquer la transformation spécifique à un type cellulaire. Quatrièmement, nous avons trouvé que les oncogènes SCL et LMO1 sont des inducteurs de sénescence au stade préleucémique. De plus, la délétion du locus INK4A/ARF, un évènement retrouvé dans la majorité des leucémies pédiatriques T-ALL associées avec une activation de SCL, collabore aves les oncogènes SCL et LMO1 dans l’induction de la leucémie. Cette collaboration entre la perte de régulateurs de la sénescence suggère qu’un contournement de la réponse de sénescence pourrait être nécessaire à la transformation. Finalement, nous avons aussi montré que l’interaction directe entre les protéines SCL et LMO1 est critique pour l’induction de la leucémie. Ces études ont donc permis d’identifier des évènements collaborateurs, ainsi que des propriétés cellulaires affectées par les oncogènes associés avec la leucémie et de façon plus générale dans le développement du cancer.

Impact d’une infection intra-mammaire causée par Staphylococcus aureus ou un staphylocoque coagulase-négative présente en début de lactation chez les taures laitières

L’objectif de cette étude était de déterminer l’impact d’une infection intra-mammaire (IIM) subclinique causée par staphylocoque coagulase-négative (SCN) ou Staphylococcus aureus diagnostiquée durant le premier mois de lactation chez les taures sur le comptage de cellules somatiques (CCS), la production laitière et le risque de réforme durant la lactation en cours. Des données bactériologiques provenant d’échantillons de lait composites de 2 273 taures Holstein parmi 50 troupeaux ont été interprétées selon les recommandations du National Mastitis Council. Parmi 1 691 taures rencontrant les critères de sélection, 90 (5%) étaient positives à S. aureus, 168 (10%) étaient positives à SCN et 153 (9%) étaient négatives (aucun agent pathogène isolé). Le CCS transformé en logarithme népérien (lnCCS) a été modélisé via une régression linéaire avec le troupeau comme effet aléatoire. Le lnCCS chez les groupes S. aureus et SCN était significativement plus élevé que dans le groupe témoin de 40 à 300 jours en lait (JEL) (P < 0.0001 pour tous les contrastes). La valeur journalière du lnSCC chez les groupes S. aureus et SCN était en moyenne 1.2 et 0.6 plus élevé que le groupe témoin respectivement. Un modèle similaire a été réalisé pour la production laitière avec l’âge au vêlage, le trait génétique lié aux parents pour la production laitière et le logarithme népérien du JEL de la pesée inclus. La production laitière n’était pas statistiquement différente entre les 3 groupes de culture de 40 à 300 JEL (P ≥ 0.12). Les modèles de survie de Cox ont révélé que le risque de réforme n’était pas statistiquement différent entre le groupe S. aureus ou SCN et le groupe témoin (P ≥ 0.16). La prévention des IIM causées par SCN et S. aureus en début de lactation demeure importante étant donné leur association avec le CCS durant la lactation en cours.