Genetic Manipulation, Gene Silencing and Biomarker Development in Multiple Experimental Models.

The thesis is set in three different parts, according to the relative experimental models. First, the domestic pig (Sus scrofa) is part of the study on reproductive biotechnologies: the transgenesis technique of Sperm Mediated Gene Transfer is widely studied starting from the quality of the semen, through the study of multiple uptakes of exogenous DNA and lastly used in the production of multi-transgenic blastocysts. Finally we managed to couple the transgenesis pipeline with sperm sorting and therefore produced transgenic embryos of predetermined sex. In the second part of the thesis the attention is on the fruit fly (Drosophila melanogaster) and on its derived cell line: the S2 cells. The in vitro and in vivo models are used to develop and validate an efficient way to knock down the myc gene. First an efficient in vitro protocol is described, than we demonstrate how the decrease in myc transcript remarkably affects the ribosome biogenesis through the study of Polysome gradients, rRNA content and qPCR. In vivo we identified two optimal drivers for the conditional silencing of myc, once the flies are fed with RU486: the first one is throughout the whole body (Tubulin), while the second is a head fat body driver (S32). With these results we present a very efficient model to study the role of myc in multiple aspects of translation. In the third and last part, the focus is on human derived lung fibroblasts (hLF-1), mouse tail fibroblasts and mouse tissues. We developed an efficient assay to quantify the total protein content of the nucleus on a single cell level via fluorescence. We coupled the protocol with classical immunofluorescence so to have at the same time general and particular information, demonstrating that during senescence nuclear proteins increase by 1.8 fold either in human cells, mouse cells and mouse tissues.

Virus a RNA e a DNA: importanza dell’ampliamento dello spettro d’ospite nell’evoluzione virale

L’ampliamento dello spettro d’ospite è strettamente connesso al processo evolutivo a cui i virus sono assoggettati e rappresenta una notevole sfida alla loro capacità di adattarsi. L’attitudine a superare le barriere di specie è conseguente alla costante e relativamente rapida evoluzione che caratterizza i virus; allo stesso tempo, la forza selettiva esercitata dal nuovo ospite rappresenterà un ulteriore stimolo per le capacità adattative del virus. Ad oggi, i meccanismi genetici ed evolutivi responsabili del salto di specie virale, cioè la trasmissione di un virus da un ospite tradizionale ad uno precedentemente resistente all’infezione, sono parzialmente sconosciuti. Nel seguente lavoro verranno presentati gli studi effettuati sulle dinamiche evolutive caratterizzanti virus a RNA e a DNA in cui si sono osservate variazioni dello spettro d’ospite. Gli studi hanno riguardato i coronavirus, con particolare riferimento al ruolo svolto dai pipistrelli nell’evoluzione dei coronavirus SARS-correlati, e l’importanza del gatto nell’evoluzione dei parvovirus dei carnivori. Nella prima sezione saranno mostrate le correlazioni genetiche dei coronavirus identificati in Italia nei pipistrelli appartenenti alla specie Rhinolophus ferrumequinum con i ceppi europei e del resto del mondo, allo scopo di chiarire l’origine evolutiva dei coronavirus dei pipistrelli correlati al virus della SARS (Bat-SARS-like CoV) europei, gli eventi migratori che hanno caratterizzato la loro diffusione nel continente e le potenziali ripercussioni sulla salute pubblica. Nella seconda sezione saranno evidenziate le caratteristiche molecolari dei ceppi di parvovirus circolanti nella popolazione felina, valutandone la diversità di sequenza e la complessità genetica, allo scopo di ottenere importanti informazioni in merito all’evoluzione del virus e alle interazioni tra il parvovirus e l’ospite.

Conservazione del seme sortato di suino

Gli spermatozoi di suino sottoposti alla procedura di sessaggio mediante citofluorimetria presentano una serie di modificazioni morfo-funzionali che compromettono nel tempo la loro sopravvivenza e la capacità fecondante. Questi spermatozoi, inoltre, a causa della sensibilità ai danni indotti dalla crioconservazione, vengono solitamente conservati allo stato liquido a 15-17°C, con conseguente ulteriore peggioramento nel tempo della qualità delle cellule spermatiche sessate. Lo scopo della ricerca è stato quello di valutare le modificazioni di alcune caratteristiche morfo-funzionali degli spermatozoi in seguito a sex-sorting e conseguente conservazione. Successivamente si è cercato di migliorare i parametri qualitativi del seme sessato mediante l’aggiunta di sostanze antiossidanti e la messa a punto di una nuova metodica di conservazione. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la procedura di sessaggio e la conseguente conservazione per 24-26 ore a 15°C hanno indotto un peggioramento significativo delle caratteristiche morfo-funzionali (vitalità, integrità acrosomiale, quantità e distribuzione dell’Hsp70, capacità fecondante). Mentre l’azione degli antiossidanti non si è rivelata efficace nel miglioramento della qualità degli spermatozoi durante le fasi di colorazione e passaggio attraverso il citofluorimetro, l’azione congiunta del plasma seminale e degli antiossidanti superossido-dismutasi ed epigallocatechina-3-gallato ha indotto un miglioramento significativo della vitalità degli spermatozoi. Per la conservazione del seme di suino è stata testata la tecnica di incapsulazione in membrane di alginato di bario che permette, durante l’inseminazione artificiale, un rilascio graduale degli spermatozoi e l’utilizzo di un quantitativo inferiore di materiale seminale. L’applicazione di tale tecnica per la conservazione degli spermatozoi di suino sessati non sembra provocare un calo significativo della vitalità, dell’integrità acrosomiale e dell’efficienza totale di fecondazione rispetto al seme sortato e conservato diluito suggerendo futuri studi in vivo. Una migliore conoscenza dei danni indotti da queste tecnologie e la loro minimizzazione potrà stimolare in futuro l’utilizzo su vasta scala del seme sessato nel suino.

Ruolo del Porcine Circovirus tipo 2 (PCV2) nella patologia riproduttiva del suino

La tesi è organizzata in 4 capitoli: -nel primo vengono brevemente riferite le patologie associate all’infezione da PCV2 con particolare riferimento all’iter diagnostico ed al ruolo rivestito dall’esame istologico e dalla identificazione dell’agente eziologico in situ contestualmente alle lesioni istologiche; -nel secondo viene presentato un iter diagnostico originale da applicare in condizioni di campo, qualora si voglia accertare la presenza del PCV2 nei tessuti dei prodotti di natimortalità/aborto del suino. In specifico si riferisce all’applicazione del protocollo in 2 aziende ed i risultati vengono analizzati per una revisione critica del protocollo impiegato; -nel terzo vengono presentati i risultati di un protocollo di infezione con PCV2 per via genitale tramite seme infetto. Scrofe convenzionali sono state sincronizzate per l’estro e fecondate con un’unica dose di seme PCV2 negativo alla PCR (gruppo controlli) o sperimentalmente esposto al PCV2 (gruppo infette). I risultati vengono analizzati in funzione delle ripercussioni che l’infezione precoce in gravidanza può produrre sulla scrofa (mancata gravidanza, ritorno in calore), sui feti e sugli invogli fetali. Viene stabilito il ruolo protettivo degli anticorpi circolanti al momento dell’infezione, stante l’evenienza che un basso titolo anticorpale si associa a viremia prolungata e maggiore numero di feti positivi al virus; -nel quarto viene presentato un esperimento sovrapponibile a quello riferito nel capitolo 3, però con la presenza anche di un gruppo di soggetti convenzionali vaccinati ed infettati con PCV2 durante la fecondazione artificiale usando seme sperimentalmente esposto al virus. Nella discussione dei risultati vengono enfatizzati 2 aspetti importanti nell’epidemiologia dell’infezione da PCV2: la eliminazione di virus è fortemente ridotta dalla vaccinazione, con conseguenze verosimilmente positive sulla circolazione del virus negli effettivi dell’allevamento; l’esposizione uterina è protetta dalla vaccinazione, stante la bassa percentuale di placente infette nel gruppo dei soggetti vaccinati rispetto a quelli non vaccinati e nei controlli.

Il coniglio come modello sperimentale per lo studio degli effetti neurologici indotti da Cobalto

Sono stati studiati gli effetti tossici dell’esposizione cronica a cobalto e cromo. In passato, questa tossicità, che colpiva lavoratori esposti per ragioni occupazionali, è stata un problema molto sentito. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno descritto una specifica tossicità mediata da elevati livelli di cobalto e cromo, anche in pazienti portatori di protesi metalliche, quali gli impianti d’anca. Anche se sintomi clinici tra cui, cecità, sordità e neuropatia periferica, suggeriscono uno specifico neurotropismo, ancora poco è conosciuto delle basi neuropatologiche di questo processo ed oltretutto non ne è ancora stata apportata un’evidenza sperimentale. In questo progetto di ricerca, quindi, si è voluto approfondire il meccanismo patogenetico da cui scaturiscono tali sintomi neurologici, utilizzando come modello sperimentale il coniglio. Conigli New Zealand White sono stati trattati con dosi endovenose ripetute di cobalto e cromo, inoculati singolarmente od in associazione tra loro. Nessuna evidente alterazione clinica o patologica è stata associata alla somministrazione di solo cromo, nonostante gli elevati livelli in sangue e tessuti, mentre i trattati con cobalto-cromo o solo cobalto hanno mostrato segni clinici gravanti sul sistema vestibolo-cocleare; il cobalto, quindi, è stato identificato come il maggiore elemento scatenante neurotossicità. Inoltre all’esame istopatologico gli animali hanno mostrato severa deplezione delle cellule gangliari retiniche e cocleari, assieme a danno al nervo ottico e perdita di cellule sensitive capellute dell’orecchio. È risultato infine evidente che la gravità delle alterazioni è stata correlata al dosaggio ed al tempo di esposizione; dati questi che confermano, quindi, le precedenti osservazioni fatte su pazienti umani esposti a rilascio abnorme di cobalto e cromo da usura di protesi d’anca. È stato ipotizzato che il cobalto agisca sui mitocondri provocando l’incremento di produzione di specie reattive dell’ossigeno e il rilascio di fattori proapoptotici, causando sulle cellule neuronali un danno proporzionale al loro fabbisogno energetico e grado di mielinizzazione.

Perfluoroalkylated substances in food matrices: development of mass spectrometry based analytical methods and preliminary monitoring

Perfluoroalkylated substances are a group of chemicals that have been largely employed during the last 60 years in several applications, widely spreading and accumulating in the environment due to their extreme resistance to degradation. As a consequence, they have been found also in various types of food as well as in drinking water, proving that they can easily reach humans through the diet. The available information concerning their adverse effects on health has recently increased the interest towards these contaminants and highlighted the importance of investigating all the potential sources of human exposure, among which diet was proved to be the most relevant. This need has been underlined by the European Union through Recommendation 2010/161/EU: in this document, Member States were called to monitor their presence of in food, producing accurate estimations of human exposure. The purpose of the research presented in this thesis, which is the result of a partnership between an Italian and a French laboratory, was to develop reliable tools for the analysis of these pollutants in food, to be used for generating data on potentially contaminated matrices. An efficient method based on liquid chromatography-mass spectrometry for the detection of 16 different perfluorinated compounds in milk has been validated in accordance with current European regulation guidelines (2002/657/EC) and is currently under evaluation for ISO 17025 accreditation. The proposed technique was applied to cow, powder and human breast milk samples from Italy and France to produce a preliminary monitoring on the presence of these contaminants. In accordance with the above mentioned European Recommendation, this project led also to the development of a promising technique for the quantification of some precursors of these substances in fish. This method showed extremely satisfying performances in terms of linearity and limits of detection, and will be useful for future surveys.

Chlamydia psittaci nel colombo di città: aspetti anatomo-patologici, sierologici e biomolecolari

Scopo del lavoro della presente tesi è stato quello di valutare la prevalenza di Chlamydiaceae, ed in particolare Chlamydia psittaci, in una popolazione aviare con caratteristiche sinantropiche quale il colombo di città (Columba livia var. domestica) dell’areale veneziano. Per evidenziare il patogeno sono state utilizzate metodiche sierologiche, d’isolamento e biomolecolari tradizionali. Contestualmente, mediante tecnologie molecolari innovative, quali microarray ed MLVA (Multilocus VNTR Assay) sono stati valutati i genotipi di C. psittaci e le eventuali altre specie di Chlamydia presenti in tale popolazione. Inoltre, si è proceduto ad una classificazione delle lesioni anatomo-patologiche ed ad una loro correlazione con la presenza del patogeno. I risultati dimostrano che la prevalenza di C. psittaci nella popolazione oggetto dello studio è del 10%. Durante tale studio è stata dimostrata la presenza di un ceppo di C. psittaci atipico, in quanto non classificabile con le attuali tecniche a disposizione. La genotipizzazione dei ceppi di C. psittaci conferma la presenza nel colombo di città del genotipo B, E ed E/B, che solitamente risultano essere coinvolti con minore frequenza in episodi di infezione umana. Inoltre sono stati dimostrati alcuni ceppi classificati come Chlamydia spp., in quanto le metodologie applicate e le conoscenze attuali non permettono ulteriori distinzioni, prospettando la possibilità di un nuovo ceppo. Infine, attraverso l’analisi dei dati raccolti durante la prima fase di campionamenti e successivamente confermati durante la seconda fase, siamo riusciti a strutturare un sistema di selezione, basato su caratteristiche funzionali ed anatomopatologiche, che permette di selezionare in sede necroscopica i colombi molto probabilmente infetti, permettendo conseguentemente una migliore organizzazione e gestione dei campioni di interesse contenendo nel contempo i costi ma mantenendo elevati gli standards diagnostici.

Patogeni e zecche vettrici: studio epidemiologico in parchi pubblici dell'Emilia Romagna

Le malattie trasmesse da zecche sono un importante problema sia per la salute animale che per quella umana e negli ultimi decenni hanno aumentato notevolmente la loro diffusione, in seguito ai cambiamenti climatici, che hanno permesso la distribuzione delle zecche in aree prima non interessate. Per tale motivo si è deciso di effettuare un’indagine sulla diffusione delle zecche e sui patogeni da loro trasmessi, mediante campionamenti sia a livello ambientale, sia su animali e umani infestati in quattro siti di tre parchi dell’Emilia Romagna, dove non risultavano precedenti segnalazioni, nelle province di Bologna e Ravenna, da Aprile a Ottobre 2010. In totale sono state raccolte 8212 zecche. Dall’ambiente sono state campionate 6734 larve, 1344 ninfe, 61 adulti; dagli animali e da persone sono stati raccolti 68 adulti e 5 ninfe appartenenti a diverse specie di Ixodidae. Sono state condotte analisi sull’abbondanza delle zecche nelle diverse aree di raccolta, in funzione del periodo di campionamento, della temperatura e dell’umidità relativa misurata a 5 cm dal suolo al momento del campionamento e della vegetazione. Su tutti gli individui adulti e su pool di ninfe e di larve, per un totale di 393 campioni, sono state condotte analisi di tipo molecolare per la ricerca di piroplasmi, Anaplasma phagocytophilum e Borrelia burgdorferi s.l. Attraverso la PCR e il sequenziamento, è emerso che il 7,6% dei campioni era positivo per piroplasmi, tra i quali è stata riscontrata anche la presenza delle specie zoonosiche Babesia EU1 e B. divergens. La real-time PCR eseguita solo sui campioni costituiti da ninfe e adulti ha evidenziato una prevalenza del 9,2% per A. phagocytophilum e del 21,6% per B. burgdorferi s.l. Su questi patogeni sono state quindi condotte analisi di tipo filogenetico. In alcuni campioni sono state riscontrate coinfezioni con combinazioni di due patogeni contemporaneamente.

Studio della Peste dei Piccoli Ruminanti nei territori saharawi

La Peste dei Piccoli Ruminanti (PPR) è una patologia virale ed acuta che colpisce i piccoli ruminanti, diffusa in Africa Sub-Sahariana, in Medio Oriente ed in Asia Meridionale. Questo lavoro si propone di effettuare il primo studio epidemiologico sulla PPR nella Repubblica Araba Saharawi Democratica (RASD), che comprende i Campi Profughi Saharawi, in territorio algerino, ed i “Territori Liberati” del Sahara Occidentale, valutando la potenziale presenza, prevalenza e distribuzione del virus della PPR in questi territori. Lo studio si è basato su una metodica di campionamento “a cluster” secondo la tecnica “a due stadi”. Sono stati individuati 23 siti di campionamento dai quali sono stati raccolti un totale di 976 campioni di siero prelevati da pecore, capre e cammelli. I campioni sono stati prelevati in Marzo ed Aprile 2008. I risultati dei test Competitive-Elisa hanno evidenziato una sieroprevalenza nel 28,26% degli animali testati, benché durante la raccolta dei campioni nessun animale abbia presentato sintomi clinici riferibili alla PPR. Tra Gennaio e Maggio 2010, in seguito ad episodi di aumentata mortalità nella popolazione ovi-caprina presente nei Campi Profughi, le autorità veterinarie locali sospettarono un outbreak di PPR. Tra Maggio ed Ottobre 2010 è stato sviluppato un outbreak investigation nei Campi Profughi Saharawi con lo scopo di confermare la circolazione del PPRV. I risultati di laboratorio hanno confermato la presenza del virus nel 33,33% dei campioni. Il sequenziamento del genoma virale ha rivelato che il virus apparteneva al Lignaggio 4 e le analisi filogenetiche hanno indicato una stretta relazione (99.3%) con il PPRV isolato durante l'epidemia di PPR in Marocco del 2008.

Ruolo dei recettori tirosinchinasici in oncologia animale

Disregolazioni dei recettori tirosinchinasici (RTK) sono di frequente riscontro nei tumori dell’uomo e in molti casi sono indicatori biologici che permettono di definire in maniera più accurata la prognosi dei pazienti. Possono rappresentare inoltre marker predittivi per la risposta a terapie antitumorali con farmaci a bersaglio molecolare. Numerosi inibitori tirosinchinasici (TKI) sono attualmente in corso di studio o già disponibili per l’utilizzo in oncologia umana, e molti di questi hanno dimostrato una significativa efficacia utilizzati singolarmente o in combinazione a terapie convenzionali. Studi recenti indicano che un quadro analogo di disregolazione dei recettori tirosinchinasici è presente anche nelle neoplasie dei piccoli animali, e ne suggeriscono in molti casi un’implicazione prognostica. Gli inibitori tirosinchinasi sono da poco entrati nell’arena dell’oncologia veterinaria, ma i primi risultati lasciano supporre che siano destinati ad essere integrati definitivamente nei protocolli terapeutici standard. La tesi consiste in una parte introduttiva in cui sono trattate le principali funzioni biologiche dei recettori tirosinchinasici, la loro struttura e il loro ruolo nell’oncogenesi e nella progressione tumorale in medicina umana e veterinaria. Si affrontano inoltre le principali metodiche di laboratorio per l’analisi molecolare in oncologia e i meccanismi d’azione dei farmaci inibitori tirosinchinasici, con un cenno ai prodotti maggiormente utilizzati e alle loro indicazioni. Segue la presentazione e la discussione dei risultati di quattro studi relativi alla valutazione delle disregolazioni del recettore tirosinchinasico Kit (espressione aberrante e mutazioni genomiche) nel mastocitoma cutaneo del gatto e del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) nel carcinoma squamocellulare cutaneo del gatto e nei tumori polmonari primitivi del cane, con particolare attenzione al loro ruolo prognostico.

Isufficienza Placentare nella Specie Equina

Lo sviluppo e la funzionalità della placenta influenzano direttamente la crescita ed il benessere del feto all'interno dell'utero, quindi qualsiasi problema strutturale o funzionale della placenta influenzerà lo sviluppo del feto. Lo scopo di questa tesi è stato quello di approfondire diversi aspetti clinici e clinico-patologici dell’insufficienza placentare nella specie equina, con l’intento di individuare dei parametri che possano essere di ausilio per l’identificazione precoce del puledro a rischio e della necessità di interventi terapeutici. La valutazione della concentrazione di lattato nel sangue e nel liquido amniotico potrebbe essere un utile strumento diagnostico per la diagnosi di acidosi metabolica associata ad ipossia/ischemia nel puledro e per identificare la necessità di un intervento precoce alla nascita. La risposta all’ipossia sembra essere mediata dall’HIF-1 e dall’HSF-1 anche nel puledro neonato, e se questi dati venissero confermati su un numero maggiore di animali, i due marcatori proteici e la MDA potrebbero essere utilizzati per la diagnosi di PAS nel puledro. L’esame di tutta l’unità placentare riveste un ruolo di fondamentale importanza per l’acquisizione di informazioni riguardo all’ambiente di vita intrauterino del puledro, ed è quindi auspicabile nella pratica ostetrica routinaria una maggiore attenzione all’esame della placenta, soprattutto in caso di patologie materno-fetali. Tra i parametri biochimici valutati al momento della nascita, la creatininemia e la glicemia possono fornire informazioni sull’efficienza dello scambio placentare ed essere quindi utilizzati per individuare puledri a rischio. Infine, lo sviluppo di una macro per il software ImageJ porta alla luce uno strumento nuovo, semplice da usare ed economico, per la valutazione morfometrica dell’arborizzazione dei villi placentari; tuttavia la ricerca necessità ulteriori indagini su un numero maggiore di animali per valutare le differenze morfometriche tra placente normali e patologiche.

Stato sanitario di Spigole (Dicentrarchus Labrax) ed Orate (Sparus Aurata) allevate in Grecia e in Italia in relazione alla presenza di agenti di Zoonosi ed Ectoparassiti patogeni

Le attività di ricerca della presente tesi di dottorato si sono focalizzata principalmente sulla parassitofauna dei pesci marini allevati in Grecia ed in Italia con particolare attenzione allo studio degli ectoparassiti di maggior rilievo sanitario in maricoltura ed alla ricerca di endoparassiti di potenziale interesse zoonosico, in particolare larve di nematodi Anisakidae del genere Anisakis. Nel corso del triennio sono stati sottoposti ad esami parassitologici 916 spigole (Dicentrarchus labrax) e 462 orate (Sparus aurata) prelevate presso diverse tipologie di allevamenti greci ed italiani. Per quanto concerne le spigole, la presenza di ectoparassiti è stata riscontrata nel 29,2% e nel 61,9% dei soggetti provenienti rispettivamente da impianti siti in Grecia ed in Italia, mentre le orate hanno presentato percentuali di positività rispettivamente del 87,5% e del 26,7%. Gli ectoparassiti dominanti sono risultati essere il monogeneo Diplectanum aequans nelle spigole ed il ciliato Cryptocaryon irritans e il monogeneo Furnestinia echeneis nelle orate, sebbene sia stato possibile studiare anche il coinvolgimento di altri ectoparassiti, quali il monogeneo Sparicotyle chrysophrii ed il dinoflagellato Amyloodinium ocellatum, nel determinismo di alcuni episodi morbosi. Le osservazioni istopatologiche hanno permesso di caratterizzare le lesioni causate dagli ectoparassiti a diverse intensità d’infestazione. Per quanto concerne la ricerca di parassiti zoonosici, con particolare riferimento agli stadi larvali di nematodi Anisakidae del genere Anisakis, si sono condotti esami parassitologici a livello di cavità viscerale e di muscolo laterale in tutti i soggetti provenienti da allevamenti in gabbia (626 soggetti, di cui 441 spigole e 185 orate). Tutti i soggetti esaminati sono risultati negativi, indicando come il rischio di infestazione da larve di nematodi anisakidi possa essere considerato trascurabile in spigole ed orate allevate in gabbia, come già dimostrato per il salmone atlantico (EFSA, 2010).

Proteinuria e sindrome nefrosica nel cane: studio reptrospettivo di 338 casi

La sindrome nefrosica (SN) è definita come la presenza concomitante di una proteinuria maggiore di 3.5g/24 h, ipoalbuminemia, ipercolesterolemia e presenza di edemi. I pazienti con SN sono più a rischio di quelli che presentano una nefropatia glomerulare non nefrosica (NNGD) per lo sviluppo di ipertensione, ipernatremia, complicazioni tromboemboliche e comparsa di insufficienza renale. In Medicina Veterinaria, la Letteratura riguardante l’argomento è molto limitata e non è ben nota la correlazione tra SN e gravità della proteinuria, ipoalbuminemia e sviluppo di tromboembolismo. L’obiettivo del presente studio retrospettivo è stato quello di descrivere e caratterizzare le alterazioni cliniche e clinicopatologiche che si verificano nei pazienti con rapporto proteine urinarie:creatinina urinaria (UPC) >2 con lo scopo di inquadrare con maggiore precisione lo stato clinico di questi pazienti e individuare le maggiori complicazioni a cui possono andare incontro. In un periodo di nove anni sono stati selezionati 338 cani e suddivisi in base ad un valore cut-off di UPC≥3.5. Valori mediani di creatinina, urea, fosforo, albumina urinaria, proteina C reattiva (CRP) e fibrinogeno sono risultati al di sopra del limite superiore dell’intervallo di riferimento, valori mediani di albumina sierica, ematocrito, antitrombina al disotto del limite inferiore di riferimento. Pazienti con UPC≥3.5 hanno mostrato concentrazioni di albumine, ematocrito, calcio, Total Iron Binding Capacity (TIBC), significativamente minori rispetto a quelli con UPC<3.5, concentrazioni di CRP, di urea e di fosforo significativamente maggiori. Nessuna differenza tra i gruppi nelle concentrazioni di creatinina colesterolo, trigliceridi, sodio, potassio, cloro, ferro totale e pressione sistolica. I pazienti con UPC≥3.5 si trovano verosimilmente in uno “stato infiammatorio” maggiore rispetto a quelli con UPC<3.5, questa ipotesi avvalorata dalle concentrazioni minori di albumina, di transferrina e da una concentrazione di CRP maggiore. I pazienti con UPC≥3.5 non presentano concentrazioni di creatinina più elevate ma sono maggiormente a rischio di anemia.

Epidemiologia e caratterizzazione molecolare di virus emergenti responsabili di Zoonosi: Calcivirus e Virus dell'Epatite E

Il virus dell’Epatite E (HEV) e i calicivirus (norovirus e sapovirus) causano rispettivamente epatite acuta e gastroenterite. Questi virus sono considerati agenti eziologici emergenti rappresentando un problema di sanità pubblica e di sicurezza alimentare. Per HEV, è ormai confermata la trasmissione zoonotica, e il suino è considerato il principale serbatoio asintomatico. Norovirus e sapovirus infettano sia i bambini che gli adulti. Sebbene questi virus siano stati identificati anche negli animali, la possibile trasmissione zoonotica non è stata dimostrata in modo conclusivo. Il lavoro sperimentale condotto durante il Dottorato di Ricerca è stato focalizzato sullo studio degli aspetti biologici ed epidemiologici dell’infezioni causate da HEV e da calicivirus. Per la prima volta in Italia, i risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza del virus HEV nei fegati di suini in fase di macellazione ed hanno confermato, attraverso la ricerca di anticorpi, un’elevata esposizione degli animali al virus. Inoltre, mediante la produzione di antigeni e reattivi immunologici, sono stati messi a punto test diagnostici per la ricerca di anticorpi contro HEV nel suino e nei cinghiali. Il lavoro svolto per la ricerca di calicivirus nel suino e nel bovino ha dimostrato la circolazione dei sapovirus in popolazioni di suini asintomatici e la presenza di norovirus nei vitelli affetti da diarrea acuta.Sono stati inoltre sviluppati reattivi immunologici, utilizzando proteine del capside di norovirus umano e bovino espresse con il sistema ricombinante baculovirus. Questi hanno permesso di evidenziare la presenza di anticorpi contro norovirus umano e bovino, in sieri di veterinari professionalmente esposti. Inoltre, sono stati utilizzati per sviluppare metodi per la concentrazione dei virus da matrici a bassa concentrazione.Infine, le VLP sono state utilizzate per valutare l’attivazione del sistema immunitario umano ex vivo. I risultati hanno dimostrato che le VLP di NoV stimolano il sistema immunitario attivando risposte di tipo Th1 e Th2 .

Valutazione clinica, clinicopatologica e quantificazione di IgG e IgM in corso di leishmaniosi canina: studio retrospettivo

La leishmaniosi canina (LCan) causata da Leishmania infantum rappresenta un’importante zoonosi in molte aree del mondo ed il cane rappresenta il principale reservoir del parassita per l’uomo. Il tipo di risposta immunitaria che i soggetti colpiti mettono in atto condiziona fortemente la progressione della malattia: animali che non sviluppano un’adeguata risposta immunitaria cellulo-mediata mostrano la sintomatologia clinica nonostante abbiano una forte ma inefficace risposta umorale che contribuisce al peggioramento della sintomatologia clinica. L’obbiettivo dello studio è stato quello valutare da un punto di vista descrittivo il segnalamento, i segni clinici e clinicopatologici dei pazienti affetti da leishmaniosi portati in visita presso il Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie nel periodo compreso da Gennaio 2002 a Marzo 2012 con particolare attenzione sull’impatto della patologia renale e dell’anemia nel quadro clinico della LCan. In base ai risultati ottenuti è stato possibile affermare che la leishmaniosi canina è una patologia relativamente frequente nella nostra realtà clinica universitaria e che presenta caratteristiche cliniche e clinicopatologiche simili a quelle riportate in letteratura. I nostri risultati preliminari suggeriscono che in questa malattia il coinvolgimento renale e le conseguenze sistemiche che ne derivano possono essere predominanti a livello clinico e laboratoristico. La gravità del quadro clinico appare associata in maniera significativa all’entità della risposta umorale e del successivo coinvolgimento glomerulare nel contesto di una risposta infiammatoria sistemica cronica. Successivamente, sono state misurate le concentrazioni di IgG ed IgM in corso di follow-up in alcuni dei soggetti inclusi nello studio e sottoposti a differenti trattamenti anti-leishmania. Dai risultati preliminari ottenuti nel nostro lavoro è stato possibile affermare che in corso di trattamento le concentrazioni di tali immunoglobuline subiscono una riduzione progressiva confermando pertanto l’efficacia del trattamento anti-leishmania non solo nella remissione della sintomatologia clinica ma anche nel ripristino della normale risposta umorale.