Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

Impact du statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 sur l’efficacité anticancéreuse et antiinflammatoire de l’EGCG

L’altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) par les cellules tumorales et les cellules immunes circulantes peut mener à la neuroinflammation. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 sont un excellent modèle pour étudier et comprendre les mécanismes de signalisation moléculaires qui caractérisent le développement tumoral et métastatique. La cancérogenèse peut s’accompagner de modulations de l’expression de biomarqueurs tels que la cyclooxygénase-2 et la métalloprotéase-9. Les recherches décrites dans ce mémoire relatent l’analyse des biomarqueurs inflammatoires et invasifs régulés lors de la différenciation induite par le PMA des cellules HL-60 en macrophages. Le statut de différenciation cellulaire pourrait avoir un impact sur les gènes cibles de la voie NF-κB. Nous émettons l’hypothèse que le PMA active la voie NF-κB et que cette signalisation peut être renversée par l’(-)-épigallocatéchine-gallate (EGCG). En effet, une régulation à la hausse de l’expression de plusieurs gènes combinée à la diminution de l’expression d’IκB mettent en évidence l’implication de la voie NF-κB dans l’activation des mécanismes pro-inflammatoires et pro-invasifs. Les mêmes observations sont faites dans les cellules différenciées appelées «macrophages-like». L’EGCG, un polyphénol dérivé du thé vert, a un potentiel chimiopréventif. Il est capable d’inhiber la signalisation moléculaire passant par la voie NF-κB dans les cellules HL-60 traitées simultanément par l’EGCG et le PMA, mais pas dans les cellules «macrophages-like». Cette différence peut s’expliquer par une modulation de l’expression du récepteur de surface cellulaire de l’EGCG, le récepteur à la laminine de 67 kDa, et de son précurseur de 37 kDa. Collectivement, nos résultats montrent que le statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 concorde avec l’activation des mécanismes favorisant le développement d’un cancer et des métastases. Cet effet peut être prévenu par l’utilisation d’agents naturels tel l’EGCG. Le ciblage de biomarqueurs liés au statut de différenciation des cellules tumorales impliquées dans la perturbation de la barrière hématoencéphalique qui cause la neuroinflammation permettrait l’avancement des connaissances dans la prévention de la cancérogenèse.

Antiobesity and antidiabetic activity of P. balsamifera, its active Salicortin, and L. laricina, medicinal plants from the traditional pharmacopoeia of the James Bay Cree

La prévalence de l’obésité, du diabète de type 2, et du syndrome métabolique, sont à la hausse chez les Cris d’Eeyou Istchee (CEI-Nord du Québec). Ces problèmes sont aggravés par leur diète non traditionnelle, leur sédentarité, ainsi que par une résistance culturelle aux produits pharmaceutiques. Afin de développer des traitements antidiabétiques culturellement adaptés, notre équipe a effectué une enquête ethnobotanique qui a identifié 17 plantes provenant de la pharmacopée traditionnelle des CEI. À partir des études de criblage effectuées in vitro, deux plantes parmi les 17 ont attiré notre attention. Populus balsamifera L. (Salicaceae) pour ses propriétés anti-obésité et Larix laricina K. Koch (Pinaceae) pour ses propriétés antidiabétiques. P. balsamifera et son composé actif salicortin ont inhibé l’accumulation de triglycérides durant l’adipogénèse dans les adipocytes 3T3-L1. L. laricina a augmenté le transport de glucose et l’activation de l’AMPK dans les cellules musculaires C2C12, l’adipogénèse dans les 3T3-L1 et a démontré un fort potentiel découpleur (propriété anti-obésité). Les objectifs de cette thèse sont d'évaluer les potentiels anti-obésité et antidiabétique et d’élucider les mécanismes d'action de P. balsamifera, salicortin, et L. laricina chez la souris C57BL/6 rendue obèse par une diète riche en gras (HFD). Les souris ont été soumises pendant huit (étude préventive) ou seize semaines (étude traitement) à une HFD, ou à une HFD dans laquelle P. balsamifera, salicortin, ou L. laricina a été incorporé soit dès le départ (prévention), ou dans les 8 dernières des 16 semaines d'administration de HFD (traitement). iv Les résultats démontrent que P. balsamifera (dans les deux études) et salicortin (évalué dans l’étude traitement) diminuent: le poids corporel, le gras rétropéritonéal, la sévérité de la stéatose et l’accumulation de triglycérides hépatique (ERK impliqué), les niveaux de glycémie et d'insuline, et le ratio leptine/adiponectine. Dans les deux études, P. balsamifera a significativement réduit la consommation de nourriture mais cet effet coupe-faim nécessite d’être approfondi. Dans l'étude préventive, P. balsamifera a augmenté la dépense énergétique (hausse de la température à la surface de la peau et de l’activation de la protéine découplante-1; UCP-1). Les voies de signalisation activées par P. balsamifera et par salicortin (de façon plus modeste) sont impliquées dans: la production de glucose hépatique (Akt), l’expression de Glut4 dans le muscle squelettique, la captation du glucose et du métabolisme des lipides (Akt dans le tissu adipeux), la différenciation des adipocytes (ERK et PPARg), l’inflammation dans le foie (IKKαβ), et l'oxydation des acides gras dans le muscle, le foie, ou le tissu adipeux (PPARa et CPT-1). D’autre part, L. laricina a également diminué les niveaux de glycémie et d’insuline, le ratio leptine/adiponectine, le gras rétropéritonéal et le poids corporel. Ces effets ont été observés en conjonction avec une augmentation de la dépense énergétique: hausse de température à la surface de la peau (prévention) et amélioration de la fonction mitochondriale et de la synthèse d'ATP (traitement). En conclusion, l’utilisation de P. balsamifera, salicortin et L. laricina comme des traitements alternatifs et culturellement adaptés aux CEI représente une contribution importante dans la prévention et le traitement de l’obésité et du diabète.

Étude du trafic du récepteur delta-opiacé suite à sa stimulation par différents agonistes

Les opiacés figurent parmi les analgésiques les plus puissants pour le traitement des douleurs sévères. Les agonistes du DOR (récepteur delta opiacé) induisent moins d'effets secondaires que ceux du mu, ce qui les rend une cible d'intérêt pour le traitement des douleurs chroniques. Cependant, ils induisent la tolérance à l'analgésie. Des hypothèses récentes proposent que le potentiel des drogues à induire la tolérance soit la conséquence de la stabilisation de différentes conformations du récepteur induites par la liaison avec différents ligands, chacune ayant différentes propriétés de trafic. Dans ce contexte, nous avons déterminé si différents ligands du DOR différaient dans leur capacité à induire la signalisation et le trafic du récepteur. Nos résultats indiquent que DPDPE et SNC-80 sont les drogues les plus efficaces à inhiber la production d’AMPc, suivis par UFP-512, morphine et TIPP. DPDPE et SNC-80 induisent à eux seuls l’internalisation du DOR dans les cellules HEK-293 de façon dépendante de la β-arrestine mais pas de la GRK2 ni PKC. Ces deux drogues induisent également l’internalisation du DOR dans les neurones corticaux et c’est seulement le DPDPE qui permet au DOR de regagner la membrane des cellules HEK-293 et des neurones après récupération. Cette capacité de recyclage était suggérée comme un mécanisme protégeant contre la survenue de la tolérance. Ces observations indiquent que le DOR peut subir différentes régulations en fonction du ligand lui étant associé. Cette propriété de sélectivité fonctionnelle des ligands pourrait être utile pour le développement de nouveaux opiacés ayant une activité analgésique plus durable.

Implication du peptide ScRALF3 dans le développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense

La coordination du développement par les communications intercellulaires est essentielle pour assurer la reproduction chez les plantes. Plusieurs études démontrent qu’une communication entre le sac embryonnaire et le tissu maternel, le sporophyte, est essentielle au bon développement des gamètes. Les molécules, peptides ou autres protagonistes impliqués dans ces voies de signalisation ainsi que leur mode d’action restent toutefois nébuleux. Les gènes de type RALF codent pour des petits peptides sécrétés retrouvés de manière spécifique ou ubiquitaire dans la plante. Leur structure en font de parfaits candidats pour permettre ces communications cellule-cellule entre les différents tissus. Treize gènes de type RALF ont été isolés actuellement chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Maintenant, nous montrons qu’un de ceux-ci, ScRALF3, est impliqué dans la polarisation du sac embryonnaire et dans la synchronicité des divisions mitotiques assurant la formation d’un gamétophyte femelle mature fonctionnel. Étant exprimé de manière spécifique au niveau des téguments de l’ovule, ScRALF3 est un candidat idéal pour réguler les communications cellule-cellule entre le sporophyte et le sac embryonnaire.

Caractérisation du motif acidique de la sous-unité p28 de l’IL-27 et étude des propriétés partagées entre cette protéine, le CNTF, CLC/CLF et l’interleukine-6

L’interleukine 6 (IL-6) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans l’inflammation. Son récepteur (IL-6R) est composé de la chaîne non signalétique IL-6Rα et de la chaîne transductrice du signal gp130, commune aux cytokines de la famille IL-6. La liaison de l’IL-6 à son récepteur permet l’activation de plusieurs voies de signalisation, notamment des voies Jak/STAT1 et préférentiellement Jak/STAT3. De façon complémentaire, nous avons démontré que l’IL-6 est capable d’activer la voie Jak/STAT5 dans les lymphocytes T CD4. L’activation de cette voie de signalisation pourrait être impliquée dans le rétrocontrôle des effets pro-inflammatoires de l’IL-6 sur les cellules T CD4. Le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) et la « cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 » (CLC/CLF) sont deux cytokines de la famille de l’IL-6 qui signalent à travers un récepteur commun, le récepteur au CNTF (CNTFR), composé du CNTFRα, « leukaemia inhibitory factor receptor β » (LIFRβ) et gp130. Toutes deux exercent des actions au niveau du système immunitaire, or la chaîne CNTFRα de leur récepteur n’y est pas exprimée. Il a été montré que le CNTFR humain peut également activer un récepteur formé des sous-unités IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Nous avons comparé les effets du CNTF et du CLC/CLF de souris sur des transfectants exprimant LIFRβ et gp130 et les chaines α connues de la famille IL-6 (IL-6Rα, IL-11Rβ et CNTFRα). Nos résultats indiquent que le CNTF de souris, comme le CNTF humain est capable d’activer un récepteur formé de l’IL-6Rα, LIFRβ et gp130. Toutefois cette propriété n’est pas partagée par CLC/CLF et le récepteur impliqué dans les effets de cette cytokine sur le système immunitaire reste donc à identifier. L’IL-27 appartient à la famille de l’IL-6 composée d’une sous-unité cytokinique, p28, associée à un récepteur soluble « l’Epstein-Barr virus-induced gene 3» (EBI3). La sous-unité p28 peut s’associer avec le récepteur soluble CLF pour former une cytokine capable d’activer les lymphocytes T. Dans le but de caractériser cette cytokine, nous avons montré que p28/CLF agit aussi sur les lymphocytes B et permet leur différenciation en plasmocytes. Le partage de l’IL-6R par l’IL-6 et p28/CLF semble être à l’origine de la similarité des effets de ces deux cytokines. De plus, nous avons observé des effets semblables à ceux de l’IL-6 suite à l’association de la sous-unité p28 seule avec la chaîne IL-6Rα. En effet, afin de mieux caractériser la cytokine p28/CLF, nous avons étudié les effets dus au recrutement de la chaîne IL-6Rα par la sous-unité p28. Les cytokines de la famille de l’IL-6 sont composées de quatre hélices α disposées de façon anti-parallèle deux à deux. La sous-unité p28 possède, au niveau d’une boucle reliant deux hélices α, un motif de plusieurs acides glutamiques consécutifs (motif polyE) qui n’est retrouvé dans aucune autre cytokine de cette famille. Nous avons démontré que ce motif est impliqué dans la liaison de cette sous-unité avec l’hydroxyapatite et l’os. Cette caractéristique de p28 pourrait permettre un ciblage de l’IL-27 (p28/EBI3) et de p28/CLF préférentiellement vers la niche endostéale des cellules souches et des cellules immunitaires.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

Caractérisation cytogénétique et moléculaire des translocations chromosomiques dans la phase blastique de la leucémie myéloïde chronique

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie.

Nur77 au sein des désordres dopaminergiques inhérents à la schizophrénie, la maladie de Parkinson ou la dépendance aux drogues d'abus

Cette thèse vise à mieux comprendre le rôle du facteur de transcription Nur77 au sein des fonctions physiologiques et pathologiques des voies de neurotransmission dopaminergiques des gaglions de la base. Nous basant sur une implication motrice de Nur77 au sein des dyskinésies induites à la L-DOPA (LIDs), nous avons voulu tester in vivo son implication éventuelle dans les phénomènes moteurs et de sensibilisation associés à l’amphétamine ainsi qu’une implication possible du récepteur nucléaire aux rétinoïdes RXR dont nous avons déjà démontré une implication dans les effets moteurs des antipsychotiques. Un deuxième volet de la recherche à consisté en l’étude de l’implication des extracellular signal-regulated kinase (ERK) et de la protéine kinase C (PKC) dans l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs suite à l’activation des cascades de signalisation des récepteurs dopamiergiques D1 et D2 in vivo pour une meilleure compréhension des mécanismes physiopatholoiques liés aux désordres dopaminergiques. Pour ce faire, nous avons, premièrement, soumis des souris sauvages et Nur77-/- à un paradigme de sensibilisation à l’amphétamine ainsi qu’a différents agonistes antagonistes RAR/RXR afin de tester l’implication de Nur77 et d’un éventuel complexe Nur77/RXR dans les effets de l’amphétamine. Deuxièmement, soumis des souris sauvages à une combinaison d’agonistes D1/D2 ou une injection d’antagoniste D2 avec ou sans inhibiteur (ERK1/2 ou PKC) afin de tester l’implication de ces kinases sur l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs par hybridation in situ. Nous avons ainsi pu démontrer 1- un rôle moteur de Nur77 dans les effets liés à l’amphétamine notamment avec une absence de stéréotypies et un allongement de la durée de la phase de locomotion chez les souris Nur77-/-; ainsi qu’un rôle éventuel du complexe potentiel Nur77/RXR dans les D1 à mieux définir. 2- un rôle des kinases ERKs et PKCs dans les cascades de signalisation des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 menant à l’induction des ARNms de Nur77, Nor-1 et Nurr-1. En perspective, ces résultats nous ouvrent la voie vers une implication éventuelle de Nur77 dans les mécanismes d’apprentissage que sont le Long Terme Potentiation (LTP) et la Long Terme Depotentialisation (LTD) liés aux LIDs et à l’amphétamine.

Anti-VEGFA therapy reduces tumor growth and extends survival in a murine model of ovarian granulosa cell tumor

Les tumeurs des cellules de la granulosa (GCTs) sont des tumeurs avec un potentiel malin ayant tendance à récidiver, provoquant ainsi la mort dans 80% des cas de stade avancé consécutif à une rechute. Bien que les GCTs représentent 5% des tumeurs ovariennes, peu d’études ont évalué les protocoles de traitement adjuvant pour la maladie avancée ou récurrente. Notre but était d’évaluer l’efficacité de la voie de signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) comme cible pour le traitement de la GCT utilisant le modèle murin transgénique Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA) qui reproduit le stade avancé de la maladie humaine. Un anticorps anti-VEGFA a été administré une fois par semaine par voie intrapéritonéale (IP) à partir de 3 semaines d’âge. La thérapie anti-VEGFA a permis une réduction de la taille des tumeurs à 6 semaines d’âge (p<0.05) et une prolongation de la survie des animaux traités, lorsque comparé aux animaux contrôles. L’analyse des GCTs a montré une réduction significative de la prolifération cellulaire (p<0.05) et de la densité microvasculaire (p<0.01) mais aucune différence significative n’a été détectée dans l’apoptose cellulaire. p44/p42 MAPK, un effecteur de la signalisation pour le récepteur 2 de VEGFA (VEGFR2) associé à la prolifération cellulaire, était moins activé dans les tumeurs traitées (p<0.05). Par contre, l’activation d’AKT, un effecteur impliqué dans la survie cellulaire, était similaire d’un groupe à l’autre. Ces résultats suggèrent que l’anticorps anti-VEGFA réduit la prolifération cellulaire et la densité microvasculaire chez les souris PCA par inhibition de la voie de signalisation VEGFR2-MAPK, inhibant ainsi la croissance tumorale. En conclusion, l’efficacité de la thérapie anti- VEGFA mérite d’être évaluée en essais contrôlés randomisés pour le traitement des GCTs chez l’homme.

Rôle de la déubiquitinase BAP1 dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle central dans divers processus biologiques. Elle peut être contrecarrée par les déubiquitinases (DUBs). "BRCA1-Associated Protein 1" (BAP1) est une déubiquitinase, qui fait partie de complexes multiprotéiques, possèdant une fonction de suppression tumorale ainsi qu'un potentiel anti-métastatique. De plus, BAP1 est phosphorylée suite aux dommages à l’ADN par les kinases ATM/ATR. En nous basant sur ces données, nous avons purifié les protéines associées à BAP1 dans des conditions de stress génotoxique. Bien que la composition du complexe et l’activité DUB semblent inchangées, nous avons pu identifier des changements critiques dans les niveaux et les sites de phosphorylation, confirmant la régulation de BAP1 suite aux dommages à l’ADN. En déplétant BAP1 par ARNi et en utilisant des mutants dominants négatifs, nous avons obtenu des résultats suggèrant que suite au stress génotoxique, cette DUB est requise pour prolonger le point de contrôle en G2/M et ce, en retardant la reprise du cycle cellulaire. D'un autre côté, l'expression de BAP1 dans des cellules cancéreuses qui en sont déficientes restore une ploïdie normale et diminue la fréquence d'aberrations nucléaires, suggérant que cette protéine joue un rôle dans la stabilité génomique. Nos résultats suggèrent fortement que BAP1 joue un rôle dans la réponse des cellules au stress génotoxique et la stabilité génomique. Nos travaux permettront ainsi d’identifier et de caractériser les voies de signalisation cellulaire régulant l’activité et la fonction de BAP1 durant les périodes d’exposition à des agents qui endommagent l’ADN. Les connaissances acquises seront donc d’une valeur tangible pour nôtre compréhension de la mutagenèse induite par des agents carcinogènes, un déterminant clé de la formation des tumeurs.

Le rôle et la régulation du pyroglutamylated RF-amide peptide dans le tissu adipeux lors de l’obésité

L’obésité est définie comme un surplus de masse adipeuse. Cette condition représente un problème de santé publique devenu pandémique dans les pays industrialisés. Elle prédispose à des maladies potentiellement mortelles comme le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique non-alcoolique. L’accumulation du tissu adipeux intra-abdominal, formé d’adipocytes, est corrélée avec la résistance à l’insuline. L’augmentation de la masse adipeuse se fait par l’hyperplasie des préadipocytes, la différenciation des préadipocytes en adipocytes et l’hypertrophie des adipocytes. La différenciation des préadipocytes se fait selon l’adipogenèse qui est régulée par une multitude de facteurs, mais qui est inhibée pas les stimuli inflammatoires qui sont aussi responsables de la résistance à l’insuline et de l’apparition des problèmes de santé liés à l’obésité. Nous avons identifié un nouveau système de régulation autocrine/paracrine de l’adipogenèse dans les cellules du tissu adipeux. Le pyroglutamylated RF-amide peptide (QRFP), qui était connu pour son rôle dans la régulation de l’appétit, est un activateur de l’adipogenèse par l’activation de son récepteur, le G protein-coupled receptor 103 (GPR103). Le QRFP est exprimé dans les macrophages et les adipocytes alors que le GPR103 de sous-type b est exprimé dans les adipocytes seulement. Un traitement des adipocytes avec le QRFP augmente le captage des acides gras, l’accumulation de lipides ainsi que l’expression et l’activité de l’enzyme LPL. Le QRFP augmente aussi l’expression des gènes des transporteurs d’acides gras CD36 et FATP1, de l’enzyme activatrice d’acides gras ACSL1 et des facteurs de transcription PPAR-γ et C/EBP-α, qui sont tous impliqués dans l’adipogenèse. En plus de ses effets sur l’adipogenèse, le QRFP possède aussi un effet inhibiteur sur l’activité lipolytique induite par les catécholamines. Nous avons montré que l’expression du QRFP est diminuée dans le tissu adipeux des souris obèses. Selon nos résultats, cette diminution pourrait être expliquée par une augmentation des endotoxines circulantes chez les obèses, appelée endotoxémie métabolique, qui agirait, entre autres, par l’induction des interférons dans les macrophages. Les voies de signalisation de ces effets ont aussi été identifiées. Nous avons montré un autre exemple de stimulus inflammatoire qui régule les signaux adipogènes à la baisse.

Identification des bases génétiques des myopathies à multi-minicores avec ou sans cardiomyopathie

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.