Développement de matériaux à base de protéines extraites du byssus de la moule bleue Mytilus edulis

Le byssus est un amas de fibres que les moules produisent afin de s’ancrer aux surfaces immergées sous l’eau. Ces fibres sont pourvues de propriétés mécaniques impressionnantes combinant rigidité, élasticité et ténacité élevées. De plus, elles possèdent un comportement d’auto-guérison de leurs propriétés mécaniques en fonction du temps lorsque la contrainte initialement appliquée est retirée. Les propriétés mécaniques de ces fibres sont le résultat de l’agencement hiérarchique de protéines de type copolymère blocs riches en collagène et de la présence de métaux formant des liens sacrificiels réversibles avec certains acides aminés comme les DOPA et les histidines. Bien que cette fibre soit très intéressante pour la production de matériaux grâce à son contenu élevé en collagène potentiellement biocompatible, cette ressource naturelle est traitée comme un déchet par les mytiliculteurs. L’objectif de cette thèse était de valoriser cette fibre en extrayant les protéines pour générer une nouvelle classe de matériaux biomimétiques. Un hydrolysat de protéines de byssus (BPH) riche en acides aminés chargés, i.e. ~30 % mol, et permettant de former des films a pu être généré. Lorsque solubilisé à pH 10.5, le BPH forme un hydrogel contenant des structures en triple hélice de collagène et des feuillets β anti-parallèles intra- et inter-moléculaires. Suite à l’évaporation de l’eau, le film de BPH résultant est insoluble en milieu aqueux à cause des structures secondaires très stables agissant comme points de réticulation effectifs. Les propriétés mécaniques des films de BPH sont modulables en fonction du pH. Au point isoélectrique (pI = 4.5), les interactions électrostatiques entre les charges opposées agissent comme points de réticulation et augmentent la rigidité des films et leur contrainte à la rupture sans affecter la déformation à la rupture. À pH plus élevé ou plus bas que le pI, les performances mécaniques des films sont plus faibles à cause de la répulsion entre les groupements fonctionnels de même charge qui interagissent plutôt avec les molécules d’eau et causent le gonflement de la matrice protéique des films. Le BPH contenant un nombre élevé d’acides aminés chargés et réactifs, nous avons pu réticuler les films de manière covalente à l’aide d’EDC ou de glutaraldéhyde. Les propriétés mécaniques des films sont modulables en fonction de la concentration d’EDC utilisée lors de la réticulation ou en employant du glutaraldéhyde comme agent réticulant. Les films sont à la fois plus rigides et plus forts avec un degré de réticulation élevé, mais perdent leur extensibilité à mesure que les segments libres de s’étirer lors d’une traction deviennent entravés par les points de réticulation. La réticulation augmente également la résistance à la dégradation enzymatique par la collagénase, les films les plus fortement réticulés lui étant pratiquement insensibles. La spectroscopie infrarouge montre enfin que la réticulation entraîne une transition de feuillets β anti-parallèles inter-moléculaires vers des structures de type hélices de collagène/PPII hydratées. Des liens sacrificiels ont été formés dans les films de BPH par traitement au pI et/ou avec différents métaux, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, afin de moduler les propriétés mécaniques statiques et d’évaluer le rôle de ces traitements sur le comportement d’auto-guérison lors de tests mécaniques cycliques avec différents temps de repos. Plus la valence des ions métalliques ajoutés augmente, plus les propriétés mécaniques statiques affichent un module, une contrainte à la rupture et une ténacité élevés sans toutefois affecter la déformation à la rupture, confirmant la formation de liens sacrificiels. Les tests mécaniques cycliques montrent que les traitements au pI ou avec Ca2+ créent des liens sacrificiels ioniques réversibles qui mènent à un processus d’auto-guérison des performances mécaniques dépendant du pH. L’ajout de Fe3+ à différentes concentrations module les performances mécaniques sur un plus large intervalle et la nature plus covalente de son interaction avec les acides aminés permet d’atteindre des valeurs nettement plus élevées que les autres traitements étudiés. Le Fe3+ permet aussi la formation de liens sacrificiels réversibles menant à l’auto-guérison des propriétés mécaniques. Les spectroscopies Raman et infrarouge confirment que le fer crée des liaisons avec plusieurs acides aminés, dont les histidines et les DOPA. Les résultats dans leur ensemble démontrent que les films de BPH sont des hydrogels biomimétiques du byssus qui peuvent être traités ou réticulés de différentes façons afin de moduler leurs performances mécaniques. Ils pourraient ainsi servir de matrices pour des applications potentielles dans le domaine pharmaceutique ou en ingénierie tissulaire.

Evaluación del efecto antitumoral de una fusoquina compuesta por ip10 y linfotactina en un modelo murino de cáncer de cérvix

El término “fusoquina” se utiliza para denominar a las proteínas de fusión compuestas por dos diferentes citocinas. Las citocinas son una familia de proteínas y glicoproteínas solubles que controlan la activación, proliferación e incluso la muerte celular programada de células del sistema inmune. Debido a su participación natural como inmunomoduladores se ha investigado su importancia en la regulación de microambiente tumoral. Dos de las quimiocinas que se han estudiado son IP10 y linfotactina. En nuestro equipo de trabajo se construyó previamente un vector adenoviral que expresa la fusión de estas quimiocinas. Por lo que el propósito de este trabajo fue evaluar el efecto antitumoral y antiangiogénico de este adenovirus. Para esto se produjeron las partículas virales a gran escala, se purificaron y cuantificaron por el método de punto final en placa. El modelo in vivo que se utilizó fue la cepa de ratón C57BL/6 y la línea tumoral de pulmón TC-1. Para determinar si el Ad-FIL incrementa el efecto antitumoral de la vacuna de DNA CRT/E7, los ratones fueron sensibilizados con ésta vacuna y posteriormente se les administraron los tratamientos Ad-Vacío, Ad-IP10, Ad-LPTN, Ad-IP10 + Ad-LPTN o Ad-FIL. Para le evaluación del efecto antiangiogénico los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores, estos fueron procesados por la técnica histológica y se llevó a cabo una inmunohistoquímica para el marcador de vasos CD31. Finalmente se realizó un ensayo antitumoral empleando las mismas construcciones en un contexto de vacunas de DNA, para esto se emplearon dos grupos de ratones, uno de los grupos de ratones recibieron ambas vacunas de DNA (CRT/E7 + quimiocinas) mientras que el otro grupo de ratones recibieron solamente las quimocinas. La fusoquina FIL compuesta por IP10 y Linfotactina no presentó efecto antitumoral en el modelo estudiado; sin embargo, si presentó un efecto antiangiogénico significativo. Se deberá estudiar esta fusoquina en otros modelos y condiciones para continuar evaluando su efecto biológico, así como su utilidad al administrarla en combinación con otros tratamientos.

Expresión génica diferencial y antioxidantes en la planta de tomate (Solanum lycopersicon L. Mill) enriquecida con selenio

La biofortificación tiene como finalidad incrementar la concentración de elementos biodisponibles en las plantas de cultivo para elevar la calidad nutricional. El selenio es un elemento traza de gran impacto para el metabolismo antioxidante de las plantas y su acumulación es pobre en especies como el tomate, de igual manera este elemento es esencial para los humanos, por lo que adicionarlo en las plantas forma parte de los programas de biofortificación. El propósito de este trabajo fue analizar experimentalmente la capacidad del selenito de sodio para incrementar la concentración de Se y modificar la actividad antioxidante en plantas de tomate. Para ello se usaron plantas de la variedad híbrido Toro y se aplicaron tres tratamientos 0, 2 y 5 mg L-1 de selenito de sodio (Na2SeO3) utilizando como vehículo el agua de riego, los tratamientos fueron aplicados bajo un diseño experimental completamente al azar. Se llevaron a cabo tres muestreos 40, 80 y 120 días después del trasplante y la subsecuente cuantificación de la acumulación de selenio y macronutrientes en hojas, tallos y frutos así como su impacto en la producción de frutos bajo un diseño experimental completamente al azar. Se determinó la altura de la planta, los diámetros de tallos, firmeza, sólidos solubles de frutos y la materia seca total de los diferentes tejidos. Se obtuvo una cuantificación del potencial oxido reducción y de la actividad de antioxidante específicos como la catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa, el ácido ascórbico y licopeno, para cada variable se llevó a cabo un análisis de varianza y posteriormente una prueba de comparación de medias de Tukey. La expresión de los genes cat, gpx, sod, apx y lic en los frutos fue también analizada y en este caso se aplicó un análisis de varianza no paramétrico de Fisher, para encontrar las diferencias entre tratamientos. Los resultados mostraron un incremento en la acumulación de Se, encontrándose hasta un 53.1% de aumento en la concentración en los frutos bajo el tratamiento 5 mg L-1 en comparación con el testigo, sin embargo, este incremento no tuvo un impacto notorio en la producción y el rendimiento del tomate, a pesar de la existencia de una correlación de Spearman positiva (r =0.9637) entre la producción de fruto y la concentración de Se. Los valores del potencial oxido-reducción se redujeron en promedio desde -41.4 mV para el tratamiento testigo y hasta -68.0 mV con el mayor tratamiento. Mientras tanto, la concentración de Se si influyó positivamente en los parámetros de calidad incluyendo el ácido ascórbico (hasta un 50 % de aumento con el tratamiento 5 mgL-1 ) y el licopeno (hasta un 66.9% de aumento con el mayor tratamiento). La actividad de las enzimas antioxidantes aumentó notablemente en el fruto con el tratamiento 5 mg L-1 de selenito encontrándose 60.9% de aumento para CAT, 33.4% para GPX y 26.0% para SOD. En cuanto la expresión génica hubo mayor nivel de transcriptos de los genes gpx, sod y apx bajo el tratamiento 2 mg L-1

Caracterización y cuantificación de flavonoides en dos especies de Petroselinum con diferentes tratamientos térmicos

En México se consumen dos especies de perejil (Petroselinum crispum y Petroselinum sativum), los cuales contienen diferentes compuestos bioactivos entre los que destacan los flavonoides (apíina, luteolina, apigenina y algunos glucósidos), aceites esenciales (apiol y miristicina), cumarinas (bergapteno, imperatorina, xantotoxina, trioxaleno y angelicina). Estos compuestos fenólicos han demostrado efectos antioxidantes en investigaciones in vitro y se observó el papel importante en la prevención de la patogénesis de algunas enfermedades y su interacción en la inhibición o disminución de radicales libres. La apigenina, el flavonoide mayoritario del perejil, tiene capacidad de inhibir mutaciones en las células de mama, riñón y próstata y efectos antiproliferativos en cáncer de colon, pulmón y melanoma de acuerdo a reportes científicos. Existe evidencia de que los compuestos fenólicos sufren cambios que afectan su biodisponibilidad por acción del calor, también existen reportes de que el calor potencializa el contenido de polifenoles en algunos alimentos, no existe información científica sobre las especies de perejil producidos y consumidos en México, los flavonoides que contienen y sus mecanismos de acción y las características estructurales de los compuestos bioactivos, requeridas para demostrar sus actividades biológicas. Por lo que es pertinente investigar si las especies de perejil que se consumen en nuestro país contienen los compuestos que han sido reportados en otras variedades. Objetivo: Caracterizar y cuantificar el contenido de flavonoides en dos especies de perejil (Petroselinum sativum y Peroselinum crispum) cultivadas en México y evaluar el efecto causado por tratamientos térmicos. Métodos: Se analizaron dos especies de perejil fresco y 12 días después (estado de senescencia). El perejil fresco se sometió a dos tratamientos térmicos: a) inmersión (agua destilada a 100 °C) y se tomaron muestras a 1, 5, 15 y 30 minutos y b) cocción a vapor durante 5, 15 y 30 minutos, como control se estudió el perejil sin ningún tratamiento (0 minutos). Las pruebas que se realizaron fueron la determinación de polifenoles totales, flavonoides totales, pruebas fitoquímicas coloridas para la identificación de grupos funcionales y la identificación y cuantificación de flavonoides por HPLC. Resultados: El contenido de polifenoles, flavonoides y apigenina se encontró principalmente en el extracto líquido debido a que se encontraban en forma de glucósidos los cuales son solubles en agua. Entre las especies de perejil en estado fresco se encontró diferencia significativa (p<0.05) en el contenido de flavonoides totales y apigenina pero no de polifenoles totales. En los productos en estado de senescencia no se encontró diferencia significativa entre las especies en el contenido de polifenoles y flavonoides totales, pero si en el contenido de apigenina. El flavonoide mayoritario en las dos especies de perejil fue la apigenina. Se observó que los tratamientos térmicos aumentan el contenido de compuestos fenólicos, los tiempos prolongados de calor reducen el contenido de estos compuestos bioactivos. Al comparar los tratamientos térmicos se encontró que el mayor incremento de polifenoles, flavonoides y apigenina en el tratamiento térmico por inmersión en agua durante un minuto, siendo mayor en la especie Petroselinum crispum respecto a la muestra control (3 veces en polifenoles totales, 19 veces en flavonoides totales y 135 veces en apigenina). Conclusión: Al comparar el contenido de polifenoles totales de las especies de perejil estudiada con investigaciones de otros países se encontró que el P. crispum presenta un mayor contenido de polifenoles y flavonoides. Los flavonoides en las dos especies de perejil se encuentran en forma de glicósidos principalmente de apigenina. Por último, podemos deducir que los métodos de cocción tienen capacidad de incrementar el contenido de compuestos fenólicos en el perejil.

Caracterización del mucilago de cacao CCN 51 mediante espectrofotometría UV-visible y absorción atómica” caso: Ecuador-zona 6

Más de 12000 m3 de mucilago de cacao CCN-51 son producidos y abandonados en las fincas de cacao en el Ecuador cada año. El estudio tiene como objetivo caracterizar este residuo en la Zona 6. Las muestras se obtuvieron de 10 lugares dentro de la zona de estudio, las mismas que están geo referenciadas. Para el análisis se usó espectrofotometría UV-Visible para la identificación de azucares reductoras totales, y espectrofotometría de absorción atómica para identificar minerales. Además se determinó parámetros físicos. Los resultados de los análisis fueron los siguientes: pH 4.05±0.004, los sólidos solubles fue de 17.15±0.86 0Brix, la acidez Titulable fue 245.25±21.19 meq/L. Por otra parte las azucares reductoras totales fueron de 1228.82±178.52 g/L y los de calcio, sodio y potasio fueron de 169.21±31.04 mg/L, 161.85±40.41 mg/L, 462.9±49.96 mg/L respectivamente. Se analizó una muestra mediante espectroscopia de infrarrojo para identificar glucosa y sacarosa, los resultados de este análisis fueron 398 g/L, 800g/l, posteriormente se realizó un análisis t student con el resultado obtenido en espectrofotometría UV-Visible de las azucares reductoras totales, como resultado final se estableció que no existe diferencia significativa entre las dos técnicas instrumentales.

Fonctionnalisation covalente de monocouches et bicouches de graphène

Le graphène est une nanostructure de carbone hybridé sp2 dont les propriétés électroniques et optiques en font un matériau novateur avec un très large potentiel d’application. Cependant, la production à large échelle de ce matériau reste encore un défi et de nombreuses propriétés physiques et chimiques doivent être étudiées plus en profondeur pour mieux les exploiter. La fonctionnalisation covalente est une réaction chimique qui a un impact important dans l’étude de ces propriétés, car celle-ci a pour conséquence une perte de la structure cristalline des carbones sp2. Néanmoins, la réaction a été très peu explorée pour ce qui est du graphène déposé sur des surfaces, car la réactivité chimique de ce dernier est grandement dépendante de l’environnement chimique. Il est donc important d’étudier la fonctionnalisation de ce type de graphène pour bien comprendre à la fois la réactivité chimique et la modification des propriétés électroniques et optiques pour pouvoir exploiter les retombées. D’un autre côté, les bicouches de graphène sont connues pour avoir des propriétés très différentes comparées à la monocouche à cause d’un empilement des structures électroniques, mais la croissance contrôlée de ceux-ci est encore très difficile, car la cinétique de croissance n’est pas encore maîtrisée. Ainsi, ce mémoire de maîtrise va porter sur l’étude de la réactivité chimique du graphène à la fonctionnalisation covalente et de l’étude des propriétés optiques du graphène. Dans un premier temps, nous avons effectué des croissances de graphène en utilisant la technique de dépôt chimique en phase vapeur. Après avoir réussi à obtenir du graphène monocouche, nous faisons varier les paramètres de croissance et nous nous rendons compte que les bicouches apparaissent lorsque le gaz carboné nécessaire à la croissance reste présent durant l’étape de refroidissement. À partir de cette observation, nous proposons un modèle cinétique de croissance des bicouches. Ensuite, nous effectuons une étude approfondie de la fonctionnalisation du graphène monocouche et bicouche. Tout d’abord, nous démontrons qu’il y a une interaction avec le substrat qui inhibe grandement le greffage covalent sur la surface du graphène. Cet effet peut cependant être contré de plusieurs façons différentes : 1) en dopant chimiquement le graphène avec des molécules réductrices, il est possible de modifier le potentiel électrochimique afin de favoriser la réaction; 2) en utilisant un substrat affectant peu les propriétés électroniques du graphène; 3) en utilisant la méthode d’électrogreffage avec une cellule électrochimique, car elle permet une modulation contrôlée du potentiel électrochimique du graphène. De plus, nous nous rendons compte que la réactivité chimique des bicouches est moindre dû à la rigidité de structure due à l’interaction entre les couches. En dernier lieu, nous démontrons la pertinence de la spectroscopie infrarouge pour étudier l’effet de la fonctionnalisation et l’effet des bicouches sur les propriétés optiques du graphène. Nous réussissons à observer des bandes du graphène bicouche dans la région du moyen infrarouge qui dépendent du dopage. Normalement interdites selon les règles de sélection pour la monocouche, ces bandes apparaissent néanmoins lorsque fonctionnalisée et changent grandement en amplitude dépendamment des niveaux de dopage et de fonctionnalisation.

Studies of MHC class I antigen presentation & the origins of the immunopeptidome

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer.

Generation and screening of natural product-like compounds for antibiotic discovery

Avec l’apparition de plus en plus de souches de bactérie résistante aux antibiotiques, le développement de nouveaux antibiotiques est devenu une important problématique pour les agences de santé. C’est pour cela que la création de nouvelles plateformes pour accélérer la découverte de médicaments est devenu un besoin urgent. Dans les dernières décennies, la recherche était principalement orientée sur la modification de molécules préexistantes, la méta-analyse d’organismes produisant des molécules activent et l’analyse de librairies moléculaires pour trouver des molécules synthétiques activent, ce qui s’est avéré relativement inefficace. Notre but était donc de développer de nouvelles molécules avec des effets thérapeutiques de façon plus efficace à une fraction du prix et du temps comparé à ce qui se fait actuellement. Comme structure de base, nous avons utilisé des métabolites secondaires qui pouvaient altérer le fonctionnement des protéines ou l’interaction entre deux protéines. Pour générer ces molécules, j’ai concentré mes efforts sur les terpènes, une classe de métabolites secondaires qui possède un large éventail d’activités biologiques incluant des activités antibactériennes. Nous avons développé un système de chromosome artificiel de levure (YAC) qui permet à la fois l’assemblage directionnel et combinatoire de gènes qui permet la création de voies de biosynthèse artificielles. Comme preuve de concept, j’ai développé des YACs qui contiennent les gènes pour l’expression des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la -carotène et de l’albaflavenone et produit ces molécules avec un haut rendement. Finalement, Des YACs produits à partir de librairies de gènes ont permis de créer une grande diversité de molécules.

Effet de Streptococcus Suis sur la capacité de présentation antigénique de cellules dendritiques

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Détermination de la spéciation du samarium dans l'environnement

Les éléments de terres rares (REEs) sont de plus en plus utilisés dans une multitude d’applications, notamment la fabrication d’aimants, de batteries rechargeables et les écrans de téléviseurs. Ils sont pour la plupart des métaux trivalents peu solubles dans les eaux naturelles. Comme pour les métaux divalents, le risque écologique des REEs est très probablement étroitement lié à leurs spéciations chimiques. Cependant, le comportement du samarium (Sm) dans les matrices environnementales est très peu connu et il n'existe actuellement aucune technique pour évaluer sa spéciation chimique. Dans cette optique, la technique d'échange d'ions (IET) sur la résine Dowex a été optimisée pour mesurer le samarium libre en solution. Les temps d'équilibre ont d'abord été déterminés pour des solutions tamponnées de samarium (Sm 6,7x10-8 M ; MES 1,0 mM M ; pH 6,0) en présence du nitrate de sodium (de 0,01M à 0,5 M). Pour ces diverses forces ioniques, l’équilibre thermodynamique n’est atteint que pour NaNO3 0,5M. Un autre mode d’utilisation de la résine (mode dynamique) a donc été développé pour tenir compte des conditions environnementales et évaluer efficacement le samarium libre. Les impacts des ligands organiques tels le NTA, l’EDTA, le citrate, l’acide malique et l’acide fulvique Suwannee River Standard I (SRFA) ont été étudiés par l’IET en mode dynamique. Une grande corrélation a été trouvée plus entre les taux d’accumulation de samarium sur la résine d’échange pour différents rapports NTA : Sm, EDTA : Sm, SRFA : Sm et le samarium libre. Par contre, aucune corrélation significative n’a été observée pour les ligands citrate et acide malique compte tenu des complexes qu’ils forment avec le samarium et qui s’adsorbent aussi sur la résine Dowex. Les concentrations Sm3+ mesurées par la technique IET ont été fortement corrélées avec celles prédites par le modèle WHAM 7.0 en utilisant la constante de stabilité obtenue par titration de SRFA par extinction de la fluorescence. Par ailleurs, la formation de colloïdes de samarium en fonction du pH influe grandement sur la détermination du samarium libre et doit être prise en compte dans la spéciation du samarium. L'IET assisté par des techniques auxiliaires comme le dosage par extinction de la fluorescence et le SP-ICPMS pourrait être une technique utile pour évaluer les concentrations de Sm biodisponible dans les eaux naturelles.

L'acide valproïque inhibe la progression dans le cycle cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae

L’acétylation est une modification post-traductionnelle des protéines essentielles. Elle est impliquée dans bon nombre de processus cellulaires importants comme la régulation de la structure de la chromatine et le recrutement de protéines. Deux groupes d’enzymes, soient les lysines acétyltransférases et les lysines désacétylases, régulent cette modification, autant sur les histones que sur les autres protéines. Au cours des dernières années, de petites molécules inhibitrices des désacétylases ont été découvertes. Certaines d’entre elles semblent prometteuses contre diverses maladies telles le cancer. L’acide valproïque, un inhibiteur de deux des trois classes des désacétylases, a un effet antiprolifératif chez plusieurs organismes modèles. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à cet effet restent encore méconnus. Ce mémoire met en lumière l’effet pH dépendant de l’acide valproïque sur différentes voies cellulaires importantes chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il démontre que ce composé a la capacité d’inhiber la transition entre les phases G1 et S par son action sur l’expression des cyclines de la phase G1. De plus, il inhibe l’activation de la kinase principale de la voie activée suite à un stress à la paroi cellulaire. L’acide valproïque occasionne également un arrêt dans la réplication de l’ADN sans y causer de dommage. Il s’agit là d’un effet unique qui, à notre connaissance, n’est pas observable avec d’autres agents qui inhibent la progression en phase S.

Proscillaridin A effects on histone acetylation and C-MYC degradation in acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA.

L’exploitation d’un modèle de levure présentant une déficience de l’absorption des anthracyclines révèle qu’une protéine de Caenorhabditis elegans, OCT-1, est un transporteur fonctionnel d’anthracyclines

Les anthracyclines, comme la doxorubicine (DOX) ou la daunorubicine (DNR), sont utilisées dans le traitement d’une grande variété de cancers allant des lymphomes, au cancer du sein, en passant par certaines leucémies. Encore aujourd’hui, beaucoup pensent que les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive, toutefois, la plupart de ces mêmes personnes sont d’accord pour dire que la p-glycoprotéine est responsable d’exporter ces molécules hors de la cellule. Mais pourquoi une molécule aurait besoin d’un transporteur pour sortir de la cellule, et pas pour y entrer ? Qu’est-ce qui ferait que la diffusion passive fonctionnerait dans un sens, mais pas dans l’autre, d’autant que l’entrée des anthracyclines dans les cellules est très rapide ? Nous pensons qu’il existe bel et bien un transporteur responsable de faire passer les anthracyclines du milieu extracellulaire au cytoplasme, et nous voulons développer un modèle de levure qui permettrait de déterminer si une protéine, un transporteur, issue d’un autre organisme eucaryote est en mesure de transporter la DOX à l’intérieur de la cellule. Pour ce faire, nous avons rassemblé un groupe de mutants présentant une déficience dans l’absorption d’autres molécules chargées positivement telles que la bléomycine ou le NaD1 et avons déterminé le taux d’absorption de DOX de chacun de ces mutants. Les simples mutants sam3Δ ou dur3Δ n’ont montré qu’une faible réduction de l’absorption de DOX, voire, aucune, par rapport à la souche parentale. Si le double mutant sam3Δdur3Δ a montré une réduction relativement importante de l’absorption de DOX, c’est le mutant agp2Δ qui présentait la plus grande réduction d’absorption de DOX, ainsi qu’une résistance notable à son effet létal. Nous avons utilisé, par la suite, ce mutant pour exprimer, à l’aide d’un vecteur d’expression, une protéine du ver Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). Les résultats ont montré que cette protéine était en mesure de restaurer l’absorption de DOX, compromise chez le mutant agp2Δ ainsi que d’augmenter la sensibilité de la souche parentale à son effet létal, lorsqu’exprimée chez celle-ci. Cela suggère que CeOCT-1 est un transporteur fonctionnel de DOX et contredit également le dogme selon lequel les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive.

Les récepteurs GPR91 et GPR99 et leur implication dans le développement du système nerveux visuel

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) démontrent de plus en plus de capacités à activer des mécanismes jusqu’alors associés à des facteurs de transcription ou des molécules d’adhésion. En effet, de nouvelles preuves rapportent qu’ils pourraient également participer au guidage axonal qui est le mécanisme permettant aux axones de cellules nerveuses de rejoindre leur cible anatomique. Le guidage axonal se fait par l’interaction entre les molécules de guidage et une structure particulière présente à l’extrémité de l’axone, le cône de croissance. Par exemple, les RCPGs participent au guidage des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), dont les axones s’étendent de la rétine jusqu’au noyaux cérébraux associés à la vision. Cet effet est observé avec des RCPGs tels que les récepteurs aux cannabinoïdes (CB1 et CB2) et celui du lysophosphatidylinositol, le GPR55. Les RCPGs GPR91 et GPRG99, respectivement récepteurs au succinate et à l’α-cétoglutarate, se trouvent à la surface de ces CGRs, ce qui en font des candidats potentiels pouvant participer au guidage axonal. Dans ce mémoire, l’effet des ligands de ces récepteurs sur la croissance et la navigation des axones des CGRs fut analysé. L’impact produit par ces récepteurs ainsi que leurs ligands sur la morphologie des cônes de croissance fut déterminé en mesurant leur taille et le nombre de filopodes présents sur ces cônes. Pour évaluer le rôle du succinate et de l’a-cétoglutarate sur la croissance globale des axones de CGRs, la longueur totale des projections axonales d’explants rétiniens a été mesurée. L’effet de ces ligands des récepteurs GPR91 et GPR99 sur le guidage axonal a également été évalué en temps réel à l’aide d’un gradient créé par un micro injecteur placé à 45° et à 100µm du cône de croissance. La distribution in vivo des récepteurs GPR91 et GPR99 sur la rétine a été étudié à l’aide d’expériences d’immunohistochimie. Les résultats obtenus indiquent que l’ajout de 100µM de succinate produit une augmentation de la taille des cônes de croissance et du nombre de filopodes présents à leur surface. Il augmente également la croissance des axones. Ce type de réponse fut également observé lorsque les cellules furent soumises à 200µM d’α-cétoglutarate. Fait à noter, les deux récepteurs n’ont pas d’impact sur le guidage axonal. Ces résultats indiquent donc que les agonistes des récepteurs GPR91 et GPR99 augmentent la croissance des cellules ganglionnaires lorsqu’ils sont présents lors du développement. Par contre, ils n’ont pas d’influence sur la direction prise par les cônes de croissance. Ces nouvelles données sont un pas de plus dans la compréhension des mécanismes qui gèrent et participent au développement et la croissance des CGRs, ce qui pourrait donner de nouvelles cibles thérapeutique pouvant mener à la régénération de nerfs optiques endommagés.