964 resultados para Mécanisme enzymatique
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La dtermination de la structure tertiaire du ribosome fut une tape importante dans la comprhension du mécanisme de la synthse des protines. Par contre, llucidation de la structure du ribosome comme tel ne permet pas une comprhension de sa fonction. Pour mieux comprendre la nature des relations entre la structure et la fonction du ribosome, sa structure doit tre tudie de manire systmatique. Au cours des dernires annes, nous avons entrepris une dmarche systmatique afin didentifier et de caractriser de nouveaux motifs structuraux qui existent dans la structure du ribosome et dautres molcules contenant de lARN. Lanalyse de plusieurs exemples dempaquetage de deux hlices dARN dans la structure du ribosome nous a permis didentifier un nouveau motif structural, nomm G-ribo . Dans ce motif, linteraction dune guanosine dans une hlice avec le ribose dun nuclotide dune autre hlice donne naissance un rseau dinteractions complexes entre les nuclotides voisins. Le motif G-ribo est retrouv 8 endroits dans la structure du ribosome. La structure du G-ribo possde certaines particularits qui lui permettent de favoriser la formation dun certain type de pseudo-nuds dans le ribosome. Lanalyse systmatique de la structure du ribosome et de la ARNase P a permis didentifier un autre motif structural, nomm DTJ ou Double-Twist Joint motif . Ce motif est form de trois courtes hlices qui sempilent lune sur lautre. Dans la zone de contact entre chaque paire dhlices, deux paires de bases conscutives sont surenroules par rapport deux paires de bases conscutives retrouves dans lARN de forme A. Un nuclotide dune paire de bases est toujours connect directement un nuclotide de la paire de bases surenroule, tandis que les nuclotides opposs sont connects par un ou plusieurs nuclotides non apparis. Lintroduction dun surenroulement entre deux paires de bases conscutives brise lempilement entre les nuclotides et dstabilise lhlice dARN. Dans le motif DTJ, les nuclotides non apparis qui lient les deux paires de bases surenroules interagissent avec une des trois hlices qui forment le motif, offrant ainsi une stratgie lgante de stabilisation de larrangement. Pour dterminer les contraintes de squences imposes sur la structure tertiaire dun motif rcurrent dans le ribosome, nous avons dvelopp une nouvelle approche exprimentale. Nous avons introduit des librairies combinatoires de certains nuclotides retrouvs dans des motifs particuliers du ribosome. Suite lanalyse des squences alternatives slectionnes in vivo pour diffrents reprsentants dun motif, nous avons t en mesure didentifier les contraintes responsables de lintgrit dun motif et celles responsables dinteractions avec les lments qui forment le contexte structural du motif. Les rsultats prsents dans cette thse largissent considrablement notre comprhension des principes de formation de la structure dARN et apportent une nouvelle faon didentifier et de caractriser de nouveaux motifs structuraux dARN.
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Le diabte est un syndrome mtabolique caractris par une hyperglycmie chronique due un dfaut de scrtion de linsuline, de laction de linsuline (sensibilit), ou une combinaison des deux. Plus d'un million de canadiens vivent actuellement avec le diabte. La prvalence de cette maladie est au moins trois fois plus leve chez les autochtones que dans la population canadienne en gnral. Notre quipe vise tudier les effets potentiellement antidiabtiques de certaines plantes mdicinales utilises par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Qubec) o ladhrence aux traitements mdicamenteux est faible, en partie cause de la dconnection culturelle de ces derniers. Grce une approche ethnobotanique, notre quipe a identifi 17 plantes mdicinales utilises par cette population pour traiter des symptmes du diabte. Parmi ces plantes, lextrait thanolique de Rhododendron groenlandicum (Th du Labrador) a montr un fort potentiel antidiabtique chez plusieurs lignes cellulaires, notamment les adipocytes (3T3-L1). Cette plante induit la diffrenciation adipocytaire probablement par lactivation du peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR ). Cette stimulation amliore la rsistance linsuline et constitue un mécanisme privilgi pour une classe de mdicaments antidiabtiques, les thiazolidinediones. Le but de la prsente tude est de valider lefficacit et linnocuit de R. groenlandicum in vivo, dans un modle animal de rsistance linsuline, dlucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets antidiabtiques et didentifier les principes actifs responsables de son activit. L'isolation et l'identification des constituants actifs ont t ralises laide d'une approche de fractionnement guid par bioessai; en l'occurrence, l'adipognse. Cette approche, ralise dans la ligne adipocytaire 3T3-L1, a pour but de mesurer leur teneur en triglycrides. Des tudes in vivo ont t ralises sur le modle de souris DIO (diet induced obesity). L'extrait thanolique du R. groenlandicum a t incorpor la nourriture grasse (35% dapport calorique lipidique) trois doses diffrentes (125, 250 et 500 mg / kg) sur une priode de 8 semaines. Des tissus cibles de linsuline (foie, muscle squelettique et tissus adipeux) ont t rcolts afin de faire des analyses dimmunobuvardage de type western. La querctine, la catchine et lpicatchine ont t identifies comme tant les composs actifs responsables de l'effet antidiabtique du R. groenlandicum. Seules la catchine et lpicatchine activent ladipognse uniquement forte concentration (125-150 M), tandis que la querctine linhibe. Ltude in vivo a montr que le traitement avec R. groenlandicum chez les souris DIO rduit le gain de poids de 6%, diminue l'hyperglycmie de 13% et linsulinmie plasmatique de 65% et prvient lapparition des statoses hpatiques (diminution de 42% de triglycride dans le foie) sans tre toxique. Les analyses dimmunobuvardage ont montr que R. groenlandicum stimule la voie de linsuline via la phosphorylation de lAkt et a augment le contenu protique en Glut 4 dans les muscles des souris traites. Par contre, dans le foie, le R. groenlandicum passerait par deux voies diffrentes, soit la voie insulino-dpendante par lactivation de lAKT, soit la voie insulino-indpendante par la stimulation de lAMPK. Lamlioration observe des statoses hpatiques chez les souris DIO traites, a t confirme par une baisse du facteur de transcription, SREBP-1, impliqu dans la lipognse de novo, ainsi quune diminution de linflammation hpatique (diminution de lactivit dIKK /). En conclusion, lensemble de ces rsultats soutiennent le potentiel thrapeutique de Rhododendron groenlandicum et de ses composants actifs dans le traitement et la prvention du diabte de type 2. Nous avons valid l'innocuit et l'efficacit de cette plante issue de la mdecine traditionnelle Cri, qui pourrait tre un traitement alternatif du diabte de type 2 dans une population ayant une faible adhrence au traitement pharmacologique existant.
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Les toxines de lanthrax font partie de la famille des toxines A-B dans laquelle la moiti B se fixe la membrane de la cellule permettant par la suite la translocation de la moiti A. Dans le cas de lanthrax, la moiti B est reprsente par le Protective Antigen (PA) et la moiti A par les deux protines Edema Factor (EF) et Lethal Factor (LF). Aprs le recrutement par les rcepteurs cellulaires (CMG2 et TEM8), PA sorganise en heptamre. Il peut fixer jusqu' 3 ligands (EF et LF) avant d'tre endocyt. Les modles actuels de PA suggrent que la baisse de pH lintrieur des endosomes permet un changement de conformation de la forme pr-pore vers la forme pore et que les ligands EF et LF passeraient au travers le pore pour entrer dans le cytoplasme. Cependant, le diamtre du pore est environ dix fois infrieur celui des ligands (10 contre 100 ). Un processus de folding/unfolding a t propos mais demeure controvers. Afin d'identifier le processus de passage des facteurs EF et LF dans le cytoplasme, nous avons dtermin par cryo-microscopie lectronique combine avec lanalyse dimage les structures tridimensionnelles des complexes forms par PA et LF aux tapes prpore et pore. Par la suite, une tude complmentaire par dynamique molculaire nous a permis de modliser haute rsolution les diffrentes interactions qui ont lieu au sein du complexe. La structure 3D du complexe prpore combin 3 LF a t dtermine une rsolution de 14 . Nous avons aussi calcul une structure prliminaire du complexe pore galement combin 3 LF Celles-ci nont jamais t rsolues auparavant et leur connaissance permet denvisager ltude en profondeur du mécanisme infectieux de lAnthrax in vivo.
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Laugmentation du nombre dusagers de lInternet a entran une croissance exponentielle dans les tables de routage. Cette taille prvoit latteinte dun million de prfixes dans les prochaines annes. De mme, les routeurs au cur de lInternet peuvent facilement atteindre plusieurs centaines de connexions BGP simultanes avec des routeurs voisins. Dans une architecture classique des routeurs, le protocole BGP sexcute comme une entit unique au sein du routeur. Cette architecture comporte deux inconvnients majeurs : lextensibilit (scalabilit) et la fiabilit. Dun ct, la scalabilit de BGP est mesurable en termes de nombre de connexions et aussi par la taille maximale de la table de routage que linterface de contrle puisse supporter. De lautre ct, la fiabilit est un sujet critique dans les routeurs au cur de lInternet. Si linstance BGP sarrte, toutes les connexions seront perdues et le nouvel tat de la table de routage sera propag tout au long de lInternet dans un dlai de convergence non trivial. Malgr la haute fiabilit des routeurs au cur de lInternet, leur rsilience aux pannes est augmente considrablement et celle-ci est implante dans la majorit des cas via une redondance passive qui peut limiter la scalabilit du routeur. Dans cette thse, on traite les deux inconvnients en proposant une nouvelle approche distribue de BGP pour augmenter sa scalabilit ainsi que sa fiabilit sans changer la smantique du protocole. Larchitecture distribue de BGP propose dans la premire contribution est faite pour satisfaire les deux contraintes : scalabilit et fiabilit. Ceci est accompli en exploitant adquatement le paralllisme et la distribution des modules de BGP sur plusieurs cartes de contrle. Dans cette contribution, les fonctionnalits de BGP sont divises selon le paradigme matre-esclave et le RIB (Routing Information Base) est dupliqu sur plusieurs cartes de contrle. Dans la deuxime contribution, on traite la tolrance aux pannes dans larchitecture labore dans la premire contribution en proposant un mécanisme qui augmente la fiabilit. De plus, nous prouvons analytiquement dans cette contribution quen adoptant une telle architecture distribue, la disponibilit de BGP sera augmente considrablement versus une architecture monolithique. Dans la troisime contribution, on propose une mthode de partitionnement de la table de routage que nous avons appel DRTP pour diviser la table de BGP sur plusieurs cartes de contrle. Cette contribution vise augmenter la scalabilit de la table de routage et la paralllisation de lalgorithme de recherche (Best Match Prefix) en partitionnant la table de routage sur plusieurs nuds physiquement distribus.
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Dans ce mmoire, nous tudions le problme centre-foyer sur un systme polynomial. Nous dveloppons ainsi deux mécanismes permettant de conclure quun point singulier monodromique dans ce systme non-linaire polynomial est un centre. Le premier mécanisme est la mthode de Darboux. Cette mthode utilise des courbes algbriques invariantes dans la construction dune intgrale premire. La deuxime mthode analyse la rversibilit algbrique ou analytique du systme. Un systme possdant une singularit monodromique et tant algbriquement ou analytiquement rversible ce point sera ncessairement un centre. Comme application, dans le dernier chapitre, nous considrons le modle de Gauss gnralis avec rcolte de proies.
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Rsum Lobjectif de cette tude tait de dterminer les effets de la source de slnium sur les concentrations de Se et de GSH-Px des vaches de boucherie (n =33) et leurs veaux et sur des paramtres immunitaires des veaux. Deux groupes de vaches ont reu 3 mg/j/animal de Se organique ou inorganique dans le minral. Le troisime groupe n'a pas t supplment en Se et leurs veaux ont t diviss en deux sous-groupes, lun des deux a reu une injection de slnite de sodium (0,087 mg/Kg) la naissance. Le Se et la GSH-Px ont t respectivement mesurs par HPLC-UV et par cintique enzymatique. La phagocytose, la flambe respiratoire et le ratio CD4:CD8ont t valus par des kits commerciaux et les IgG totales ont t mesurs par immunodiffusion radiale. La supplmentation de Se a augment significativement le Se srique et colostral (P<0,02) et la GSH-Px(P0,04) pour les vaches et leurs veaux avec un effet significativement plus lev pour le Se organique. Le Se du lait a augment de faon significative uniquement avec la source organique du Se (P0,0007). Linjection du Se chez les veaux a permis une augmentation significative mais temporaire (P<0,0001) du Se srique. La supplmentation en Se na pas influenc les paramtres immunitaires mesurs (P>0,01, non significatif aprs correction de Bonferroni). Nous concluons que la supplmentation en Se amliore le niveau du Se colostral, lact et srique ainsi que la GSH-Px pour les vaches et leurs veaux sans effet sur les paramtres immunitaires mesurs des veaux. Mots cls: Slnium, veaux de boucherie, phagocytose, flambe respiratoire, anticorps, ratio CD4:CD8, GSH-Px.
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Lobjectif central de cette thse de Doctorat tait dinvestiguer les dysfonctions mitochondriales qui surviennent prcocement au cours de la phase compense du remodelage ventriculaire pathologique et qui pourraient jouer un rle causal dans la progression vers linsuffisance cardiaque. Nos travaux antrieurs, raliss laide dun modle de surcharge volumique chronique induite par une fistule aorto-cavale (ACF) chez le Rat WKHA, ont montr quau cours du remodelage ventriculaire, les mitochondries dveloppaient une vulnrabilit louverture du pore de permabilit transitionnelle (PTP : un lment cl de la signalisation de la mort cellulaire) [1]. Ceci tait observable au stade compens du remodelage en absence des dysfonctions mitochondriales majeures typiquement observes dans le cur insuffisant. Ces rsultats nous ont amens suggrer que la vulnrabilit louverture du PTP pourrait constituer un mécanisme prcoce favorisant la progression de la cardiopathie. Dans ltude 1 de cette thse, nous avons tent de tester cette hypothse en induisant une ACF chez deux souches de rats affichant de trs nettes diffrences au niveau de la propension dvelopper linsuffisance cardiaque : les souches WKHA et Sprague Dawley (SD). Nos tudes in vitro sur organelles isoles et in situ sur lorgane entier ont permis de confirmer que, dans le cur ACF, les mitochondries dveloppent une vulnrabilit louverture du PTP et lactivation de la voie mitochondriale de la mort cellulaire lorsquexposes des stress pertinents la pathologie (surcharge calcique, ischmie-reperfusion [I-R]). Cependant, bien que comparativement aux animaux WKHA, les animaux SD dmontraient un remodelage ventriculaire plus rapide et prononc et une progression prcoce vers linsuffisance cardiaque, aucune diffrence ntait observable entre les deux groupes au niveau des dysfonctions mitochondriales, suggrant quelles ne sont pas lorigine de la progression plus rapide de la pathologie chez la souche SD, tout le moins en rponse la surcharge volumique. Nous avons par la suite dtermin, laide des mmes approches exprimentales, si cette vulnrabilit mitochondriale tait observable dans une cardiopathie dtiologie diffrente, plus spcifiquement celle qui est associe la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie gntique cause par une mutation de la protine dystrophine. Nos tudes menes (tudes 2-4) sur de jeunes souris mdx (le modle murin de la DMD) exemptes de tout signe clinique de cardiopathie nont rvl aucune diffrence au niveau des fonctions mitochondriales de base. Cependant, tout comme dans le modle dACF, les mitochondries dans le cur de souris mdx taient significativement plus vulnrables louverture du PTP lorsque soumises une I-R (tude 2). Par ailleurs, nous avons dmontr que ladministration aigu de sildnafil aux souris mdx induisait une abolition de louverture du PTP et de ses consquences signaltiques, une diminution marque du dommage tissulaire et une meilleure rcupration fonctionnelle la suite de lI-R (tude 3). Nous avons ensuite test chez la souris mdx ladministration aigu de SS31, un peptide anti-oxydant cibl aux mitochondries, cependant aucun effet protecteur na t observ, suggrant que le tamponnement des radicaux libres est dune utilit limite si les perturbations de lhomostasie calcique typiques cette pathologie ne sont pas traites simultanment (tude 4). Globalement, les travaux effectus au cours de cette thse dmontrent que la vulnrabilit louverture du PTP constitue une dysfonction prcoce et commune qui survient au cours de remodelages ventriculaires pathologiques dtiologies diffrentes. Par ailleurs, ces travaux suggrent des stratgies dintervention pharmacologiques ciblant ce processus, dont lefficacit pour la prvention de linsuffisance cardiaque demande tre tablie.
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La dihyrofolate rductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactrienne encode par un plasmide donc aisment transmissible. Elle catalyse la raction de rduction du dihydrofolate (DHF) en ttrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifration cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dpend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est diffrente, structurellement et gntiquement, de lenzyme DHFR chromosomale prsente chez tous les organismes et elle est rsistante au trimthoprime (TMP) qui est largement utilis dans les traitements antibactriens chez lHomme. Aucun inhibiteur slectif contre la DHFR R67 nest actuellement rpertori. Le but de cette tude a t didentifier des molcules qui pourront inhiber la DHFR R67 slectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vrification de la qualit des essais enzymatiques en conditions dtermines pour le criblage dinhibiteurs sur plusieurs lectrices plaques a identifi des appareils appropris pour lanalyse. Ltude de lactivit enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en prsence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel dinhibiteurs, a montr que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel bas sur lapproche du design dun inhibiteur partir de petites molcules, a rvl des molcules primaires qui inhibent la DHFR R67 de faon faible, mais slective. Le test des composs biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montr laugmentation de laffinit entre la DHFR R67 et les composs tests. Trois composs ont t dtermins comme des inhibiteurs slectifs prometteurs pour la DHFR R67.
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La chromatine est essentielle au maintien de lintgrit du gnome, mais, ironiquement, constitue lobstacle principal la transcription des gnes. Plusieurs mécanismes ont t dvelopps par la cellule pour pallier ce problme, dont lactylation des histones composant les nuclosomes. Cette actylation, catalyse par des histones actyl transfrases (HATs), permet de rduire la force de linteraction entre les nuclosomes et lADN, ce qui permet la machinerie transcriptionnelle de faire son travail. Toutefois, on ne peut laisser la chromatine dans cet tat permissif sans consquence nfaste. Les histone dactylases (HDACs) catalysent le clivage du groupement actyle pour permettre la chromatine de retrouver une conformation compacte. Cette thse se penche sur la caractrisation de la fonction et du mécanisme de recrutement des complexes HDACs Rpd3S et Set3C. Le complexe Rpd3S est recrut aux rgions transcrites par une interaction avec le domaine C-terminal hyperphosphoryl de Rpb1, une sous-unit de lARN polymrase II. Toutefois, le facteur dlongation DSIF joue un rle dans la rgulation de cette association en limitant le recrutement de Rpd3S aux rgions transcrites. Lactivit HDAC de Rpd3S, quant elle, dpend de la mthylation du rsidu H3K36 par lhistone mthyltransfrase Set2. La fonction du complexe Set3C nest pas clairement dfinie. Ce complexe est recrut la plupart de ses cibles par linteraction entre le domaine PHD de Set3 et le rsidu H3K4 di- ou trimthyl. Un mécanisme indpendant de cette mthylation, possiblement le mme que pour Rpd3S, rgit toutefois lassociation de Set3C aux rgions codantes des gnes les plus transcrits. La majorit de ces rsultats ont t obtenus par la technique dimmunoprcipitation de la chromatine couple aux biopuces (ChIP-chip). Le protocole technique et le design exprimental de ce type dexprience fera aussi lobjet dune discussion approfondie.
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Les systmes de sant des pays en dveloppement font face de nombreux enjeux organisationnels pour amliorer ltat de sant de leur population. Au nombre de ces enjeux, il est frquemment mentionn la prsence dorganisations internationales ayant des objectifs et caractristiques peu convergents et qui interviennent de faon non ncessairement coordonne. Cette thse explore la thmatique de lintroduction du changement dans ces systmes de sant en mettant un accent spcifique sur lenjeu li la prsence de ces organisations internationales. La mthodologie utilise est une analyse de concept. Cette approche mthodologique consiste effectuer des revues critiques de la littrature sur des concepts, mobiliser de nouvelles approches thoriques pour clarifier ces concepts et raliser des tudes de cas pour leur mise lpreuve empirique. En nous appuyant sur la thorie de laction sociale de Parsons, la thorie de la complexit ainsi que les expriences dintroduction du changement dans diffrents systmes de sant, nous avons dvelopp un cadre thorique danalyse de lintroduction du changement dans les systmes de sant des pays en dveloppement (1er concept). Ce cadre thorique, qui suggre de concevoir le processus dintroduction du changement comme un systme daction sociale complexe et mergent, a t appliqu lanalyse de lintroduction dun systme de surveillance pidmiologique en Hati. Plus prcisment, nous avons analys une tape ainsi que certains aspects du mécanisme sous-jacent au processus dintroduction du changement. Ce faisant, nous avons analys, dans les deux premiers articles de la thse, ltape dadoption du systme de surveillance pidmiologique (2me concept) ainsi que les dterminants de la collaboration entre les organisations impliques dans le processus dintroduction du changement (3me concept). Les rsultats de ces analyses nous ont permis dobjectiver de faibles niveaux dadoption, ainsi quune faible articulation des dterminants de la collaboration entre les diffrentes organisations impliques dans le processus dintroduction du changement. Partant de ces constats, nous avons pu mettre en vidence, dans le troisime article, une phase de chaos dans le fonctionnement du systme de sant dHati. Cette phase de chaos , qui pourrait expliquer les difficults lies lintroduction du changement dans les systmes de sant des pays en dveloppement en gnral et plus particulirement en Hati, tait caractrise par la prsence dun ordre sous-jacent au dsordre apparent dans le fonctionnement de certaines composantes du systme de sant dHati, lexistence dune instabilit, dune imprdictibilit ainsi que dune invariance structurelle aux diffrents niveaux de gouvernance. Par ailleurs, cette recherche a galement permis de dmontrer que les caractristiques du chaos sont entretenues par la prsence de trois groupes de systmes daction sociale bien articuls et bien cohrents tous les chelons de la pyramide sanitaire en Hati. Il sagissait des systmes daction lis aux agences de coopration bilatrale, ceux lis aux initiatives ou fondations internationales de lutte contre le sida et finalement ceux associs aux organisations onusiennes. Ces systmes daction sociale sont en outre associs dautres systmes daction plus complexes qui sont situs lextrieur du systme de sant dHati. Au regard de ces rsultats, nous avons propos une nouvelle approche permettant de mieux apprhender lintroduction du changement dans les systmes de sant des pays en dveloppement et qui sinscrit dans une logique permettant de favoriser une plus grande varit et une plus grande diversification. Cette varit et cette diversification tant soutenue par la cration et la mise en place de plusieurs interconnections entre tous les systmes daction en prsence dans les systmes de sant quils soient dappartenance nationale, internationale ou quils agissent au niveau central, dpartemental ou local. La finalit de ce processus tant lmergence de proprits systmiques issues non seulement des proprits des groupes de systmes daction individuels qui interviennent dans la constitution du systme mergent, mais aussi dautres proprits rsultant de leur mise en commun.
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Les changements volutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire appropri, telles que les caractristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mécanismes sensoriels y rpondant. L'haplode de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprtant le gradient de la concentration d'une phromone scrte par les partenaires potentiels grce un rseau de protines signaltiques de type kinase actives par la mitose (MAPK). La dcision de la liaison sexuelle chez la levure est un vnement en "toutourien", la manire d'un interrupteur. Les cellules haplodes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phromones quil produit. Seul le partenaire proximit scrtant des concentrations de phromones gales ou suprieures une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phromones sont attribus des partenaires pouvant mener des accouplements infructueux. Notre comprhension du mécanisme molculaire contrlant cet interrupteur de la dcision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la prsente thse, je dmontre que le mécanisme de dcision de la liaison sexuelle provient de la comptition pour le contrle de l'tat de phosphorylation de quatre sites sur la protine d'chafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette comptition rsulte en la dissociation de type intrupteur entre Fus3 et Ste5, ncessaire la prise de dcision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la dcision de la liaison sexuelle s'effectue une tape prcoce de la voie de rponse aux phromones et se produit rapidement, peut-tre dans le but de prvenir la perte dun partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 gnre un mécanisme indit d'ultrasensibilit, ressemblant "l'ultrasensibilit d'ordre zro", qui rsiste aux variations de concentration de ces protines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dpit de la stochasticit cellulaire ou de variations gntiques entre individus.Je dmontre, par la suite, qu'un vnement prcoce en rponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 la membrane plasmique est galement ultrasensible l'augmentation de la concentration de phromones et que cette ultrasensibilit est engendre par la dphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associe Ste5 via la protine polarisante, Bem1. L'interfrence dans ce mécanisme provoque une perte de l'ultrasensibilit et rduit, du mme coup, l'amplitude et la fidlit de la voie de rponse aux phromones la stimulation. Ces changements se refltent en une rduction de la fidlit et de la prcision de la morphologie attribuable la rponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protique la surface de la membrane plasmique est un thme gnral persistant dans tous les organismes, de la bactrie l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accrotre l'efficacit, la fidlit et la spcificit de la transmission du signal. L'ensemble de nos dcouvertes dmontre que l'ultrasensibilit, la prcision et la robustesse de la rponse aux phromones dcoulent de la rgulation de la phosphorylation stoichiomtrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rle modulateur de Ste5 dans la dcision de la destine cellulaire tend le rpertoire fonctionnel des protines d'chafaudage bien au-del de l'accessoire dans la spcificit et l'efficacit des traitements de l'information. La rgulation de la dynamique des caractres signal-rponse travers une telle rgulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protines d'chafaudage combines l'assemblage la membrane peut tre un moyen gnral par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mécanismes similaires peuvent contrler les dcisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent tre compromis dans des drglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thme reli, je prsente la dcouverte d'un nouveau mécanisme o le seuil de la concentration de phromones est contrl par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manire, le point prdtermin dans lequel la quantit et la qualit des nutriments accessibles dans l'environnement dterminent le seuil partir duquel la levure s'accouple. La sous-unit rgulatrice de la kinase protine A (PKA),Bcy1, une composante cl du rseau signaltique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unit des petites protines G, Gpa1, le premier effecteur dans le rseau de rponse aux phromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en prsence d'un sucre idal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la dcision d'accouplement est active. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accrot la concentration seuil ncessaire une rponse aux phromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilit, les levures peuvent intgrer le stimulus provenant des phromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la dcision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.
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Les protines DOCK180 et ELMO cooprent ensemble biochimiquement et gntiquement afin dactiver la GTPase Rac1 lors de plusieurs vnements biologiques. Toutefois, le rle que jouent ces protines dans la signalisation par Rac est encore mal compris. Nous mettons lhypothse que Dock180 agit comme activateur de Rac, alors que ELMO est requis pour lintgration de la signalisation de Rac plutt que son activation per se. Nous postulons que ELMO agit comme signal de localisation intracellulaire afin de restreindre de faon spatio-temporelle la signalisation de Rac en aval de Dock180, et/ou que ELMO agit comme protine dchafaudage entre Rac et ses effecteurs pour amplifier la migration cellulaire. Dans lobjectif n 1, nous dmontrons que le domaine PH atypique de ELMO1 est le site dinteraction principal entre cette protine et DOCK180. De plus, nous dmontrons que la liaison entre ELMO et DOCK180 nest pas ncessaire pour lactivation de Rac, mais est plutt essentielle pour faciliter la rorganisation du cytosquelette induite par lactivation de Rac en aval de Dock180. Ces rsultats impliquent que ELMO pourrait jouer des rles additionnels dans la signalisation par Rac. Dans lobjectif n 2, nous avons dcouvert lexistence dune homologie structurelle entre ELMO et un module dautorgulation de la formine Dia1, et avons identifi trois nouveaux domaines dans la protine ELMO : les domaines RBD, EID et EAD. De faon analogue Dia1, nous avons dcouvert que ELMO ltat basal est autoinhib grce des intractions intramolculaires. Nous proposons que ltat dactivation des protines ELMO est rgul de faon similaire aux formines de la famille Dia, cest--dire grce des interactions avec dautres protines. Dans lobjectif n 3, nous identifions un domaine RBD polyvalent chez ELMO. Ce domaine possde une double spcificit pour les GTPases de la famille Rho et Arf. Nous avons dcouvert que Arl4A agit comme signal de recrutement membranaire pour le module ELMO/DOCK180/Rac. Nos rsultats nous permettent de supposer que dautres GTPases pourraient tre impliques dans lactivation et la localisation de cette voie de signalisation. Nous concluons qu ltat basal, ELMO et DOCK180 forment un complexe dans lequel ELMO est dans sa conformation autoinhibe. Bien que le mécanisme dactivation de ELMO ne soit pas encore bien compris, nous avons dcouvert que, lorsquil y a stimulation cellulaire, certaines GTPases lies au GTP peuvent intragir avec le domaine RBD de ELMO pour relcher les contacts intramolculaires et/ou localiser le complexe la membrane. Ainsi, les GTPases peuvent servir dancrage au complexe ELMO/DOCK180 pour assurer une regulation spatiotemporelle adequate de lactivation et de la signalisation de Rac.
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Lubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont trs peu dhomologie de squence, mais partagent des similarits remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme lUb et la majorit des autres Ubls, UFM1 se lie de faon covalente ses substrats par lintermdiaire dune cascade enzymatique. Il est de plus en plus frquemment rapport que les protines Ubls sont impliques dans des maladies humaines. Le gne Ufm1 est surexprim chez des souris de type MCP dveloppant une ischmie myocardique et dans les lots de Langerhans de patients atteints du diabte de type 2. UFM1 et ses enzymes spcifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservs chez les mtazoaires et les plantes suggrant un rle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modle animal le plus simple utilis en biologie. Sa morphologie, ses phnotypes visibles et ses lignes cellulaires ont t dcrits de faon dtaille. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gnes sur la longvit. Ce modle nous permet de facilement manipuler lexpression du gne Ufm1 et de mieux connatre ses fonctions. En diminuant lexpression du gne ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de lARN interfrence par alimentation, nous navons observ aucun problme morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possdaient un nombre de progniture normal. Cependant, les vers sauvage exposs lARNi dufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrles et ce, de faon indpendante de la voie de signalisation de linsuline/IGF. Chez le C. elegans la longvit et la rsistance au stress cellulaire sont intimement lies. Nous navons remarqu aucun effet dufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress prototoxique. Il est galement ncessaire au maintien de lintgrit neuronale au cours du vieillissement des animaux. Lensemble de nos donnes nous renseigne sur les fonctions putatives du gne Ufm1.
Resumo:
La dcouverte du systme des peptides natriurtiques (NP), au dbut des annes 80, fut une dcouverte majeure qui rvla le rle endocrinien du cur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurse et la natriurse provoques par ce systme ont volu vers un niveau de complexit insouponn cette poque. Nous savons prsent que les NP sont impliqus dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifration cellulaire, lapoptose, linhibition du systme rnine-angiotensine-aldostrone (RAAS) et le mtabolisme des adipocytes. Le mtabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre lobsit. Cette condition aux proportions pandmiques est un facteur de risque majeur dans lapparition de lhypertension et du syndrome mtabolique (MetS). La comprhension des mécanismes et des dfauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrle du MetS et de lhypertension. Lexpression du rcepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrle par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurtique de loreillette (ANP). La dcouverte dune boucle de retro-inhibition, dans les annes 90, a t un vnement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite une stimulation lANP, le NPR1/GCA peut inhiber lactivit transcriptionnelle de son propre gne par un mécanisme dpendant du cGMP. Notre groupe a identifi un lment cis-rgulateur responsable de cette sensibilit au cGMP et mon projet consistait identifier la ou les protine(s) liant cet lment de rponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifi un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque dADN complmentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient dun ADNc de 1083-bp dont le gne est localis sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protine dont la fonction tait inconnue jusquici. Nous avons nomm cette nouvelle protine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison lADN ont montr que cette protine possde une affinit 18 fois plus leve pour le cGMP-RE que le contrle, tandis que des expriences de retard sur gel (EMSA) ont confirm la spcificit des interactions protine-ADN. De plus, limmuno-prcipitation de la chromatine (ChIP) a prouv que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe lexpression du gne rapporteur lucifrase sous contrle du promoteur de npr1/gca. Linhibition de GREBP laide dARN interfrant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, lANP stimule lexpression de grebp de 60% aprs seulement 3 heures et inhibe lexpression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protine nuclaire surtout exprime dans le cur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nuclotidiques du gne sont plus frquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici lexistence dun gne spcifique lhumain qui agit comme rpresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqu dans le dveloppement de lhypertension.
Resumo:
Linflammation est un procd complexe qui vise llimination de lagent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la rparation du tissu affect. La persistance de lagent causal ou lincapacit rsoudre linflammation mne un drglement homostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidit et la mortalit. Lathrosclrose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont lorigine est multifactorielle. Lhypertension et ltat infectieux reprsentent respectivement des facteurs de risque classiques et mergents du dveloppement de cette maladie. Les fondements initiaux de linflammation font intervenir limmunit inne, la premire ligne de dfense dont disposent les cellules pour rpondre un signal de danger. Le but de cette thse est dexaminer le rle pro-inflammatoire dune famille de kinases essentielles limmunit inne, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molcule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est charg deffectuer la phosphorylation de linhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mne sa dgradation et la libration du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit lactivit phosphotransfrase dIKKbeta dans les VSMC par immunoprcipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grce une approche ARN interfrence (ARNi) dirige contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme dinduction de NF-kappaB par lAngII est atypique, puisquil ne module pas IkappaBalpha, et montrons laide dinhibiteurs pharmacologiques que lactivation de p65 est indpendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du rcepteur de lEGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant elles principalement actives suite une infection bactrienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomgalovirus humain, un pathogne associ lathrosclrose, a la capacit dinduire lactivation de TBK1 dans les VSMC. Lusage dARNi dirig contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliques dans lactivation dIRF-3. De plus, nous montrons laide dune ligne de VSMC exprimant une version dominante ngative dIRF-3 que ce dernier est essentiel la synthse des chimiokines RANTES et IP-10, tel quanalys par RT-PCR. Par ailleurs, il a rcemment t montr que les kinases IKK-related taient troitement lies la transformation oncognique, et que TBK1 tait pro-angiognique. Or, langiogense est le plus souvent module par la rponse hypoxique qui est dailleurs commune la majorit des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module langiogense, linflammation et la survie cellulaire. Nous montrons laide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et dune approche lentivirale que TBK1 est spcifiquement implique dans linduction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. Lexpression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les rsultats originaux prsents dans cette thse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts.
