A influência do sistema nitrérgico no cultivo in vitro de embriões bovinos

O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG.

Efeito fungitóxico in vitro do óleo resina e do óleo essencial de copaíba (Copaifera multijuga Hayne)

Óleo de Copaifera multijuga Hayne, in natura e as frações foram avaliadas quanto às atividades fungitóxicas in vitro, frente a cinco espécies de fungos filamentosos do gênero Aspergillus e três espécies de leveduras do gênero Candida. Concentrações de óleo resina e de óleo essencial na faixa de 0,08 mg mL^-1 a 1,6 mg mL^-1 foram usadas para as análises qualitativa e quantitativas. As amostras foram dispostas sobre discos de papel de 5 mm de diâmetro e distribuídos sobre o meio Saboraud em placas de Petri, inoculadas com esporos dos microorganismos e incubadas a 28ºC durante 10 dias. Utilizou-se solução com 1,6 mg mL^-1 de nitrato de miconazol como controle positivo. Os resultados qualitativos mostraram que o óleo resina apresentou boa atividade fungistática, porém uma das frações do óleo essencial se mostrou altamente efetiva contra Candida parapsilosis IOC-2882, Aspergillus flavus IOC-3874 e A tamarii IOC-187 com halos de inibição de 16,0±1,4 mm, 19,5±2,1 mm e 12,5±3,5 mm, respectivamente. Já a avaliação quantitativa mostrou que 0,3 mg mL^-1 do óleo resina inibiu o crescimento de A. flavus e C. parapsilosis, enquanto que 0,08 mg mL^-1 da fração do óleo essencial atingiu esta mesma atividade.

Efeito do estradiol e da progesterona no desenvolvimento e na qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Avaliaram-se o desenvolvimento e a qualidade de embriões bovinos, cocultivados com células epiteliais do oviduto bovino (CEOBs) expostas ou não ao estradiol e à progesterona. Os ovócitos foram maturados in vitro por 24h e, então, fertilizados utilizando-se sêmen congelado, em estufa de CO2 a 5% e 38,5oC. As CEOBs foram cultivadas em TCM-199 com ou sem estradiol (E2) (24 horas), nas mesmas condições da maturação e fertilização in vitro (MIV e FIV), e, em seguida, adicionadas aos diferentes grupos em CR2 com ou sem progesterona (P4) (G1=P4+E2); (G2=E2); (G3=P4) e (G4=controle). Após 18h da FIV, as células foram cultivadas nos diferentes sistemas. Nenhuma diferença (P>0,05) foi observada nas taxas de clivagem entre G1, G2 e G4 (53,5%; 56,3%; 51,7%) e nos padrões de blastocistos (BLs) (29,3%; 31,2%, 28,7%). Índices menores (P<0,05) foram obtidos no G3 para ambas as variáveis (34,5%; 16,4%). G1 e G2 apresentaram taxas de eclosão maiores (P<0,05) que os outros grupos (23,3%; 23,2%), sendo G4 (19,3%) diferente de G3 (16,1%). Em G1, G2 e G3, o número de células nos BLs aumentou 125,9; 128,4 e 123,6, respectivamente (P<0,05), em relação ao G4 (112,5). Conclui-se que o tratamento das CEOBs com o E2, nas primeiras 24 horas de cultivo, pode ser usado isoladamente ou em combinação com a progesterona, a fim de melhorar a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

Análise da interação in vitro entre Fonsecaea pedrosoi e macrofagos peritoneais de camundongos C57/BL6 e BALB/c

A cromoblastomicose e uma infeccao subcutanea cronica, granulomatosa, causada pela implantacao traumatica de diversas especies de fungos demaceos, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiologico. O Brasil possui a segunda maior prevalencia mundial da doenca, sendo o estado do Para a maior area endemica. Histologicamente, a cromomicose e caracterizada pela presenca de celulas gigantes, onde podem ser observadas celulas escleroticas fagocitadas por macrofagos. O objetivo do presente estudo foi analisar os diferentes aspectos da interacao de macrofagos peritoneais de camundongos BALB/c e C57/BL6 com conidios ou celulas escleroticas de F. pedrosoi, determinando os indices de infeccao, fagocitose e fusao celular. Os resultados mostraram indices de fagocitose e infeccao maiores em conidios do que em celulas escleroticas para BALB/c (p<0.05), ocorrendo efeito inverso no indice de fusao, com a formacao de celulas gigantes do tipo Langhans na interacao com celulas escleroticas e celulas gigantes do tipo corpo estranho na interacao com conidios. Os macrofagos de BALB/c em interacao com conidios produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 3 a 72h; e mais IL-10 apos 3h. Macrofagos interagindo com celulas escleroticas produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 1h e 3h; e a quantidade de IL- 10 foi maior apos 72h de interacao. No co-cultivo de macrofagos de C57/BL6 com conidios observou-se a presenca de vacuolos aumentados apos 24h, enquanto na interacao com celulas escleroticas, os macrofagos se desprenderam da laminula nos tempos posteriores a 24 h. A quantidade de TNF-α e maior na interacao de conidios comparado ao controle em 1 e 72 h; e a quantidade de IL-10, no tempo de 48h. Ja na interacao com celulas escleroticas, apenas a quantidade de IL-10 diferiu do controle, sendo maior nos tempos de 1 a 48h. Estes dados sugerem que a resposta e macrofagos ao fungo e diferente entre os camundongos de BALB/c e C57/BL6, diferindo tambem a resposta de um mesmo tipo de macrofago para cada forma fungica, sendo as celulas escleroticas aparentemente mais imunogenicas que os conidios.

Análise morfológica das células de Langerhans purificadas da epiderme de camundongo Balb/c, após interação in vitro com Leishania (Viannia) brasiliensis e Leishamania (Leishmania) amazonensis

Células de Langerhans (CL) são células apresentadoras de antígenos, MHC classe II positivas, que constituem 2 a 3% de todas as células da epiderme, e que têm demonstrado serem estimuladoras de uma resposta vigorosa de linfócitos T contra Leishmania major. A leishmanionse cutânea do Novo Mundo é causada por diferentes espécies, apresentando formas clínicas diversas variando de leishmaniose cutânea difusa anérgica. Utilizando a técnica de "panning", CL da epiderme de comundongos BALB/c foram purificadas para em torno de 95% de pureza (pCL) em relação à outras células da epiderme. As CL recentemente isoladas apresentaram dentritos pequenos e delicados e os clássicos grânulos de Birbeck. Tem sido sugerido que os parasitos do subgênero Viannia e Leishmania, que são geneticamente bastante distintos, podem ter respostas espécie-específicas na resposta imune celular. Neste estudo, pCL e L. (V.) brasilienses ou L. (L.) amazonensis foram cultivadas e a morfologia das CL foi analizada após 12 ou 36 h de cultura. Utilizando a coloração de Giemsa e a microscopia eletrônica de varredura, alterações morfológicas diferentes foram detectadas nas CL após 12 h de cultivo nas duas culturas, CL e L. (V.) brasiliensis ou CL e L. (L.) amazonensis. Depois da interação com L. (V.) brasiliensis as CL tornaram-se mais dentríticas, que eram mais curtos quando comparados às CL cultivadas isoladamente. Em contraste, após a interação com L. (L.) amazonensis, as CL tornaram-se arredondadas com algumas células mostrando alguns dendritos. Além disto, verificou-se um contato íntimo entre o flagelo das prostigota com as CL, mas sem observar a fagocitose das leishmanias após 12 ou 36 h de cultivo, o que é diferente dos relatos da literatura com CL e L. major. Estes resultados sugerem que a resposta imune primária das CL contra as diferentes espécies de leishamania podem ser distintas de acordo com a espécie envolvida no processo de interação.

Estudo in vitro da infectividade de espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongo BALB/c

Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo.

Estudo da interação in vitro entre Tritrichomonas foetus e espermatozoides bovinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudo do microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp no estado do Pará

Os parasitas do gênero Leishmania apresentam uma variabilidade de espécies na região Amazônica e para sua correta identificação é necessário o isolamento dos mesmos. Atualmente para o isolamento do parasita e posterior diagnóstico da doença têm se utilizado a técnica de microcultivo in vitro. O objetivo de nosso trabalho foi otimizar a técnica de microcultivo in vitro para o isolamento de Leishmania sp. Para o isolamento, além do microcultivo, foi analisado a técnica de vácuo-aspiração adaptada e a viabilidade do parasita a temperaturas abaixo de 25ºC. No total foram utilizados 18 hamsters, infectados com amostras de casos clínicos de Leishmaniose tegumentar americana, sendo 3 de Leishmania.(Leishmania) amazonensis e 2 de Leishmania.(Viannia) braziliensis o qual foram realizados 56 cultivos por vácuo-aspiração em meio NNN, 12 em microtubos e 23 por microcapilares com RPMI suplementado, mantidos entre 25º e 31ºC. Para a segunda etapa, participaram 7 pacientes, totalizando 6 culturas por vácuo-aspiração e 42 por microcapilares. Conservou-se a baixa temperatura 7 tubos com NNN que foram mantidas a 5ºC. Foi observado que os isolamentos por vácuo-aspiração de amostras de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em hamsters foram sensíveis a adaptação da técnica, diferente das amostras de pacientes. A positividade variou entre 2 a 8 dias e 4 e 5 dias respectivamente. Os microtubos apresentaram positividade para as mesmas amostras de hamsters no período de 5 a 8 dias. Para as amostras dos pacientes, 2/12 tubos por vácuo-aspiração foram positivos e para isolamento em microcapilares 6/42, valores inferiores aos encontrados na literatura. A amostras conservadas a 5ºC apresentaram viabilidade até o 30º dia. Com estes resultados foi observado que o microcultivo é viável para uso dentro de nossa região, entretanto se mostrou limitado para o isolamento de amostras provenientes de pacientes. Devem-se utilizar outros meios de cultivo, de modo a observar o comportamento do parasito e também aperfeiçoar a coleta do material da lesão a fim de melhorar os resultados de isolamento.

Influência de Lactobacillus acidophilus sobre biofilme formado por Candida albicans in vitro e infecção em modelo de invertebrado

Pós-graduação em Biopatologia Bucal - ICT

Cinética da maturação nuclear in vitro de oócitos bubalinos

Com o objetivo de avaliar a cinética da maturação in vitro de oócitos bubalinos, foram cultivados 1.619 oócitos com cumulus oophorus compacto em quatro diferentes tratamentos: T1 - TCM 199 com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (meio base); T2 - Meio base e células da granulosa (CG); T3 - Meio base, CG, 10 UI de gonadotrofina coriônica equina (eCG) e 10 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG); T4 - Meio base, 10 UI de eCG, 10UI de hCG e 1 µg de 17b-estradiol / ml, em tempos de 14 a 17h, 20 a 22h, 23 a 25h, 26 a 28h, 29h e 32h de cultivo em estufa de CO₂ a 5% e temperatura de 38,5ºC. No tratamento 1, observou-se que 81,83%, 69,61%, 65,88%, 60,28%, 64,98% e 67,67% dos ovócitos reiniciaram a meiose. No tratamento 2, as taxas de reinicio da meiose foram de 76,06%, 72,06%, 69,78%, 68,12%,74,97% e 89,96%, no tratamento 3 estes percentuais foram de 83,59%, 78,86%, 77,49%, 82,4%, 72,92% e 81,06% e com o tratamento 4 os índices foram de 95,0%, 91,82%, 93, 17%, 91,65%, 92,09% e 74,99% nos tempos de 14 a 17h, 20 a 22h, 23 a 25h, 26 a 28h, 29h e 32h de cultivo, respectivamente, podendo-se concluir que o meio com maior suplementação proporciona maior taxa de reinício da meiose em menor tempo, assim como o aumento no tempo de cultivo pode levar a maiores índices de degeneração.

Perfil transcricional de Bradyrhizobium elkanii SEMIA 587 in vitro e em simbiose com soja (Glycine max L. Merrill) através de microarranjo de DNA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Aderência in vitro de Streptococcus sanguinis e Candida albicans em implantes dentários de superfície lisa ou tratada

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Ativação partenogenética de oócitos maturados in vitro de Cebus apella

O objetivo deste trabalho foi avaliar a maturação oocitária in vitro (MIV) na espécie C. apella, relacionando com a expansão das células do cumulus e promovendo a produção in vitro de embriões (PIVE), por meio da ativação partenogenética e fecundação in vitro (FIV). Os oócitos puncionados dos folículos antrais medindo 2-9 mm de diâmetro foram classificados em desnudos (OD), com poucas células do cumulus (PCC) e complexo cumulus-oophorus intacto (CCO intacto). A expansão das células do cumulus foi analisada nos tempos de 0, 36 e 40 h de MIV e classificada em cinco categorias de expansão. A competência meiótica nos oócitos foi verificada pela extrusão do 1º corpúsculo polar (CP) após 40 h de MIV. Os oócitos foram divididos em 3 grupos para PIVE: grupo controle (FIV), ativação partenogenética utilizando 5 μM de ionomicina em associação com 2 mM de 6-DMAP ou em associação com 50 μM de roscovitina. Para a FIV, os espermatozóides obtidos do coágulo seminal, foram diluídos em água de coco em pó (ACP-118®) e submetidos ao resfriamento para serem levados posteriormente ao cultivo in vitro com os oócitos. O aumento no tempo da MIV e a presença de várias células do cumulus associadas aos oócitos proporcionaram maior expansão das células do cumulus, pois somente os CCO intactos alcançaram a expansão total em 40 h de MIV (p < 0,005). A presença das células do cumulus nos oócitos (PCC e CCO intactos) maturados in vitro por 40 h promoveu a competência meiótica (metáfase II) significamente mais elevada que os OD (p < 0,005). Após 6 h de resfriamento em ACP-118® e separação pelo método do swin-up, os espermatozóides utilizados na FIV possuíam 80% de motilidade e vigor 4. O tratamento com ionomicina/roscovitina promoveu a extrusão do 2º CP e formação pronuclear e com ionomicina/6-DMAP formou pronúcleos, sem extrusão do 2º CP. O protocolo utilizando a ionomicina/6-DMAP e da FIV originou as primeiras divisões embrionárias, observada pela taxa de clivagem. Os resultados encontrados sugerem que em C. apella a presença e a expansão total das células do cumulus estão relacionadas com a competência oocitária. A utilização dos oócitos maturados in vitro e dos espermatozóides diluídos e resfriados em ACP-118® promoveu a PIVE por diferentes métodos nesta espécie.

Avaliação de escova ultrassônica em pacientes sob terapia ortodôntica. Estudo in vitro, clínico e microbiológico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Uso da L-arginina nos processos de capacitação espermática e fecundação in vitro de oócitos bovinos

O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da L-arginina nos processos de capacitação espermática e fecundação in vitro (FIV), analisando sua influência no desenvolvimento embrionário, utilizando o sêmen de dois touros (Bos taurus e Bos indicus). No experimento 1, os espermatozóides foram incubados, sem a presença de oócitos, durante 0, 1, 2 e 3 h em meio de FIV adicionado de 0, 1, 10 e 50 mM de L-arginina, sendo analisada a taxa de reação acrossômica. No experimento 2, espermatozóides e oócitos foram incubados em meio de FIV acrescido com as concentrações de L-arginina citadas anteriormente, durante aproximadamente 30 h. Os oócitos bovinos foram maturados in vitro (MIV) e o subsequente cultivo embrionário (CIV) foi realizado sobre monocamada de células da granulosa, em meio SOF, sendo avaliadas as taxas de fecundação (18 hpi), clivagem e blastocisto (2º e 7º dia de cultivo, respectivamente). A dosagem de NO₃ ^-/NO₂ ^- produzido durante a FIV foi realizada através do método colorimétrico de Griess. Para análise estatística dos dados, foi utilizado a ANOVA, com nível de significância de 5%. A Larginina (1 mM), quando adicionada ao meio de capacitação espermática, durante duas horas, aumentou a taxa de reação acrossômica em relação ao controle (31,1±2,78 vs 23,4±2,65) em Bos taurus. A adição de L-arginina (50 mM) ao meio de FIV (experimento 2), tanto em Bos taurus quanto em Bos indicus, diminuiu as taxas de clivagem (78,7±2,17 vs 65,7±9,32; 72,7±3,36 vs 45±7,12; respectivamente) e blastocisto (39,4±3,78 vs 15,2±6,12; 39,4±4,39 vs 16±8,54; respectivamente) em relação ao controle. Sendo assim, observou-se que a L-arginina aumentou a taxa de reação acrossômica em Bos taurus, porém reduziu as taxas de clivagem e blastocistos em ambos os touros, sem influenciar na qualidade do embrião.