Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.

Correlação entre a espessura da parede vesical e os achados urodinâmicos em pacientes com lesão medular traumática. Avaliação da influência das alterações morfológicas da bexiga nos resultados da injeção de toxina botulínica tipo-A no detrusor

Medir a espessura da parede vesical (EPV) através da ultrassonografia, correlacioná-la com os parâmetros urodinâmicos e avaliar o papel destes parâmetros para lesão do trato urinário superior. Avaliar também o papel das alterações da forma da bexiga nos resultados de injeção de toxina botulínica tipo-A (BTX-A) no detrusor em pacientes com lesão medular traumática (LMT). Trata-se de dois estudos. O primeiro é um estudo transversal de 272 pacientes com LMT submetidos à ultrassonografia renal e de bexiga e estudo urodinâmico. A parede anterior da bexiga foi medida e comparada com os dados urodinâmicos. A cistografia foi realizada em 57 pacientes. O segundo foi um estudo prospectivo avaliando os resultados da injeção de BTX-A no detrusor em 27 pacientes considerando os achados urodinâmicos (pré e pós procedimento) e as deformidades da bexiga (cistografia). A média da EPV foi de 3,94 mm e foi estatisticamente maior em pacientes com hiperatividade detrusora neurogênica associada à dissinergia vesicoesfincteriana (HDN/DVE), em comparação com aqueles sem DVE (p<0,001). Essa média também foi maior em pacientes com complacência < 20 mL/cmH2O, comparada aos pacientes com complacência ≥ 20 mL/cmH2O (p<0,001). A média da pressão detrusora máxima (Pdet Max) foi estatisticamente maior nos pacientes com refluxo vesicoureteral (RVU) em comparação com aqueles sem RVU (100,7 vs 61,2 cmH2O respectivamente, p=0,022). Pacientes com complacência < 20 mL/cmH2O apresentaram prevalência de hidronefrose 4,2 vezes maior, comparada aos pacientes com complacência ≥ 20 mL/cmH2O. Não houve associação estatística entre EPV e hidronefrose ou RVU. Vinte e sete pacientes foram submetidos à injeção de BTX-A no detrusor. A média de tempo de continência urinária foi de 8 meses. Nove pacientes (33,3%) tinham forma vesical alterada e 8 casos (29,6%) tinham divertículos. A capacidade cistométrica máxima, Pdet max, volume reflexo e complacência não apresentaram diferença significativa na presença de divertículos ou alteração da forma. O aumento da EPV está associado à complacência < 20 mL/cmH2O e HDN/DVE em pacientes com LMT. No entanto, não houve relação entre a EPV e hidronefrose ou RVU. Baixa complacência e HDN/DVE são os principais fatores de risco para dano ao trato urinário superior. A presença de divertículos ou alteração da forma vesical não influenciou nos resultados após injeção de BTX-A no detrusor.

Aderência, invasão e indução de apoptose por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana.