MMP-7 and TIMP-1, news targets in predicting poor wound healing in apical periodontitis

Introduction: Matrix metalloproteinases (MMPs) and the tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) are strongly associated with tissue destruction because of inflammation. In this study, we investigated the expression of MMPs and TIMPs messenger RNA and protein levels in apical periodontitis lesions. Methods: Tissue samples from patients presenting clinical signs of chronic apical abscess (CAA) or asymptomatic apical periodontitis (AAP) were collected postoperatively and used for gene expression analysis of MMP-2, -3, -7, -9, -14, -16, and -25; TIMP-1; and TIMP-2 in real-time polymerase chain reaction. Immunohistochemistry was also performed to detect the expression of MMP-7 and TIMP-1 proteins. Lastly, U-937 cells were induced to terminal differentiation into macrophages, infected with purified Escherichia coli lipopolysaccharide, and assessed for the expression of MMP-7 and TIMP-1 using immunocytochemistry and confocal microscopy. Results: Significantly higher messenger RNA levels were found for all genes in AAP and CAA samples when compared with healthy control samples (P < .001). AAP cases exhibited significantly higher TIMP-1 when compared with CAA cases, whereas CAA cases showed higher MMP-2, MMP-7, and MMP-9 messenger RNA levels (P < .05). We also detected positive the expression of MMP-7 and TIMP-1 proteins in the tissue samples. The expression of both MMP-7 and TIMP-1 were increased in lipopolysaccharide-stimulated cells compared with nonstimulated cells and appear to colocalize in the Golgi apparatus. Conclusions: MMPs appear to have an influential role in CAA cases in which ongoing tissue destruction is observed. TIMPs are preferentially associated with AAP, perhaps as a subsequent defense mechanism against excessive destruction. Taken together, our findings implicate MMP and TIMP molecules in the dynamics of inflammatory periapical lesion development

A possible new mechanism for the control of miRNA expression in neurons

The control of gene expression by miRNAs has been widely investigated in different species and cell types. Following a probabilistic rather than a deterministic regimen, the action of these short nucleotide sequences on specific genes depends on intracellular concentration,which in turn reflects the balance between biosynthesis and degradation. Recent studies have described the involvement of XRN2, an exoribonuclease, in miRNA degradation and PAPD4, an atypical poly(A) polymerase, in miRNA stability. Herein, we examined the expression of XRN2 and PAPD4 in developing and adult rat hippocampi. Combining bioinformatics and real-time PCR,we demonstrated that XRN2 and PAPD4 expression is regulated by the uncorrelated action of transcription factors, resulting in distinct gene expression profiles during development. Analyses of nuclei position and nestin labeling revealed that both proteins progressively accumulated during neuronal differentiation, and that they are weakly expressed in immature neurons and absent in glial and endothelial cells. Despite the differences in subcellular localization, both genes were concurrently identified within identical neuronal subpopulations, including specific inhibitory interneurons. Thus, we cope with a singular circumstance in biology: an almost complete intersected expression of functional-opposed genes, reinforcing that their antagonistically driven actions on miRNAs “make sense” if simultaneously present at the same cells. Considering that the transcriptome in the nervous system is finely tuned to physiological processes, it was remarkable that miRNA stability-related genes were oncurrently identified in neurons that play essential roles in cognitive functions such as memory and learning. In summary, this study reveals a possible new mechanism for the control of miRNA expression.

Differential transcription of virulence genes in Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotypes

Background: Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotypes are clearly associated with periodontitis or health, which suggests distinct strategies for survival within the host. Objective: We investigated the transcription profile of virulence-associated genes in A. actinomycetemcomitans serotype b (JP2 and SUNY 465) strains associated with disease and serotype a (ATCC 29523) strain associated with health. Design: Bacteria were co-cultured with immortalized gingival epithelial cells (OBA-9). The adhesion efficiency after 2 hours and the relative transcription of 13 genes were evaluated after 2 and 24 hours of interaction. Results: All strains were able to adhere to OBA-9, and this contact induced transcription of pgA for polysaccharide biosynthesis in all tested strains. Genes encoding virulence factors as Omp29, Omp100, leukotoxin, and CagE (apoptotic protein) were more transcribed by serotype b strains than by serotype a. ltxA and omp29, encoding the leukotoxin and the highly antigenic Omp29, were induced in serotype b by interaction with epithelial cells. Factors related to colonization (aae, flp, apaH, and pgA) and cdtB were upregulated in serotype a strain after prolonged interaction with OBA-9. Conclusion: Genes relevant for surface colonization and interaction with the immune system are regulated differently among the strains, which may help explaining their differences in association with disease.

A detailed description of an economical setup for electroporation of chick embryos in ovo

One of the challenges of the postgenomic era is characterizing the function and regulation of specific genes. For various reasons, the early chick embryo can easily be adopted as an in vivo assay of gene function and regulation. The embryos are robust, accessible, easily manipulated, and maintained in the laboratory. Genomic resources centered on vertebrate organisms increase daily. As a consequence of optimization of gene transfer protocols by electroporation, the chick embryo will probably become increasingly popular for reverse genetic analysis. The challenge of establishing chick embryonic electroporation might seem insurmountable to those who are unfamiliar with experimental embryological methods. To minimize the cost, time, and effort required to establish a chick electroporation assay method, we describe and illustrate in great detail the procedures involved in building a low-cost electroporation setup and the basic steps of electroporation

The intronic long noncoding RNA ANRASSF1 recruits PRC2 to the RASSF1A promoter, reducing the expression of RASSF1A and increasing cell proliferation

The down-regulation of the tumor-suppressor gene RASSF1A has been shown to increase cell proliferation in several tumors. RASSF1A expression is regulated through epigenetic events involving the polycomb repressive complex 2 (PRC2); however, the molecular mechanisms modulating the recruitment of this epigenetic modifier to the RASSF1 locus remain largely unknown. Here, we identify and characterize ANRASSF1, an endogenous unspliced long noncoding RNA (lncRNA) that is transcribed from the opposite strand on the RASSF1 gene locus in several cell lines and tissues and binds PRC2. ANRASSF1 is transcribed through RNA polymerase II and is 5'-capped and polyadenylated; it exhibits nuclear localization and has a shorter half-life compared with other lncRNAs that bind PRC2. ANRASSF1 endogenous expression is higher in breast and prostate tumor cell lines compared with non-tumor, and an opposite pattern is observed for RASSF1A. ANRASSF1 ectopic overexpression reduces RASSF1A abundance and increases the proliferation of HeLa cells, whereas ANRASSF1 silencing causes the opposite effects. These changes in ANRASSF1 levels do not affect the RASSF1C isoform abundance. ANRASSF1 overexpression causes a marked increase in both PRC2 occupancy and histone H3K27me3 repressive marks, specifically at the RASSF1A promoter region. No effect of ANRASSF1 overexpression was detected on PRC2 occupancy and histone H3K27me3 at the promoter regions of RASSF1C and the four other neighboring genes, including two well-characterized tumor suppressor genes. Additionally, we demonstrated that ANRASSF1 forms an RNA/DNA hybrid and recruits PRC2 to the RASSF1A promoter. Together, these results demonstrate a novel mechanism of epigenetic repression of the RASSF1A tumor suppressor gene involving antisense unspliced lncRNA, in which ANRASSF1 selectively represses the expression of the RASSF1 isoform overlapping the antisense transcript in a location-specific manner. In a broader perspective, our findings suggest that other non-characterized unspliced intronic lncRNAs transcribed in the human genome might contribute to a location-specific epigenetic modulation of genes.

Microglial cells are involved in the susceptibility of NADPH oxidase knockout mice to 6-hydroxy-dopamine-induced neurodegeneration

We explored the impact of Nox-2 in modulating inflammatory-mediated microglial responses in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced Parkinson’s disease (PD) model. Nox1 and Nox2 gene expression were found to increase in striatum, whereas a marked increase of Nox2 expression was observed in substantia nigra (SN) of wild-type (wt) mice after PD induction. Gp91phox-/- 6-OHDA-lesioned mice exhibited a significant reduction in the apomorphine-induced rotational behavior, when compared to wt mice. Immunolabeling assays indicated that striatal 6-OHDA injections reduced the number of dopaminergic (DA) neurons in the SN of wt mice. In gp91phox-/- 6-OHDA-lesioned mice the DA degeneration was negligible, suggesting an involvement of Nox in 6-OHDA-mediated SN degeneration. Gp91phox-/- 6-OHDA-lesioned mice treated with minocycline, a tetracycline derivative that exerts multiple anti-inflammatory effects, including microglial inhibition, exhibited increased apomorphine-induced rotational behavior and degeneration of DA neurons after 6-OHDA injections. The same treatment also increased TNF-α release and potentiated NF-κB activation in the SN of gp91phox-/--lesioned mice. Our results demonstrate for the first time that inhibition of microglial cells increases the susceptibility of gp91phox-/- 6-OHDA lesioned mice to develop PD. Blockade of microglia leads to NF-κB activation and TNF-α release into the SN of gp91phox-/- 6-OHDA lesioned mice, a likely mechanism whereby gp91phox-/- 6-OHDA lesioned mice may be more susceptible to develop PD after microglial cell inhibition. Nox2 adds an essential level of regulation to signaling pathways underlying the inflammatory response after PD induction

M-protein is down-regulated in cardiac hypertrophy driven by thyroid hormone in rats

Although it is well known that the thyroid hormone (T3) is an important positive regulator of cardiac function over a short term and that it also promotes deleterious effects over a long term, the molecular mechanisms for such effects are not yet well understood. Because most alterations in cardiac function are associated with changes in sarcomeric machinery, the present work was undertaken to find novel sarcomeric hot spots driven by T3 in the heart. A microarray analysis indicated that the M-band is a major hot spot, and the structural sarcomeric gene coding for the M-protein is severely down-regulated by T3. Real-time quantitative PCR-based measurements confirmed that T3 (1, 5, 50, and 100 physiological doses for 2 days) sharply decreased the M-protein gene and protein expression in vivo in a dose-dependent manner. Furthermore, the M-protein gene expression was elevated 3.4-fold in hypothyroid rats. Accordingly, T3 was able to rapidly and strongly reduce the M-protein gene expression in neonatal cardiomyocytes. Deletions at the M-protein promoter and bioinformatics approach suggested an area responsive to T3, which was confirmed by chromatin immunoprecipitation assay. Functional assays in cultured neonatal cardiomyocytes revealed that depletion of M-protein (by small interfering RNA) drives a severe decrease in speed of contraction. Interestingly, mRNA and protein levels of other M-band components, myomesin and embryonic-heart myomesin, were not altered by T3. We concluded that the M-protein expression is strongly and rapidly repressed by T3 in cardiomyocytes, which represents an important aspect for the basis of T3-dependent sarcomeric deleterious effects in the heart.

Differential inflammasome expression and IL-1β secretion in monocyte-derived dendritic cells differentiated with IL-4 or IFN-α

NLRP3-inflammasome activation was evaluated in monocyte-derived dendritic cells (DC) obtained through IL-4 (IL4-DC) or IFN-α (IFN-DC) protocols and pulsed with chemically inactivated HIV-1. Inflammasome' genes expression and IL-1β secretion were compared in DC isolated from 15 healthy subjects (HC) and 10 HIV-1 infected individuals (HIV+). FINDINGS: Whether HIV was able to increased NLRP3-inflammasome genes expression and IL-1β secretion in IL4-DC from HC, the induction of inflammasome appeared significantly reduced in IFN-DC from HC, suggesting a different responsive state of IFN-DC compared to IL4-DC. No inflammasome activation was observed in IL4-DC as well as in IFN-DC derived from HIV + subjects, confirming previous findings on "unresponsive" state of DC derived from HIV + possibly due to chronic inflammatory state of these individuals. CONCLUSIONS: Our results showed that IFN-α differently modulates inflammasome expression during monocytes-DC in vitro differentiation. These findings could be of interest considering the on-going research about DC manipulation and therapeutic strategies for HIV + involving DC-based immune-vaccines.

Estudo do exossomo de Archaea e de sua interação com a proteína reguladora PaNip7

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'→5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo.

Influence of different genotypes in the pattern of selenoprotein expression in response to Brazil nut supplementation

The micronutrient selenium is essential to human physiology. As the amino acid selenocysteine, it is inserted into selenoproteins with a wide range of functions including antioxidant capacity, thyroid hormone metabolism, improvement of immune system, brain function, fertility and reproduction. Low selenium status has been associated with increased risk for chronic diseases, such as cancer, type-2 diabetes and cardiovascular disease. In this context, several studies have been conducted in order to investigate if selenium supplementation could reduce the risk of such diseases. However, genetic variations may interfere in the response of individuals to a dietary intervention and must be considered as a important source of inter-individual variation. Therefore, this study was conducted was conducted to investigate the influence of genetic variations in selenoproteins genes on the response to an intervention with Brazil nuts, the richest source of selenium known in nature. The study included 130 healthy volunteers with both genders, aged 20 to 60 years old selected in University of São Paulo. They received nuts for 8 weeks, eating one nut a day, and did a washout period for more 8 weeks. All volunteers had a blood sampling collection every 4 weeks during 4 months, in a total of 5. The following analysis were done: anthropometric measurements, lipid profile, plasma malondialdehyde, plasma and erythrocyte Se, selenoprotein P, plasma and erythrocyte GPx activity, gene expression of GPX1, SEPP1, SELS and SEP15. The volunteers were also genotyped for SNPs rs1050450, rs3811699, rs1800699, rs713041, rs3877899, rs7579, rs34713741 and rs5845. Each unit of Brazil nut provided an average of 300 µg of selenium. All 130 volunteers completed the protocol. The concentrations of total cholesterol and glucose decreased after 8 weeks of supplementation. Moreover, HDL concentrations were higher for carriers of the variant T allele for GPX4_rs713041. The frequencies of the variant genotypes were 5,4% for rs1050450, rs3811699 e rs1088668, 10% for rs3877899, 19,2% for rs713041 e rs7579, 11,5% for rs5845 and 8,5% for rs34713741. The levels of the five biomarkers increased significantly after supplementation. In addition, erythrocyte GPx activity was influenced by rs1050450, rs713041 and rs5845; erythrocyte selenium was influenced by rs5845 and plasma selenium by rs3877899. Gene expression of GPX1, SEPP1 and SEP15 were higher after supplementation. The SNP rs1050450 influenced GPX1 mRNA expression and rs7579 influenced SEPP1 mRNA expression. Therefore, it can be concluded that the supplementation with one of Brazil nut for 8 weeks was efficient to reduce total cholesterol and glucose levels and to increase the concentrations of the main biomarkers of selenium status in healthy adults. Furthermore, our results suggest that GPX4_rs713041 might interfere on HDL concentrations and GPx1 activity, GPX1_rs1050450 might interfere on GPx1 activity, SEP15_rs5845 might interfere on GPx1 activity and erythrocyte selenium and SEPP1_3877899 might interfere on plasma Se levels. Therefore, the effect of genetic variations should be considered in future nutritional interventions evaluating the response to Brazil nut supplementation.

Participação do nicho endosteal na regulação da hemopoese de camundongos submetidos à desnutrição proteica

O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal.

Caracterização de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados associados a quadros clínicos

Este estudo teve como objetivos (a) identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos e (b) contribuir para a compreensão dos mecanismos de formação desses rearranjos. Para isso, foram estudados 45 rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados (29 translocações, 10 inversões e seis rearranjos complexos), detectados em pacientes que apresentavam malformações congênitas, comprometimento do desenvolvimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Foram 31 rearranjos cromossômicos esporádicos, três familiais que segregavam com o quadro clínico e mais 11 rearranjos cromossômicos herdados de genitores fenotipicamente normais. Inicialmente os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. A investigação dos pontos de quebra prosseguiu com a aplicação da técnica de Mate-Pair Sequencing (MPS), que permite localizar as quebras em segmentos de 100 pb - 1 kb, na maioria dos casos. Para obter os segmentos de junção das quebras no nível de pares de bases, os segmentos delimitados por MPS foram sequenciados pelo método de Sanger. A análise por aCGH revelou microdeleções ou microduplicações localizadas nos cromossomos rearranjados, em 12 dos 45 pacientes investigados (27%). A análise de 27 rearranjos por MPS permitiu a caracterização dos pontos de junção das quebras. MPS expandiu o número de pontos de quebra, detectados por análise do cariótipo ou aCGH, de 114 para 156 (em resolução < 2kb, na maioria dos casos). O número de pontos de quebra/rearranjo variou de 2 a 20. Os 156 pontos de quebra resultaram em 86 variantes estruturais equilibradas e outras 32 variantes não equilibradas. Perdas e ganhos de segmentos submiscroscópicos nos cromossomos rearranjados constituíram a principal causa ou, provavelmente, contribuíram para o quadro clínico de 12 dos 45 pacientes. Em cinco desses 12 rearranjos foram detectadas por MPS a interrupção de genes já relacionados à doença, ou provável alteração de sua região reguladora, contribundo para o quadro clínico. Em quatro dos 33 rearranjos não associados a perdas ou ganhos de segmentos, a análise por MPS revelou a interrupção de genes que já foram anteriormente relacionados a doenças, explicando-se, assim, as características clínicas dos portadores; outro rearranjo pode ter levando alteração da expressão gênica de gene sensível a dosagem e ao quadro clínico. Um rearranjo cromossômico familial, identificado na análise após bandamento G como uma translocação equilibrada, t(2;22)(p14;q12), segregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos. A combinação das análises por FISH, aCGH e MPS revelou que se tratava, na verdade, de rearranjo complexo entre os cromossomos 2, 5 e 22, incluindo 10 quebras. A segregação de diferentes desequilíbrios submicroscópicos em indivíduos afetados e clinicamente normais permitiu a compreensão da variabilidade clínica observada na família. Rearranjos equilibrados detectados em indivíduos afetados, mas herdados de genitores clinicamente normais, são, em geral, considerados como não tendo relação com o quadro clínico, apesar da possibilidade de desequilíbrios cromossômicos gerados por permuta desigual na meiose do genitor portador do rearranjo. Neste trabalho, a investigação de 11 desses rearranjos por aCGH não revelou perdas ou ganhos de segmentos nos cromossomos rearranjados. No entanto, a análise por aCGH da portadora de um desses rearranjos - inv(12)mat - revelou deleção de 8,7 Mb no cromossomo 8, como causa de seu fenótipo clínico. Essa deleção estava relacionada com outro rearranjo equilibrado também presente em sua mãe, independente da inversão. Para compreender os mecanismos de formação de rearranjos citogeneticamente equilibrados, investigamos os segmentos de junção no nível de pares de base. A análise por MPS que levou, na maioria dos casos, ao mapeamento dos pontos de quebras em segmentos <1kb permitiu o sequenciamento pelo método de Sanger de 51 segmentos de junções de 17 rearranjos. A ocorrência de blunt fusions ou inserções e deleções <10 pb, e a ausência de homologia ou a presença de micro homologia de 2 pb a 4 pb de extensão indicaram o mecanismo de junção de extremidades não homólogas (non-homologous end joinging; NHEJ), na maioria das 51 junções caracterizadas. As características de três dos quatro rearranjos mais complexos, com 17-20 quebras, indicaram sua formação pelo mecanismo de chromothripsis. Este estudo mostra a importância da análise genômica de variações de número de cópias por microarray, juntamente com o mapeamento dos pontos de quebra por MPS, para determinar a estrutura de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados e seu impacto clínico. O mapeamento dos segmentos de junção por MPS, permitindo o sequenciamento pelo método de Sanger, foi essencial para a compreensão de mecanismos de formação desses rearranjos

Efeitos do ramipril sobre a doença periodontal induzida experimentalmente em ratos

A doença periodontal (DP) corresponde a um grupo de doenças inflamatórias que acomete as estruturas periodontais de proteção e de suporte e pode levar à perda dentária. A etiologia está relacionada à placa dentobacteriana que leva à produção de grande quantidade de citocinas pró-inflamatórias importantes na destruição tecidual. A angiotensina (Ang) II também pode contribuir para a inflamação e destruição tecidual no periodonto agindo como mediador chave. A utilização de drogas que atuem na cascata do sistema renina-angiotensina (SRA) poderia interferir no estado de saúde ou inflamação do tecido mole, na perda óssea alveolar e na expressão gênica dos componentes do SRA e mediadores inflamatórios. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar se o ramipril, um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA), altera a progressão da DP induzida experimentalmente em ratos. Foi utilizado o modelo de indução da DP por colocação de ligadura ao redor do primeiro molar inferior direito de ratos. Os grupos com 10 animais cada, foram divididos em tratados com ramipril (via gavagem 10 mg/kg/dia) ou água (veículo) durante 14 e 21 dias e o grupo Sham submetido à indução fictícia da DP. Outros quatro grupos foram submetidos ao pré-tratamento com ramipril durante os períodos de 7 e 14 dias e após a indução da DP e tratados por 14 ou 21 dias. As metodologias de avaliação foram: extração de RNA total, transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RTqPCR), análises histológica e da perda óssea alveolar. Os dados foram analisados por meio de gráficos e os resultados foram submetidos à análise unidirecional de variância (ANOVA) e representaram médias e respectivos desvios-padrão. Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que o ramipril foi capaz de reduzir a progressão da perda óssea no grupo tratado por 21 dias (DP-21d-Rami), entretanto houve aumento do processo inflamatório, além de alteração da expressão de RNAm de ECA-2 e do receptor Mas, alguns mediadores do processo inflamatório, como COX2 e VEGF, e os receptores VEGF-R1 e VEGF-R2.

O estudo das células Tγδ na manutenção da tolerância materna em vacas gestantes

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγδ para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγδ, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγδ foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγδ para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina.

Análise funcional das proteínas HrcA, GroES/GroEL e DnaK/DnaJ em Caulobacter crescentus

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem.