Generation of CTL responses using Kunjin replicon RNA

The Kunjin replicon was used to express a polytope that consisted of seven hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte epitopes and one influenza cytotoxic T lymphocyte epitope for vaccination studies. The self-replicating nature of, and expression from, the ribonucleic acid was confirmed in vitro . Initial vaccinations with one dose of Kun-Poly ribonucleic acid showed that an influenza-specific cytotoxic T lymphocyte response was elicited more efficiently by intradermal inoculation compared with intramuscular delivery. Two micrograms of ribonucleic acid delivered in the ear pinnae of mice was sufficient to elicit a detectable cytotoxic T lymphocyte response 10 days post-vaccination. Further vaccination studies showed that four of the seven hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte epitopes were able to elicit weak cytotoxic T lymphocyte responses whereas the influenza epitope was able to elicit strong, specific cytotoxic T lymphocyte responses following three doses of Kun-Poly ribonucleic acid. These studies vindicate the use of the Kunjin replicon as a vector to deliver encoded proteins for the development of cell-mediated immune responses.

Kunjin virus replicon vectors for human immunodeficiency virus vaccine development

We have previously demonstrated the ability of the vaccine vectors based on replicon RNA of the Australian flavivirus Kunjin (KUN) to induce protective antiviral and anticancer CD8(+) T-cell responses using murine polyepitope as a model immunogen (I. Anraku, T. J. Harvey, R. Linedale, J. Gardner, D. Harrich, A. Suhrbier, and A. A. Khromykh, J. Virol. 76:3791-3799, 2002). Here we showed that immunization of BALB/c mice with KUN replicons encoding HIV-1 Gag antigen resulted in induction of both Gag-specific antibody and protective Gag-specific CD8(+) T-cell responses. Two immunizations with KUNgag replicons in the form of virus-like particles (VLPs) induced anti-Gag antibodies with titers of greater than or equal to1:10,000. Immunization with KUNgag replicons delivered as plasmid DNA, naked RNA, or VLPs induced potent Gag-specific CD8(+) T-cell responses, with one immunization of KUNgag VLPs inducing 4.5-fold-more CD8(+) T cells than the number induced after immunization with recombinant vaccinia virus carrying the gag gene (rVVgag). Two immunizations with KUNgag VLPs also provided significant protection against challenge with rVVgag. Importantly, KUN replicon VLP vaccinations induced long-lasting immune responses with CD8(+) T cells able to secrete gamma interferon and to mediate protection 6 to 10 months after immunization. These results illustrate the potential value of the KUN replicon vectors for human immunodeficiency virus vaccine design.

Promiscuous CTL recognition of viral epitopes on multiple human leukocyte antigens: Biological validation of the proposed HLA A24 supertype

Multiple HLA class I alleles can bind peptides with common sequence motifs due to structural similarities in the peptide binding cleft, and these groups of alleles have been classified into supertypes. Nine major HLA supertypes have been proposed, including an A24 supertype that includes A*2301, A*2402, and A*3001. Evidence for this A24 supertype is limited to HLA sequence homology and/or similarity in peptide binding motifs for the alleles. To investigate the immunological relevance of this proposed supertype, we have examined two viral epitopes (from EBV and CMV) initially defined as HLA-A*2301-binding peptides. The data clearly demonstrate that each peptide could be recognized by CTL clones in the context of A*2301 or A*2402; thus validating the inclusion of these three alleles within an A24 supertype. Furthermore, CTL responses to the EBV epitope were detectable in both A*2301(+) and A*2402(+) individuals who had been previously exposed to this virus. These data substantiate the biological relevance of the A24 supertype, and the identification of viral epitopes with the capacity to bind promiscuously across this supertype could aid efforts to develop CTL-based vaccines or immunotherapy. The degeneracy in HLA restriction displayed by some T cells in this study also suggests that the dogma of self-MHC restriction needs some refinement to accommodate foreign peptide recognition in the context of multiple supertype alleles.

Therapeutic LMP1 polyepitope vaccine for EBV-assolciated Hodgkin disease and nasopharyngeal carcinoma

Development of an epitope-based vaccination strategy designed to enhance Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD8(+) cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is increasingly being considered as a preferred approach for the treatment of EBV-associated relapsed Hodgkin disease (HD) and nasopharyngeal carcinoma (NPC). EBV-encoded latent membrane proteins, LMP1 and LMP2, are the only target antigens available for therapeutic augmentation of CTL responses in patients with HD and NPC. Here, we describe preclinical studies using a recombinant poxvirus vaccine that encodes a polyepitope protein comprising 6 HLA A2-restricted epitopes derived from LMP1. Human cells infected with this recombinant polyepitope construct were efficiently recognized by LM1-specific CTL lines from HLAA2 healthy individuals. Furthermore, immunization of HLrA A2/K-b mice with this polyepitope vaccine consistently generated strong LMP1 -specific CTL responses to 5 of the. 6 epitopes, which were readily detected by both ex vivo and in vitro assays. More important, this polyepitope vaccine successfully reversed the outgrowth of LMP1-expressing tumors in HLA A2/Kb mice. These studies provide an important platform for the development of an LMP-based polyepitope vaccine as an immunotherapeutic tool for the treatment of EBV-associated HD and NPC. (C) 2003 by The American Society of Hematology.

Synthesis and characterization of mono- and bis-ligand zinc(II) and cadmium(II) complexes of the di-2-pyridylketone Schiff base of S-benzyl dithiocarbazate (Hdpksbz) and the X-ray crystal structures of the [Zn(dpksbz)2] and [Cd(dpksbz)NCS]2 complexes

New mono- and bis-chelated zinc(II) and cadmium(II) complexes of formula, [M(dpksbz)NCS] (dpksbz = anionic form of the di-2-pyridylketone Schiff base of S-benzyldithiocarbazate) and [M(dpksbz)(2)] (M = Zn-II, Cd-II) have been prepared and characterized. The structure of the bis-ligand complex, [Zn(dpksbZ)(2)] has been determined by X-ray diffraction. The complex has a distorted octahedral geometry in which the ligands are coordinated to the zinc(II) ion as uninegatively charged tridentate chelates via the thiolate sulfur atoms, the azomethine nitrogen atoms and the pyridine nitrogen atoms. The distortion from a regular octahedral geometry is attributed to the restricted bite angles of the Schiff base ligands. X-ray structural analysis shows that the [Cd(dpksbz)NCS](2) complex is a centrosymmetric dimer in which each of the cadmium(II) ions adopts a five-coordinate, approximately square-pyramidal configuration with the Schiff base acting as a tetradentate chelating agent coordinating a cadmium(II) ion via one of the pyridine nitrogen atoms, the azomethine nitrogen atom and the thiolate sulfur atom; the second pyridine nitrogen atom is coordinated to the other cadmium(II) ion of the dimer. The fifth coordination position around each cadmium(II) is occupied by an N-bonded thiocyanate ligand. (C) 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

Clinical aspects of gestational trophoblastic disease: A review based partly on 25-year experience of a statewide registry

Background: Gestational trophoblastic disease is a fascinating group of pregnancy disorders characterised by abnormal proliferation of trophoblast, ranging from benign to malignant. Because the disease is uncommon, there is a need to formulate management with the assistance of collective information. Methodology: A review of available information from English written literature was undertaken especially data reported by registries around the world (Charing Cross Hospital in England, the North-western University and the New England area in the USA as well as our own experience in Queensland, Australia). Where possible, collated data from relevant studies were analysed to answer some of the questions posed in clinical practice, with reference to metastatic disease to liver and brain, twinning of molar gestation and coexisting fetus, and placental-site tumour. Results: We found that molar gestation can be classified according to its clinical presentation which influences the time taken to reach human chorionic gonadotropin (HCG) 'negativity' and the risk of persisting disease. Categorisation of risk is the basis for choice of chemotherapy to achieve good outcomes. Metastases to liver and brain remain problems in management; the development of 'new' metastases during chemotherapy is a very poor prognostic factor. In the variant of twinning with molar gestation and coexisting fetus, it is important to elucidate the fetal karyotype in planning management: a 69XXX fetus is not salvageable but a normal 46XX or 46XY fetus faces the prospect of early preterm delivery. The placental-site tumour is very rare; localised disease is curable by surgery; chemotherapy is less effective in disseminated disease. From collated worldwide data, the recurrence rate after one mole is 1.3% and after two or more is 20%. Reproductive outcome in subsequent pregnancies, even after multidrug chemotherapy, is not different from the general population. Because of the increased risk long-term of second tumours after multidrug chemotherapy a closer surveillance of these patients is necessary Conclusion: In general, the disease in its persisting or malignant form is 'a cancer model par excellence' because of an identifiable precursor condition, a reliable HCG marker, and sensitivity of the disease to cytotoxic drugs. With current management, retention of fertility is possible and normal reproductive outcome assured.

Efeitos dos ácidos húmicos provenientes de aterro sanitário em plantas

O processo de tratamento biológico dos lixiviados de aterros sanitários resulta na geração de grandes quantidades de lodo, caracterizados por conterem altas taxas de matéria orgânica. Por meio do fracionamento químico da matéria orgânica são obtidos os ácidos húmicos (AH), fração de comprovada eficiência sobre o crescimento vegetal, promovendo melhorias no desenvolvimento das plantas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar quimicamente os AH extraídos do lodo de lixiviado de aterro sanitário e avaliar os efeitos da aplicação de diferentes doses dos AH por meio de análises biológicas em plantas, visando minimizar os potenciais riscos da utilização do lodo in natura. Por meio de caracterizações químicas, o ácido húmico apresentou elevados teores de carbono e nitrogênio, podendo constituir uma importante fonte de nutrientes para as plantas. Além disso, foram observadas alterações nas taxas de absorção, na bioconcentração e na translocação de alguns nutrientes. Com relação à análise das enzimas antioxidantes, foi possível observar aumento na atividade de algumas enzimas com a aplicação de diferentes doses de AH. Além disto, foram constatadas alterações citogenéticas por meio da análise de células meristemáticas e F1 de Allium cepa. Influências sobre o crescimento da planta também são reportadas, por meio de aumentos expressivos na área radicular e na altura de Zea mays. Em geral, os dados de crescimento revelaram um maior investimento da planta na parte aérea, provavelmente associado com a melhor eficiência do sistema radicular. Além disso, também foram reportadas alterações na espessura da epiderme. Neste contexto, apesar dos benefícios nutricionais e da comprovada atuação dos AH sobre o metabolismo vegetal, os seus efeitos biológicos sobre enzimas do estresse oxidativo e a sua capacidade citotóxica precisam ser melhor investigados. Devido à complexidade do resíduo, a utilização de análises químicas, genéticas, enzimáticas, fisiológicas e anatômicas foi uma importante ferramenta para a avaliação da possível aplicação dos ácidos húmicos em plantas.

Prospecção de toxicidade de fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa

Apesar dos benefícios econômicos dos agrotóxicos para a agricultura, os efeitos negativos à saúde humana e ao meio ambiente são questionados. Dentre os agroquímicos que são usados na agricultura, destacam-se os fungicidas, que são utilizados em grande quantidade nas lavouras para controle de doenças. Com intuito de verificar os danos ocasionados por esses compostos, diversos métodos de avaliação têm sido utilizados na análise de toxicidade e mutagenicidade dos agrotóxicos. As análises macroscópicas (germinação e crescimento radicular) e microscópicas (índice mitótico, aberrações cromossômicas e nucleares) são importantes na determinação da toxicidade de compostos lançados ao meio ambiente, porque permite averiguar danos na germinação, no desenvolvimento da plântula e no ciclo celular. No entanto, para melhor compreensão dos mecanismos moleculares da mutação e de seus efeitos sobre a população exposta à contaminação ambiental, os marcadores moleculares oferecem perspectivas, por medir o efeito direto da exposição sobre o DNA. O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial tóxico dos fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa. Os resultados indicam redução nos parâmetros de germinação, crescimento radicular e índice mitótico nas maiores concentrações para os princípios ativos difenoconazol, tebuconazol, procimidona e iprodiona, quando comparados ao controle negativo, mostrando que os princípios apresentaram efeito genotóxico, citotóxico, fitotóxico para as raízes de Allium cepa pela alta frequência de aberrações cromossômicas, nucleares e redução do índice mitótico. Os resultados moleculares indicaram mudança no perfil de amplificação dos primers SSR (Sequência Simples Repetitiva) e o ISSR (Inter Sequência Simples Repetitiva), após a exposição do Allium cepa aos princípios ativos, incluindo alterações na perda, ganho e mudança na intensidade de banda. A perda e o ganho de bandas aconteceram à medida que aumentou a concentração dos princípios ativos. O método de agrupamento e as distâncias e dissimilaridades mostraram relação de dose-dependência, pois conseguiu separar as maiores concentrações do controle negativo para os princípios ativos no ISSR e SSR, com exceção dos princípios procimidona e iprodiona no SSR. Esses dados indicam que possui relação entre as análises utilizadas, sendo indicadores confiáveis para detectar alterações por substâncias químicas. Os marcadores moleculares ISSR e SSR são ferramentas eficientes em avaliar alterações ocasionadas no DNA por fungicidas podendo ser utilizada em estudos de toxicidade.

Qualidade da água da lagoa Juara (Serra/ES) : avaliações físicas, químicas e respostas fisiológicas e citogenéticas em plantas

A gestão dos recursos hídricos necessita da integração entre os critérios físicos e químicos, e os aspectos bióticos, os quais possibilitam identificar os efeitos combinados de substâncias e avaliar suas influências. Os sistemas testes Allium cepa e Tradescantia pallida, são utilizados para o estudo da poluição aquática a partir de aspectos citogenéticos. Além destes biomarcadores, os teores de clorofila também são utilizados em estudos de estresse devido ao reflexo a múltiplos fatores. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade da água da lagoa Juara (Município de Serra/ES) pela análise integrada de aspectos físicos, químicos e ecotoxicológicos a partir de estudos citogenéticos em A. cepa e T. pallida, e fotossintéticos nesta última espécie. Foram definidas três estações amostrais ao longo da lagoa e a partir de amostras de água foram analisados parâmetros tais como condutividade, oxigênio dissolvido, concentração de nutrientes e metais. A determinação dos metais ocorreu por análises de espectrometria de massa. O teste do A. cepa foi realizado a partir sementes germinadas em amostras de água da lagoa. Com plantas de T. pallida, foi realizado o ensaio da mitose em ponta de raiz de T. pallida e dosado os teores de pigmentos cloroplastídicos em folhas totalmente expandidas. Para tanto, foi realizado ensaio utilizando-se a água da lagoa como solvente para solução de Hoagland onde estacas previamente enraizadas de T. pallida foram expostas durante 24 horas e 40 dias para as avaliações citogenéticas e fotossintéticas, respectivamente. Foi realizado novo teste do A. cepa nas águas da lagoa após os 40 dias de ensaio para aferir a manutenção das propriedades químicas das amostras. A avaliação citogenética nas duas espécies envolveu a análise dos índice mitótico (IM), índice de aberrações cromossômicas (AC) e frequência de micronúcleos (MN). Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância seguida pelo teste de Tukey (p < 0.05) para a comparação dos tratamentos durante a mesma campanha, e teste de Bonferroni (p < 0,05) para a comparação entre as campanhas. Os resultados físicos e químicos mensurados demonstram que a lagoa Juara apresenta indícios de eutroficação artificial. Duas estações amostrais, em pelo menos uma campanha amostral, apresentaram potenciais citotóxico, genotóxico e mutagênico. Todavia, esses potenciais não demonstram relação com os teores de Fe e Mn quantificados, levando a crer que tais pontos apresentam outros potenciais poluentes. Os danos citogenéticos observados apresentaram efeitos maximizados durante a segunda campanha, demostrando o efeito do período de chuva na intensificação da poluição nesse ambiente. O estudo do metabolismo fotossintético em T. pallida, demonstrou os teores de pigmentos cloroplastídicos relacionados ao elevado aporte de nutrientes presentes nas estações J2 e J3. Sendo o excesso destes, o provável responsável pelo teor inferior de pigmentos em J3. Observa-se que os ensaios com A. cepa e T. pallida responderam de maneira fidedigna ao risco potencial do ambiente, complementando as análises físicas e químicas usualmente utilizadas na avaliação da qualidade da água de ambientes lacustres.

Evaluation of the improvements on pharmacy technicians' work practices after implementation of operational procedures

Several antineoplasic drugs have been demonstrated to be carcinogenic or to have mutagenic and teratogenic effects. The greatest protection is achieved with the implementation of administrative and engineering controls and safety procedures. Objective: to evaluate the improvements on pharmacy technicians' work practices, after the implementation of operational procedures related to individual protection, biologic safety cabinet disinfection and cytotoxic drug preparation. Method: case-study in a hospital pharmacy undergoing a certification process. Six pharmacy technicians were observed during their daily activities. Characterization of the work practices was made using a checklist based on ISOPP and PIC guidelines. The variables studied concerning cleaning/disinfection procedures, personal protective equipment and procedures for preparing cytotoxic drugs. The same work practices were evaluated after four months of operational procedures implementation. Concordance between work practices and guidelines was considered to be a quality indicator (guidelines concordance practices number/total number of practices x 100). Results: improvements were observed after operational procedures implementation. An improvement of 6,25% in personal protective equipment practice was achieved by changing second pair of gloves every thirty minutes. The major progress, 10%, was obtained in disinfection procedure, where 80% of tasks are now realized according to guidelines.By now, we hot an improvement of only 1% at drug preparation procedure by placing one cytotoxic drug at a time inside the biological safety cabinet. Then, 85% of practices are according to guidelines. Conclusion: before operational procedures implementation 80,3% of practices were according to the guidelines, while now is 84,4%. This indicates that is necessary to review the procedures frequently in the benefit to reduce the risks associated with handling cytotoxic drugs and maintenance of drug specifications.

Segurança no circuito do medicamento citotóxico: contributos para a avaliação da realidade hospitalar em Portugal

Introdução: O medicamento citotóxico é definido pelas suas características de genotoxicidade, mutagenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade, toxicidade reprodutiva e toxicidade orgânica em baixas doses. Deste modo, existe uma grande preocupação no que concerne ao manuseamento deste tipo de medicamentos, devido aos riscos ocupacionais que podem surtir da exposição a que os profissionais de farmácia envolvidos estão sujeitos. Objectivos: Analisar a realidade da farmácia hospitalar face ao cumprimento das normas e procedimentos preconizados pelas actuais guidelines para o manuseamento seguro de medicamentos citotóxicos, e identificar as lacunas existentes, conduzindo à promoção de práticas centradas na minimização do risco de exposição/contaminação dos profissionais e do ambiente. Material e Métodos: Foi realizada uma pesquisa bibliográfica sistemática sobre o tema, utilizando-se como instrumento de recolha de dados um inquérito por questionário, em que os TDT de Farmácia foram abordados sobre os procedimentos verificados no hospital onde exercem actividade profissional. Resultados: Face ao cumprimento das normas na recepção, armazenamento e transporte de medicamentos citotóxicos, verifica-se que todos os hospitais se encontram acima da média. Apesar desta evidência, é na fase de transporte que se verifica um menor cumprimento. As principais lacunas detectadas foram ao nível da não utilização de EPI nas fases de recepção e armazenamento; a recepção de medicamentos citotóxicos em conjunto com outros medicamentos; a falta de um sistema de ventilação no local de armazenamento e, ainda, ausência de portas de correr e/ou gavetas fechadas nos carros de transporte de medicamentos citotóxicos. Conclusões: Os resultados deste estudo revelam alguma heterogeneidade de procedimentos nos hospitais Portugueses, sugerindo a necessidade de intervenção e reformulação do programa de segurança e gestão de risco desenvolvidos para o manuseamento de citotóxicos.

Contributo para a utilização segura de câmaras de segurança biológica na manipulação de medicamentos citotóxicos

Mestrado em Segurança e Higiene do Trabalho.

Protein-ligand docking study: diterpenes from Juniperus brevifolia as anticancer and antimicrobial agentes

REDCAT: Natural Products and related Redox Catalysts: Basic Research and Applications in Medicine and Agriculture, Aveiro, 25-27 Novembro de 2012.

Bioactive meroditerpenes from Cystoseira abies-marina, collected from the coast of S. Miguel island

3rd Portuguese Meeting on Medicinal Chemistry and 1st Portuguese-Spanish-Brazilian Meeting on Medicinal Chemistry, Aveiro, 28-30 Novembro 2012.