Classical simulation of deposition of thiophene oligomers on TiO(2)-anatase: Relevance of long-range electrostatic interactions

We performed classical molecular dynamics simulations of the vapor-deposition of alpha-T4 oligomers on the TiO(2)-anatase (101) surface, comparing different sets of charges associated with the atoms of the model. The potential energy surfaces for alpha-T4 and TiO(2) were described by re-parametrizations of the Universal force field with charges given by the charge equilibration (QEq) scheme, or with fixed charges obtained by an ab initio method using the Hirshfeld partition. The two sets of charges lead to completely different results for the interface formation, and for the characteristics of the organic film, with a clearly defined alpha-T4 contact layer in the QEq case, and a more homogeneous molecular distribution when using Hirshfeld charges. The main reason for the discrepancy was found to be the incorrect charge assignment given by QEq to the sulfur and alpha-carbon atoms in thiophenes, and highlight the relevance of long-range interactions in the organization of molecular films. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Efeito da administração crônica pós-natal dos ácidos propiônico e metilmalônico sobre o comportamento de ratos no labirinto aquático de Morris (Water Maze) e sobre alguns parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo em hipocampo

As acidemias propiônica e metilmalônica são desordens neurometabólicas hereditárias caracterizadas por progressiva deterioração neurológica, retardo mental, atraso no desenvolvimento psicomotor, convulsões e coma. A fisiopatologia do dano cerebral característico destas doenças ainda é pouco conhecida. No presente estudo investigamos o efeito de administração crônica (5o ao 28o dia de vida) dos ácidos propiônico (PA) e metilmalônico (MA), que são os metabólitos acumulados em maiores concentrações nos pacientes portadores das acidemias propiônica e metilmalônica, respectivamente, sobre o comportamento de ratos e sobre alguns parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo no hipocampo dos animais. O comportamento dos animais foi avaliado 30 dias após o término do tratamento nas tarefas do labirinto aquático de Morris e no campo aberto. Os parâmetros bioquímicos avaliados foram o potencial antioxidante total do tecido (TRAP) e a atividade das enzimas catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase. Todos as análises bioquímicas foram realizadas em hipocampo, estrutura fundamental para a localização espacial, requerida na tarefa do labirinto aquático de Morris. As doses de propionato ou metilmalonato foram administradas de acordo com as preconizadas nos modelos experimentais destas acidemias, tomando em consideração o peso e da idade dos animais. Os ratos controles receberam solução salina nos mesmos volumes. A administração de PA ou MA não alterou o peso dos animais. Entretanto foi encontrado um déficit de aprendizado e memória no grupo tratado com PA, e um déficit de memória no grupo tratado com MA. Nenhum dos grupos testados apresentou alterações na atividade motora (número de cruzamentos) na tarefa do campo aberto. Também determinamos o efeito da co-administração de ácido ascórbico nos animais tratados cronicamente com PA ou MA. Encontramos que o ácido ascórbico preveniu o déficit cognitivo provocado pela administração crônica de PA e MA. Por outro lado, verificamos que os tratamentos crônicos com PA e MA diminuíram o TRAP no hipocampo dos ratos, sem alterar a atividade de nenhuma das enzimas testadas. A prevenção do déficit cognitivo pelo ácido ascórbico associada à diminuição do TRAP no hipocampo dos animais tratados cronicamente com PA ou MA sugere que o estresse oxidativo pode estar relacionado com o déficit cognitivo encontrado no presente trabalho. Concluindo, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode estar envolvido, ao menos em parte, com o dano cerebral nos pacientes afetados pelas acidemias propiônica e metilmalônica.

Perfusão do fígado de rato com triton x-100: remoção e caracterização de uma aminopeptidase cinino-conversora e de uma arilamidase

Resumo não disponível

Efeito da amônia sobre as convulsões e a inibição da sucinato desidrogenase induzidas por ácido metilmalônico

A hiperamonemia é um achado comum em crianças com acidemia metilmalônica, um erro inato do metabolismo caracterizado por retardo mental, convulsões e acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA). Embora existam evidências de que o MMA induza convulsões por inibição da sucinato desidrogenase (SDH), muito pouco se sabe sobre a contribuição da hiperamonemia para o desenvolvimento das convulsões nestes pacientes. No presente estudo investigou-se os efeitos do acetato de amônio sobre a ação convulsivante do MMA in vivo e do cloreto de amõnio sobre a inibição da SDH estriatal induzida pelo MMA in vitro. Ratos adultos foram injetados com acetato de amônio (1,5 mmol/kg, s.c.) ou acetato de sódio (1,5 mmol/kg, s.c.) e, após 5 minutos, injetados unilateralmente no estriado com MMA (3 µmol/µl) neutralizado para pH 7,4 com NaOH ou NaCl (4,5 µmol/µl). O pré-tratamento com acetato de amônio aumentou o número e durações dos episódios convulsivos induzidos pelo MMA. O cloreto de amônio não teve efeito sobre a atividade da sucinato desidrogenase e não alterou a inibição da SDH induzida pelo MMA in vitro. Estes resultados sugerem que a amônia potencializa os efeitos comportamentais induzidos pelo MMA por mecanismos que não envolvam adicional inibição da SDH. Este estudo provê evidências de que a hiperamonemia pode potencializar os efeitos neurotóxicos do MMA.

Sistema purinérgico na memória da tarefa de esquiva inibitória em córtex cingulado e córtex pré-frontal de ratos

A memória pode ser definida como o armazenamento e a evocação de uma informação aprendida. Sendo um processo dinâmico, requer a ativação de diversos sistemas para que a informação adquirida seja consolidada. O ATP é um importante neurotransmissor que, após a sua liberação e conseqüente ativação de seus receptores específicos, precisa ser inativado. Esta remoção do ATP da fenda sináptica ocorre através de sua hidrólise promovida pelas ectonucleotidases. Como um dos produtos da hidrólise do ATP, a adenosina é considerada um potente neuromodulador e exerce suas ações através de receptores específicos com ações excitatórias (A2A e A2B ) ou inibitórias (A1 e A3). Vários trabalhos já demonstraram a participação do sistema purinérgico nos processos relacionados a memória da tarefa da esquiva inibitória. Estudos realizados em nosso laboratório mostraram a participação das ectonucleotidases sinaptossomais de hipocampo, córtex entorrinal e córtex parietal na consolidação da memória para esquiva inibitória. No entanto, existem poucos estudos a respeito do sistema purinérgico nos mecanismos de consolidação da memória em outras regiões cerebrais, tais como o córtex cingulado anterior (CA) e posterior (CP) e a área pré-central medial (FR2). Portanto, na primeira parte deste estudo, avaliamos as atividades ectonucleotidásicas em sinaptossomas de CA, CP e FR2 de ratos submetidos à tarefa de esquiva inibitória. Nossos resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP em sinaptossomas de FR2 e CA; e na hidrólise de ADP em sinaptossomas de FR2 e CP. Este aumento na hidrólise de ATP e ADP ocorreu devido ao choque administrado na tarefa, já que o grupo de animais que não recebeu choque não apresentou alterações na hidrólise de ATP e ADP. Este efeito observado provavelmente não está associado à consolidação da memória, mas a mudanças neuroquímicas e neurohumorais induzidas pelo estresse após o choque. Além disso, foi observado um aumento relacionado ao aprendizado na atividade ATPásica e ADPásica em CP e CA, respectivamente. Estes resultados sugerem fortemente que estas enzimas participam da consolidação da memória em CP e CA. O aumento na hidrólise de ATP e ADP sugere um possível aumento na concentração de adenosina nestas regiões. Portanto, na segunda parte deste estudo, verificamos a influência de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina nas memórias de curta (STM) e de longa (LTM) duração na tarefa de esquiva inibitória. Então, neste estudo administramos intrafusões de análogos de adenosina em CP, imediatamente após o treino em esquiva inibitória. Os resultados demonstraram que a intrafusão de DPCPX, um antagonista de receptores A1, em CP, na concentração de 50 nM, aumentou significativamente a retenção da tarefa em ambas STM e LTM. Além disso, a administração de CPA, um agonista de receptores A1 de adenosina, não alterou ambas STM e LTM nas concentrações testadas. Portanto, este estudo sugere que os receptores A1 exercem uma modulação inibitória em CP tanto na STM quanto na LTM para o aprendizado de esquiva inibitória. A regulação dos níveis de ATP e adenosina pelas ectonucleotidases em CP, CA e FR2 controlaria a ativação dos receptores A1 nestas estruturas, podendo exercer efeitos modulatórios na consolidação da memória nestas estruturas.

Análise da vazão máxima outorgável e da introdução simplificada da qualidade da água no processo de outorga da bacia do rio Gramame (PB)

O estado dos recursos hídricos da bacia do rio Gramame, localizada no litoral sul do Estado da Paraíba, tem se revelado insustentável, principalmente nesses últimos anos. Tanto a escassez quantitativa quanto a qualitativa inserem-se no contexto da bacia, tornando frreqüentes os conflitos entre os principais usuários de água (abastecimento urbano, indústrias e irrigantes). Em virtude disso, surge a necessidade de implementação de um sistema de outorga na bacia, para uma alocação eficiente das disponibidades hídricas. Neste trabalho, foram abordados os principais problemas para essa implementação: (a) a definição da vazão m[axima outorgável; e (iii) a intrtodução dos aspectos qualitativos da água. Par ao primeiro problema, foram estabelecidos e avaliados como passíveis de emprego na bacia os seguintes critérios de outorga: (a) vazão excedente; (b) garantia de suprimento; (c) vazão de referência com probabilidade de superação de 90% (Q90); (d) 2 vazões de referência Q90 para as estações seca e chuviosa e (e) 12 vazões de referência Q90 referentes a cada mês do ano. No tocante à qualidade da água no processo de outorga, foi verificada a sensibilidade do sistema hídrico e suas demandas à consideração dos poluentes lançados nos cursos dágua da bacia como demanda para diluição da concentração de Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). ALém disso, foi abordado, de forma simplificada, o processo de autodepuração da DBO, através de coeficientes de depuração, visando avaliar a relevância das vazões liberadas para novoo usos nas seções à jusante dos deesejos de efluentes. Através da comparação dos parâmetros de desempenho (garantia volumétrica, garantia temporal, garantia crítica temporal, garantia volumétrica mensal mínima, resiliência e vulnerabilidade) obtidos da simulação de cada cenário da bacia, de ocorrência em curto prazo, foram avaliados os critérios de outorga e a introdução da qualidade da água. Priorizando o atendimento das demandas para abastecimento urbano, em ordem crescente de redução do suprimento das demandas existentes na bacia, os critérios de determinação da vazão máxima outorgável puderam ser ordenados como: vazão excendente, vazões de referência mensais, vazões de referência das estações seca e chuvosa, vazão de referência única e garantia de suprimento. Quanto à consideração das demandas para diluição de despejos, verificou-se que, de modo geral, estas poucos reduziram o suprimento das demandas já instaladas na bacia e também não foram significativas as vazões liberadas pela autodepuração a ponto de melhorar o atendimento das seções por ela afetadas. Entretanto, excetuando a demanda para diluição dos efluentes domésticos do município do Conde, foi verificada a inviabilidade de suprimento dos atuais lançamentos de efluentes na bacia, cujo percentual de atendimento não atingiu 50% do volume requerido.

Alterações do conteúdo de S100B durante o desenvolvimento em tecido encefálico, líquor e cultura de astrócitos corticais de rato

A S100B é uma proteína ligante de cálcio expressa e secretada por astrócitos. Em culturas de neurônios a S100B estimula a sobrevivência e extensão de neuritos. Estudos de imunocitoquímica e hibridização do RNAm in situ indicaram um aumento pós-natal desta proteína num período coincidente com a sinaptogênese em ratos. Neste trabalho foi investigado o imunoconteúdo da S100B por ELISA no tecido cerebral e no líquor de ratos durante o desenvolvimento pós-natal bem como o conteúdo e secreção de S100B em culturas de astrócitos corticais de diferentes idades. Também foi avaliada a ontogenia da GFAP e GAP-43, dois possíveis alvos da S100B. Os resultados mostram um acúmulo de S100B em hipocampo, córtex cerebral e cerebelo entre a segunda e quarta semana pós-natal. Uma redução da S100B no líquor foi observada após um período considerado crítico para a sinaptogênese em roedores. Um perfil semelhante foi observado durante o envelhecimento das culturas. Este estudo contribui com a idéia de que a S100B é uma proteína glial importante durante o desenvolvimento cerebral e que alterações nos seus níveis extracelulares devem estar envolvidos com a plasticidade sináptica.

Marcadores periféricos de dano ao sistema nervoso central : a proteína S100B e atividades ecto-nucleotidásicas

A S100B é uma proteína ligante de cálcio, de massa molecular de 21kDa, expressa principalmente por astrócitos. Esta proteína tem sido implicada em atividades funcionais tanto intra quanto extracelulares. Muitos estudos têm sugerido que intracelularmente ela está envolvida na modulação de proteínas do citoesqueleto e na regulação do ciclo celular. A proteína S100B pode ser secretada pelos astrócitos e desenvolver atividades extracelulares, que parecem depender de sua concentração. Em concentração nanomolar ela atua como fator trófico às células neurais, enquanto que em concentrações micromolar ela pode ser neurotóxica. A quantificação da proteína S100B no sangue e líquor se correlaciona com a extensão e intensidade do dano ao sistema nervoso central (SNC) o que permite sua utilização em estudos como marcador bioquímico de dano ou disfunção cerebral. Esta tese está dividida em três partes. A primeira parte propõe a utilização clínica da proteína S100B em patologias com envolvimento do SNC como a síndrome de Down, mielopatia associada ao vírus HTLV-I, lupus eritematoso sistêmico, epilepsia secundária a neurocisticercose e, além disso demonstramos a curva de ontogenia da S100B no sangue. Na segunda parte descrevemos uma atividade de nucleotidases presente em líquor de ratos, e finalmente, na terceira parte abordamos as perspectivas para futuros trabalhos. Os resultados obtidos pelo nosso grupo e por outros grupos internacionais relatam que a proteína S100B é um marcador inespecífico para evidenciar dano ou disfunção em doenças agudas e crônicas com envolvimento do SNC. Apesar de ser um marcador inespecífico, medidas dos níveis da proteína S100B tem grande sensibilidade para detectar uma resposta celular cerebral inespecífica. Além disso, demonstramos que estudos clínicos com esta proteína necessitam controles pareados por idade e sexo. A atividade nucleotidásica descrita no líquor de ratos hidrolisa preferencialmente o GDP e UDP comparado aos outros nucleotídeos. Nas perspectivas, os resultados mostrados são referentes a experimentos preliminares o que torna prematuro qualquer tipo de conclusão.

Inscrevendo a sexualidade : discursos e práticas de professoras das séries iniciais do ensino fundamental

Nesta Tese investigo como a sexualidade vem sendo tratada nas salas de aula das séries iniciais do Ensino Fundamental, do município de Rio Grande/RS. Para tanto, analiso narrativas de professoras das séries iniciais que participaram do curso “Discutindo e refletindo sexualidade-AIDS com professoras das séries iniciais do Ensino Fundamental”. Nesse estudo, tomo a sexualidade como uma construção histórica e cultural, que inscreve comportamentos, linguagens, desejos, crenças, identidades, posturas no corpo, através de estratégias de poder/saber sobre os sexos. O entendimento de que questões centrais, no estudo da sexualidade, referem-se ao papel das culturas, dos seus sistemas de significação e relações de poder, uma vez que essas encontram-se implicadas na constituição dos sujeitos, levou-me a estabelecer algumas conexões com os Estudos Culturais nas suas vertentes pós-estruturalistas, bem como com algumas proposições de Foucault. Tais entendimentos moveram-me na direção de examinar como as práticas escolares das professoras das séries iniciais atuam nos processos de inscrição da sexualidade das crianças. Nesse sentido, utilizei como uma estratégia metodológica a realização do curso acima referido, que funcionou como um espaço narrativo, no qual as professoras participaram de um processo de contar, ouvir, e contrapor histórias a respeito das práticas escolares relacionadas à sexualidade. Outra estratégia correspondeu à análise das narrativas dessas professoras – falas, textos, desenhos, cartazes, dramatização –, produzidas durante as atividades desenvolvidas no transcorrer do curso. Num primeiro movimento analisei todos os encontros que compuseram o curso, a fim de conhecer tanto os discursos como as estratégias predominantes nas pedagogias dessas professoras. Esse percurso mostrou-me aqueles encontros em que se tornaram visíveis as estratégias utilizadas pelas professoras para tratarem a sexualidade em suas salas de aula. Assim, elegi os seguintes encontros: “Como fui parar aí dentro? – Sistema reprodutor feminino e masculino” e “Sexualidade e AIDS na sala de aula”. Esses movimentos configuraram esta Tese na forma de três artigos: “Discutindo e refletindo sexualidade-AIDS com professoras das séries iniciais do Ensino Fundamental”; “Falando com professoras das séries iniciais do Ensino Fundamental sobre sexualidade na sala de aula: a presença do discurso biológico”, e “Sexualidade nas salas de aula: pedagogias escolares das professoras das séries iniciais do Ensino Fundamental”. Esse estudo possibilitou-me ver que, nos espaços e nas práticas escolares, se fala rotineiramente na sexualidade: seja nas disposições dos corpos conforme os sexos – nas filas e na sala de aula, nas brincadeiras –; seja naquelas situações vinculadas às práticas de sala de aula, quando a sexualidade torna-se presente através dos programas escolares, dos projetos de educação sexual, das palestras e/ou das perguntas e outras “manifestações” das crianças, em que atuam geralmente os discursos hegemônicos como o biológico, o da famíla-reprodução e o da criança inocente-assexuada. Assim, no espaço escolar articulam-se distintos discursos e práticas direcionados à sexualidade das crianças através de estratégias de inscrição das identidades de gênero e sexuais nos seus corpos, como também de regulação dos fenômenos biológicos, como a gravidez, as doenças sexualmente transmissíveis e a AIDS.

Caracterização molecular da mutação pso8-1/rad6 de Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoadição de psoralenos, à radiação UVC e a mutágenos químicos

Um novo mutante isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae, sensível à fotoativação de psoralenos mono- e bi-funcionais, à UVC e ao MNNG, complementou o fenótipo de sensibilidade à fotoadição de psoralenos conferido pelas mutações pso1 a pso7 e assim foi chamado pso8-1. O duplo mutante pso8-1 rad4-4 foi altamente sensível à UVC, indicando assim uma interação sinergística dos dois mutantes alelos. A clonagem molecular pela complementação do fenótipo de sensibilidade à radiação UVC do mutante pso8-1 e estudos genéticos revelaram que pso8-1 é alelo ao gene RAD6. O produto do gene RAD6/UBC2 é uma enzima conjugada à ubiquitina envolvida em reparação de DNA, esporulação, recombinação, indução de mutagênese, degradação de proteínas, genes silenciosos, transposição Ty1. Enquanto o mutante pso8-1 apresenta um fenótipo mutador espontâneo e possui baixa mutabilidade induzida a mutágenos, a esporulação de diplóides homoalélicas mostrou eficiência próxima à da linhagem selvagem. A análise da seqüência do mutante alelo mostrou que pso8-1 contém uma nova, e até agora desconhecida, transição T→C no nucleotídeo 191, levando à substituição de uma prolina altamente conservada por uma leucina na posição 64 (Rad6-[P64L]) que pode ter severas conseqüências na estrutura terciária da proteína mutada, e conseqüente ligação a pRad18.

Efeitos da apomorfina e de um produto derivado de sua autoxidação em diferentes modelos biológicos

Apomorfina é um potente agonista dopaminérgico D1/D2, utilizada no tratamento da Doença de Parkinson. Em maio de 2001, apomorfina HCl foi aprovada para utilização no tratamento da disfunção erétil, aumentando o número de usuários potenciais deste fármaco. Estudos sugerem que apomorfina e outros agonistas dopaminérgicos podem induzir neurotoxicidade mediada por seus derivados de oxidação semiquinonas e quinonas, os quais levam à formação de espécies reativas de oxigênio. Os objetivos do presente estudo foram de avaliar os possíveis efeitos genotóxicos, antimutagênicos, citotóxicos de apomorfina (APO) e de um produto derivado de sua oxidação, 8-oxo-apomorfina-semiquinona (8-OASQ), utilizando o teste Salmonella/microssoma, Mutoxiteste WP2, ensaio Cometa e teste de sensibilidade em Saccharomyces cerevisiae. Em adição, foram avaliados os efeitos de APO e 8-OASQ sobre a memória e o comportamento em ratos (tarefa de esquiva inibitória, comportamento e habituação ao campo aberto) e o comportamento estereotipado em camundongos. Ambos compostos induziram mutações por erro no quadro de leitura em linhagens de S. typhimurium TA97 e TA98, sendo que 8-OASQ foi cerca de duas vezes mais mutagênico que APO, na ausência de S9 mix. Para linhagens que detectam mutágenos oxidantes, 8-OASQ foi mutagênico, enquanto APO foi antimutagênico, inibindo a mutagenicidade induzida por H2O2 e t-BOOH em linhagens de S. typhimurium e derivadas WP2 de E. coli. O S9 mix inibiu todos os efeitos mutagênicos, provavelmente retardando a oxidação de APO ou devido à conjugação de APO e seus produtos de autoxidação, como 8-OASQ, a proteínas do S9. Em testes de sensibilidade com S. cerevisiae, APO foi citotóxica para algumas linhagens apenas nas doses mais altas. Para 8-OASQ este efeito foi dose-depende para todas as linhagens, sendo que as mutantes deficientes em catalase (ctt1), superóxido dismutase (sod1) e yap1 foram as mais sensíveis. APO protegeu as linhagens de S. cerevisiae contra danos oxidativos induzidos por concentrações altas de H2O2 e t-BOOH, enquanto que 8-OASQ aumentou os efeitos pró-oxidantes e induziu respostas adaptativas para aqueles agentes. APO e 8-OASQ induziram efeitos de prejuízo na memória de curta e de longa duração em uma tarefa de esquiva inibitória em ratos. APO, mas não 8-OASQ, prejudicou a habituação a um novo ambiente de forma dose-dependente. Os efeitos de prejuízo de memória não foram atribuídos à redução da nocicepção ou outra alteração inespecífica de comportamento, visto que nem APO e nem 8-OASQ afetaram a reatividade ao choque nas patas e comportamento durante a exploração ao campo aberto. Os resultados sugerem, portanto, que os produtos de oxidação de dopamina ou de agonistas dopaminérgicos podem induzir deficiências cognitivas.APO, mas não 8-OASQ, induziu comportamento estereotipado em camundongos machos CF-1. A falta da indução deste comportamento por 8-OASQ sugere que a autoxidação de APO causa a perda na sua habilidade de ligar-se a receptores dopaminérgicos. Pelo ensaio Cometa, 8-OASQ provocou danos ao DNA do tecido cerebral de camundongos sacrificados 1 h e 3 h, mas não 24 h após sua administração, enquanto que APO induziu um fraco aumento da freqüência de dano ao DNA 3 h após o tratamento. Esses resultados sugerem que ambos APO e 8-OASQ desempenham uma atividade genotóxica no tecido cerebral.

Papel das reservas intracelulares de cálcio no efeito de aminoácidos excitatórios sobre a fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em hipocampo de ratos jovens

A proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é uma proteína da classe dos filamentos intermediários, exclusivamente expressa em astrócitos no sistema nervoso central (SNC). A função específica da fosforilação desta proteína é ainda desconhecida. No entanto, tem sido demonstrado que o equilíbrio dinâmico entre o estado fosforilado e desfosforilado de sítios específicos da GFAP pode regular a polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários durante eventos de estruturação do citoesqueleto glial. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a fosforilação da GFAP em hipocampo de ratos jovens (P12-P16) é estimulada no mesmo nível por glutamato, via um receptor glutamatérgico metabotrópico do grupo II (mGluR II), e pela ausência de Ca2+ externo (presença de EGTA). Entretanto, o tratamento simultâneo com glutamato e EGTA não resulta em efeito sinergístico, sugerindo um mesmo mecanismo de ação para estas duas situações estimulatórias da fosforilação da GFAP (WofchuK & Rodnight, 1994; Kommers et al., 1999; Rodnight et al., 1997). Este mecanismo provavelmente não envolve reservas intracelulares de Ca2+ associadas a receptores de IP3, uma vez que mGluRs II estão envolvidos com o mecanismo de transdução de sinal via adenilato ciclase e não via hidrólise de fosfoinositídios. Uma hipótese proposta é de que o glutamato, via mGluR, bloqueia canais de Ca2+ tipo L, inibindo uma cascata de desfosforilação dependente de Ca2+, associada a GFAP (Rodnight et al., 1997). Interessantemente, os receptores rianodina (RyRs) presentes nas reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por tais receptores estão associados com canais de Ca2+ tipo L (Chavis et al., 1996). Com base nestes dados, buscou-se neste trabalho avaliar se a modulação glutamatérgica da fosforilação da GFAP em fatias de hipocampo de ratos jovens envolve as reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs e se o Ca2+ proveniente destas reservas atua de maneira semelhante ao Ca2+ oriundo do espaço extracelular. Nossos resultados mostraram que há uma evidente participação do Ca2+ proveniente das reservas intracelulares reguladas por RyRs no mecanismo modulatório da fosforilação da GFAP via ativação de mGluRs em fatias de hipocampo de ratos jovens, uma vez que a cafeína e a rianodina (agonistas de RyRs) revertem totalmente o efeito estimulatório do agonista glutamatérgico metabotrópico 1S,3R-ACPD sobre a fosforilação da proteína e este efeito da cafeína é inibido por dantrolene (antagonista de RyRs). Talvez o Ca2+ oriundo das reservas reguladas por RyRs tenha o mesmo papel do Ca2+ proveniente do espaço extracelular, ou seja, desencadeia uma cascata de desfosforilação associada à GFAP mediada pela calcineurina, uma vez que quelando o Ca2+ intracelular livre com BAPTA-AM, após a mobilização destas reservas, tal efeito não ocorre. A participação de receptores adenosina (AdoRs) e do AMP cíclico (AMPc) ainda permanece a ser estudada. Entretanto, é sabido que em ratos jovens a ativação de mGluRs aumenta a formação de AMPc potenciando o efeito de outros tipos de receptores, como os AdoRs e, provavelmente, isto é mediado por um mGluR II (Schoepp & Johnson, 1993; Winder & Conn, 1996). Neste trabalho mostrou-se justamente o possível envolvimento de tais mecanismos de transdução de sinal na modulação da fosforilação da GFAP, pois a adenosina deaminase (enzima que metaboliza adenosina endógena) e a forscolina (agente que estimula a enzima adenilato ciclase) alteraram o nível de fosforilação da GFAP. Estes resultados evidenciam o envolvimento das reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs no mecanismo de transdução de sinal que modula o estado de fosforilação GFAP mediado pela ativação de mGluRs.

Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteína

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

Efeitos in vitro e in vivo da prolina sobre a atividade da creatinaquinase em encéfalo de ratos jovens

Hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado pela deficiência de ∆1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, levando ao acúmulo de prolina no plasma e nos tecidos. Embora sintomas neurológicos ocorram em diversos pacientes, a neurotoxicidade da prolina ainda é controversa. O principal objetivo do presente estudo foi investigar o efeito das administrações aguda e crônica de prolina na atividade da creatinaquinase em córtex, cerebelo e encéfalo médio de ratos Wistar. No tratamento agudo, uma única injeção subcutânea de prolina foi administrada em ratos de 22 dias de vida. No tratamento crônico, a prolina foi administrada quatro vezes ao dia, do 6o ao 21o dia de vida. Os resultados mostraram que a atividade da creatinaquinase foi inibida significativamente nas três estruturas dos ratos submetidos à administração aguda de prolina. Por outro lado, a atividade da enzima aumentou nos animais submetidos à administração crônica. Também foi investigado o efeito in vitro da prolina sobre a atividade da creatinaquinase nas mesmas estruturas encefálicas em ratos de 22 dias não tratados. A prolina inibiu significativamente a atividade da creatinaquinase. Considerando a importância da creatinaquinase na manutenção da homeostase energética encefálica, é possível que a alteração da atividade dessa enzima no encéfalo possa ser um dos mecanismos pelo qual a prolina deva ser neurotóxica.