Caratterizzazione del legame di molecole di interesse farmaceutico alla sieroalbumina umana mediante biocromatografia e dicroismo circolare

Negli ultimi anni, un crescente numero di studiosi ha focalizzato la propria attenzione sullo sviluppo di strategie che permettessero di caratterizzare le proprietà ADMET dei farmaci in via di sviluppo, il più rapidamente possibile. Questa tendenza origina dalla consapevolezza che circa la metà dei farmaci in via di sviluppo non viene commercializzato perché ha carenze nelle caratteristiche ADME, e che almeno la metà delle molecole che riescono ad essere commercializzate, hanno comunque qualche problema tossicologico o ADME [1]. Infatti, poco importa quanto una molecola possa essere attiva o specifica: perché possa diventare farmaco è necessario che venga ben assorbita, distribuita nell’organismo, metabolizzata non troppo rapidamente, ne troppo lentamente e completamente eliminata. Inoltre la molecola e i suoi metaboliti non dovrebbero essere tossici per l’organismo. Quindi è chiaro come una rapida determinazione dei parametri ADMET in fasi precoci dello sviluppo del farmaco, consenta di risparmiare tempo e denaro, permettendo di selezionare da subito i composti più promettenti e di lasciar perdere quelli con caratteristiche negative. Questa tesi si colloca in questo contesto, e mostra l’applicazione di una tecnica semplice, la biocromatografia, per caratterizzare rapidamente il legame di librerie di composti alla sieroalbumina umana (HSA). Inoltre mostra l’utilizzo di un’altra tecnica indipendente, il dicroismo circolare, che permette di studiare gli stessi sistemi farmaco-proteina, in soluzione, dando informazioni supplementari riguardo alla stereochimica del processo di legame. La HSA è la proteina più abbondante presente nel sangue. Questa proteina funziona da carrier per un gran numero di molecole, sia endogene, come ad esempio bilirubina, tiroxina, ormoni steroidei, acidi grassi, che xenobiotici. Inoltre aumenta la solubilità di molecole lipofile poco solubili in ambiente acquoso, come ad esempio i tassani. Il legame alla HSA è generalmente stereoselettivo e ad avviene a livello di siti di legame ad alta affinità. Inoltre è ben noto che la competizione tra farmaci o tra un farmaco e metaboliti endogeni, possa variare in maniera significativa la loro frazione libera, modificandone l’attività e la tossicità. Per queste sue proprietà la HSA può influenzare sia le proprietà farmacocinetiche che farmacodinamiche dei farmaci. Non è inusuale che un intero progetto di sviluppo di un farmaco possa venire abbandonato a causa di un’affinità troppo elevata alla HSA, o a un tempo di emivita troppo corto, o a una scarsa distribuzione dovuta ad un debole legame alla HSA. Dal punto di vista farmacocinetico, quindi, la HSA è la proteina di trasporto del plasma più importante. Un gran numero di pubblicazioni dimostra l’affidabilità della tecnica biocromatografica nello studio dei fenomeni di bioriconoscimento tra proteine e piccole molecole [2-6]. Il mio lavoro si è focalizzato principalmente sull’uso della biocromatografia come metodo per valutare le caratteristiche di legame di alcune serie di composti di interesse farmaceutico alla HSA, e sul miglioramento di tale tecnica. Per ottenere una miglior comprensione dei meccanismi di legame delle molecole studiate, gli stessi sistemi farmaco-HSA sono stati studiati anche con il dicroismo circolare (CD). Inizialmente, la HSA è stata immobilizzata su una colonna di silice epossidica impaccata 50 x 4.6 mm di diametro interno, utilizzando una procedura precedentemente riportata in letteratura [7], con alcune piccole modifiche. In breve, l’immobilizzazione è stata effettuata ponendo a ricircolo, attraverso una colonna precedentemente impaccata, una soluzione di HSA in determinate condizioni di pH e forza ionica. La colonna è stata quindi caratterizzata per quanto riguarda la quantità di proteina correttamente immobilizzata, attraverso l’analisi frontale di L-triptofano [8]. Di seguito, sono stati iniettati in colonna alcune soluzioni raceme di molecole note legare la HSA in maniera enantioselettiva, per controllare che la procedura di immobilizzazione non avesse modificato le proprietà di legame della proteina. Dopo essere stata caratterizzata, la colonna è stata utilizzata per determinare la percentuale di legame di una piccola serie di inibitori della proteasi HIV (IPs), e per individuarne il sito(i) di legame. La percentuale di legame è stata calcolata attraverso il fattore di capacità (k) dei campioni. Questo parametro in fase acquosa è stato estrapolato linearmente dal grafico log k contro la percentuale (v/v) di 1-propanolo presente nella fase mobile. Solamente per due dei cinque composti analizzati è stato possibile misurare direttamente il valore di k in assenza di solvente organico. Tutti gli IPs analizzati hanno mostrato un’elevata percentuale di legame alla HSA: in particolare, il valore per ritonavir, lopinavir e saquinavir è risultato maggiore del 95%. Questi risultati sono in accordo con dati presenti in letteratura, ottenuti attraverso il biosensore ottico [9]. Inoltre, questi risultati sono coerenti con la significativa riduzione di attività inibitoria di questi composti osservata in presenza di HSA. Questa riduzione sembra essere maggiore per i composti che legano maggiormente la proteina [10]. Successivamente sono stati eseguiti degli studi di competizione tramite cromatografia zonale. Questo metodo prevede di utilizzare una soluzione a concentrazione nota di un competitore come fase mobile, mentre piccole quantità di analita vengono iniettate nella colonna funzionalizzata con HSA. I competitori sono stati selezionati in base al loro legame selettivo ad uno dei principali siti di legame sulla proteina. In particolare, sono stati utilizzati salicilato di sodio, ibuprofene e valproato di sodio come marker dei siti I, II e sito della bilirubina, rispettivamente. Questi studi hanno mostrato un legame indipendente dei PIs ai siti I e II, mentre è stata osservata una debole anticooperatività per il sito della bilirubina. Lo stesso sistema farmaco-proteina è stato infine investigato in soluzione attraverso l’uso del dicroismo circolare. In particolare, è stato monitorata la variazione del segnale CD indotto di un complesso equimolare [HSA]/[bilirubina], a seguito dell’aggiunta di aliquote di ritonavir, scelto come rappresentante della serie. I risultati confermano la lieve anticooperatività per il sito della bilirubina osservato precedentemente negli studi biocromatografici. Successivamente, lo stesso protocollo descritto precedentemente è stato applicato a una colonna di silice epossidica monolitica 50 x 4.6 mm, per valutare l’affidabilità del supporto monolitico per applicazioni biocromatografiche. Il supporto monolitico monolitico ha mostrato buone caratteristiche cromatografiche in termini di contropressione, efficienza e stabilità, oltre che affidabilità nella determinazione dei parametri di legame alla HSA. Questa colonna è stata utilizzata per la determinazione della percentuale di legame alla HSA di una serie di poliamminochinoni sviluppati nell’ambito di una ricerca sulla malattia di Alzheimer. Tutti i composti hanno mostrato una percentuale di legame superiore al 95%. Inoltre, è stata osservata una correlazione tra percentuale di legame è caratteristiche della catena laterale (lunghezza e numero di gruppi amminici). Successivamente sono stati effettuati studi di competizione dei composti in esame tramite il dicroismo circolare in cui è stato evidenziato un effetto anticooperativo dei poliamminochinoni ai siti I e II, mentre rispetto al sito della bilirubina il legame si è dimostrato indipendente. Le conoscenze acquisite con il supporto monolitico precedentemente descritto, sono state applicate a una colonna di silice epossidica più corta (10 x 4.6 mm). Il metodo di determinazione della percentuale di legame utilizzato negli studi precedenti si basa su dati ottenuti con più esperimenti, quindi è necessario molto tempo prima di ottenere il dato finale. L’uso di una colonna più corta permette di ridurre i tempi di ritenzione degli analiti, per cui la determinazione della percentuale di legame alla HSA diventa molto più rapida. Si passa quindi da una analisi a medio rendimento a una analisi di screening ad alto rendimento (highthroughput- screening, HTS). Inoltre, la riduzione dei tempi di analisi, permette di evitare l’uso di soventi organici nella fase mobile. Dopo aver caratterizzato la colonna da 10 mm con lo stesso metodo precedentemente descritto per le altre colonne, sono stati iniettati una serie di standard variando il flusso della fase mobile, per valutare la possibilità di utilizzare flussi elevati. La colonna è stata quindi impiegata per stimare la percentuale di legame di una serie di molecole con differenti caratteristiche chimiche. Successivamente è stata valutata la possibilità di utilizzare una colonna così corta, anche per studi di competizione, ed è stata indagato il legame di una serie di composti al sito I. Infine è stata effettuata una valutazione della stabilità della colonna in seguito ad un uso estensivo. L’uso di supporti cromatografici funzionalizzati con albumine di diversa origine (ratto, cane, guinea pig, hamster, topo, coniglio), può essere proposto come applicazione futura di queste colonne HTS. Infatti, la possibilità di ottenere informazioni del legame dei farmaci in via di sviluppo alle diverse albumine, permetterebbe un migliore paragone tra i dati ottenuti tramite esperimenti in vitro e i dati ottenuti con esperimenti sull’animale, facilitando la successiva estrapolazione all’uomo, con la velocità di un metodo HTS. Inoltre, verrebbe ridotto anche il numero di animali utilizzati nelle sperimentazioni. Alcuni lavori presenti in letteratura dimostrano l’affidabilita di colonne funzionalizzate con albumine di diversa origine [11-13]: l’utilizzo di colonne più corte potrebbe aumentarne le applicazioni.

Analisi morfologica e molecolare di cellule da colture primarie umane esposte a resine biocompatibili

The cytotoxicity of dental composites has been attributed to the release of residual monomers from polymerized adhesive systems due to degradation processes or the incomplete polymerization of materials. 2-Hydroxyethyl methacrylate (HEMA) is one of the major components released from dental adhesives. Cytotoxic effects due to high concentrations of HEMA have already been investigated, but the influence of minor toxic concentrations for long-term exposition on specific proteins such as type I collagen and tenascin has not been studied in depth. The objective of this project was to study the effect of minor toxic concentrations of HEMA on human gingival fibroblasts (HGFs) and human pulp fibroblasts (HPFs), investigating modification in cell morphology, cell viability, and the influence on type I collagen and tenascin proteins. Different concentrations of the resin monomer and different times of exposition were tested on both cell lines. The cell vitality was determined by MTT assay, and high-resolution scanning electron microscopy analysis was performed to evaluate differences in cell morphology before and after treatment. To evaluate the variability in the expression and synthesis of procollagen α1 type I and tenascin proteins on HGFs and HPFs treated with HEMA at different concentrations immunofluorescence, RT-PCR and western blot analysis, were carried out. The treatments on HGFs with 3mmol/L HEMA, showed a strong reduction of procollagen α1 type I protein at 72h and 96h, demonstrating that HEMA interferes both with the synthesis of the procollagen α1 type I protein and its mRNA expression. The results obtained on HPFs treated with different concentrations of HEMA ranging from 0,5mmol/L to 3mmol/L and for different exposition times showed a strong reduction in cell viability in specimens treated for 96h and 168h, while immunofluorescence and western blotting analysis demonstrated a reduction of procollagen α1 type I and an overexpression of tenascin protein. In conclusion, our results showed that the concentrations of HEMA we tested, effect the normal cell production and activity, such as the synthesis of some dental extracellular matrix proteins.

Sviluppo e validazione di un modello di film fluido per simulazioni CFD di motori a combustione interna

A wall film model has been implemented in a customized version of KIVA code developed at University of Bologna. Under the hypothesis of `thin laminar ow' the model simulates the dynamics of a liquid wall film generated by impinging sprays. Particular care has been taken in numerical implementation of the model. The major phenomena taken into account in the present model are: wall film formation by impinging spray; body forces, such as gravity or acceleration of the wall; shear stress at the interface with the gas and no slip condition on the wall; momentum contribution and dynamic pressure generated by the tangential and normal component of the impinging drops; film evaporation by heat exchange with wall and surrounding gas. The model doesn't consider the effect of the wavy film motion and suppose that all the impinging droplets adhere to the film. The governing equations have been integrated in space by using a finite volume approach with a first order upwind differencing scheme and they have been integrated in time with a fully explicit method. The model is validated using two different test cases reproducing PFI gasoline and DI Diesel engine wall film conditions.

Web 2.0, contenuti aperti e produzione tra pari: analisi economica delle possibili sinergie.

Analisi in chiave economica e sociale dell'evoluzione di Internet, delle tecnologie legate al Web 2.0, dei fenomeni della pirateria, del software libero ed open source, del copyleft, dei contenuti aperti e della produzione tra pari. Introduzione dei concetti di economia del gratis ("freeconomics") e di coda lunga. Consigli manageriali pratici per i nuovi mercati digitali e per la competizione nella rete Internet.

Sistema per la gestione di basi di dati relazionali da XML

Nello sviluppo di sistemi informatici si sono affermate numerose tecnologie, che vanno utilizzate in modo combinato e, possibilmente sinergico. Da una parte, i sistemi di gestione di basi di dati relazionali consentono una gestione efficiente ed efficace di dati persistenti, condivisi e transazionali. Dall'altra, gli strumenti e i metodi orientati agli oggetti (linguaggi di programmazione, ma anche metodologie di analisi e progettazione) consentono uno sviluppo efficace della logica applicativa delle applicazioni. E’ utile in questo contesto spiegare che cosa s'intende per sistema informativo e sistema informatico. Sistema informativo: L'insieme di persone, risorse tecnologiche, procedure aziendali il cui compito è quello di produrre e conservare le informazioni che servono per operare nell'impresa e gestirla. Sistema informatico: L'insieme degli strumenti informatici utilizzati per il trattamento automatico delle informazioni, al fine di agevolare le funzioni del sistema informativo. Ovvero, il sistema informatico raccoglie, elabora, archivia, scambia informazione mediante l'uso delle tecnologie proprie dell'Informazione e della Comunicazione (ICT): calcolatori, periferiche, mezzi di comunicazione, programmi. Il sistema informatico è quindi un componente del sistema informativo. Le informazioni ottenute dall'elaborazione dei dati devono essere salvate da qualche parte, in modo tale da durare nel tempo dopo l'elaborazione. Per realizzare questo scopo viene in aiuto l'informatica. I dati sono materiale informativo grezzo, non (ancora) elaborato da chi lo riceve, e possono essere scoperti, ricercati, raccolti e prodotti. Sono la materia prima che abbiamo a disposizione o produciamo per costruire i nostri processi comunicativi. L'insieme dei dati è il tesoro di un'azienda e ne rappresenta la storia evolutiva. All'inizio di questa introduzione è stato accennato che nello sviluppo dei sistemi informatici si sono affermate diverse tecnologie e che, in particolare, l'uso di sistemi di gestione di basi di dati relazionali comporta una gestione efficace ed efficiente di dati persistenti. Per persistenza di dati in informatica si intende la caratteristica dei dati di sopravvivere all'esecuzione del programma che li ha creati. Se non fosse cosi, i dati verrebbero salvati solo in memoria RAM e sarebbero persi allo spegnimento del computer. Nella programmazione informatica, per persistenza si intende la possibilità di far sopravvivere strutture dati all'esecuzione di un programma singolo. Occorre il salvataggio in un dispositivo di memorizzazione non volatile, come per esempio su un file system o su un database. In questa tesi si è sviluppato un sistema che è in grado di gestire una base di dati gerarchica o relazionale consentendo l'importazione di dati descritti da una grammatica DTD. Nel capitolo 1 si vedranno più in dettaglio cosa di intende per Sistema Informativo, modello client-server e sicurezza dei dati. Nel capitolo 2 parleremo del linguaggio di programmazione Java, dei database e dei file XML. Nel capitolo 3 descriveremo un linguaggio di analisi e modellazione UML con esplicito riferimento al progetto sviluppato. Nel capitolo 4 descriveremo il progetto che è stato implementato e le tecnologie e tools utilizzati.

Analisi delle condizioni di flusso nell'intersezione Zanardi/Carracci/Beverara in Bologna e proposte progettuali

Studio della proposta progettuale n°1 del comune inerente l'intersezione complessa Zanardi/Carracci/Beverara