Comportamento da cepa LE de Schistosoma mansoni, após passagem em hospedeiro humano infectado acidentalmente

Uma auxiliar de laboratório infectou-se acidentalmente, com cercárias de Schistosoma mansoni, cepa LE, mantida rotineiramente em nossos laboratórios. Decorridos 5 meses, o exame parasitológico de fezes revelou 108 ovos/g . A pacientefoi tratada com oxamniquine, porém a infecção continuou ativa (6 ovos/g). Foi então obtido o isolado SSF mantido no modelo Biomphalaria glabrata - camundongo albino. Os resultados obtidos no estudo comparativo, entre o isolado SSF e a cepa LE, que lhe deu origem, mostraram que a duração do período pré-patente e o índice de infectividade em camundongos, bem como a resposta aos agentes esquistossomicidas (hycanthone, oxamniquine epraziquantel) não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. Por outro lado, o número de miracídios obtidos dos intestinos e fígados dos camundongos infectados foi o dobro com a cepa LE, quando comparados com aquele do isolado SSF. Também a variação do peso dos animais foi bastante diferente. Concluiu-se que apenas uma passagem pelo hospedeiro humano não mudou substancialmente as características da cepa estudada.

Etiologia das infeções respiratórias virais em criançass em idade pré-escolar

RESUMO: Os vírus respiratórios continuam a ocupar um papel relevante na morbilidade e mortalidade infantil, tendo na última década sido alargado o espectro de vírus potencialmente causadores das infeções respiratórias. O diagnóstico destas infeções pode ser efetuado por várias metodologias, sendo as técnicas de biologia molecular consideradas as mais sensíveis para este fim. No âmbito do Projeto Ambiente e Saúde em Creches e Infantários (ENVIRH) foi efetuada uma comparação da prevalência dos principais vírus respiratórios em crianças em idade pré-escolar, com critérios de infeção respiratória, recorrendo a técnicas de biologia molecular, em duas populações: crianças que se encontravam na escola/domicilio e crianças que recorreram a uma urgência hospitalar. O estudo decorreu em dois períodos, de Fevereiro a Maio de 2011 e de Outubro de 2011 a Abril de 2012. Foram efetuadas duas colheitas de zaragatoas, uma nasal e outra orofaríngea. A metodologia utilizada para a identificação viral nas amostras foi a PCR e RT-PCR multiplex em tempo real. Os vírus pesquisados foram: Influenza A e B, Parainfluenza 1-4, Metapneumovirus humano, Vírus Sincicial respiratório (VSR), Rinovírus, Enterovírus, Coronavírus e Bocavirus. Foram realizadas 100 colheitas em crianças com idades compreendidas entre os 5 meses e os 5 anos. Foram obtidas 64 amostras dos infantários/domicílios, das quais 47 foram positivas. Da urgência Hospitalar obtiveram-se 36 amostras, em que 32 foram positivas. O vírus da gripe A (H3) foi o mais frequentemente detetado nas duas populações, mas apenas durante o surto de 2012. O VSR e os adenovírus foram mais frequentes nas crianças que recorreram ao hospital, ao contrário dos enterovirus e dos coronavírus, que não foram detetados nesta população. Os bocavirus nunca foram detetados isoladamente. Este estudo reforça a importância de se utilizarem técnicas de biologia molecular para o diagnóstico etiológico das infeções respiratórias, devido à elevada sensibilidade das mesmas, o que se reflete na elevada percentagem de amostras positivas. O facto de se utilizarem técnicas “multiplex”, que permitem a pesquisa simultânea de vários vírus, facilita a deteção de um maior espectro destes agentes. A elevada prevalência de Influenza A H3N2 deveu-se ao facto de grande parte do estudo ter coincidido com um período de surto por este vírus. O sistema de alerta montado durante o projeto ENVIRH pareceu promissor para uma eventual utilização futura em períodos de atividade gripal.--------------ABSTRACT: In the last decade, as respiratory viruses keep representing a relevant factor in child morbidity and mortality, the spectrum of viruses that may potentially cause respiratory infections has been widened. Within the several methodologies that may be applied in the diagnosis of these types of infections, the ones that use molecular biology are considered to be the most sensitive. The Environment and Health in Daycares and Nurseries Project (ENVIRH) arranged for a study, by means of molecular biology techniques, on the main respiratory viruses' influence in pre-school aged children with respiratory infection symptoms. This study compared children in two different populations: children at school or at home and children that were taken to a hospital emergency service. The study was conducted in two different time periods, one from February to May 2011 and the other from October 2011 to April 2012. During this time, two swab collections were held, one nasal and one oropharyngeal. PCR and RT-PCR multiplex in real time techniques were used for viral identification of the samples, searching for the viruses Influenza A and B, Parainfluenza 1-4, human Metapneumovirus, Respiratory Sincytial Virus (RSV), Rhinovirus, Enterovirus, Coronavirus and Bocavirus. One hundred (100) collections were held in children between the ages of 5 months and 5 years, sixty-four (64) at home/school and thirty-six (36) at the hospital's emergency service. From a total of seventy-nine (79) positive samples, forty-seven (47) were obtained at home/school and thirty-two (32) at the hospital. The virus detected the most in both populations was the Influenza A (H3), but only during the outbreak of 2012. Unlike the enteroviruses and coronaviruses, that were not detected within this population, the RSV and the adenoviruses were most common within the children at the hospital. Bocaviruses were never detected isolated from other viruses. The high percentage of positive samples reinforces the significance of using molecular biology techniques for the etiological diagnosis of respiratory infections. The use of multiplex techniques, that make the simultaneous search for multiple viruses possible, enhances the detection of a larger spectrum of such agents. Most of the study coincided with an outbreak of the Influenza A H3N2 virus, thus explaining the high number of its cases identified. The alert system set up during the ENVIRH project looked promising enough for eventual periods of flu activity in the future.

Prevalência da infecção pelo vírus B na comunidade hospitalar

Estudou-se a prevalência de marcadores para a hepatite B (HBsAg, AntiHBc e AntiHBs) em profissionais de saúde, a fim de identificar grupos de maior risco onde estaria indicada a vacinação pré-exposição. Comparando-os com os funcionários administrativos do mesmo hospital, observamos índices significativamente superiores em grupos como cirurgiões (40,0%) e profissionais de hemodiálise (36,4%), que apresentaram taxas deferimentos no trabalho, de, respectivamente, 93,3% e 77,3%. Outros grupos mostraram grande aumento da prevalência em função do maior tempo de atuação profissional, comprovando seu risco. Outras formas de transmissão, como transfusão e contato íntimo com portadores de hapatite, não tiveram significância. Os autores concluíram que a vacinação está indicada em cirurgiões e profissionais de hemodiálise, bem como dentistas e técnicos de laboratório.

Diversidade genética e resistência aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos de vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) de uma população de toxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa

Neste estudo procedeu-se à caracterização da diversidade genética das regiões codificantes da protease (PR), transcritase reversa (RT) e integrase (IN) do gene pol do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), bem como à pesquisa de polimorfismos genéticos associados à diminuição da susceptibilidade aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos, circulante numa população de 51 indivíduos utilizadores de drogas por via endovenosa (IDUs) da Grande Lisboa. Em termos globais, a análise filogenética realizada com base em 38 sequências nucleotídicas concatenadas revelou que 12 (31,6%), 13 (34,2%) e 13 (34,2%) das sequências analisadas eram dos subtipos B, G/CRF14_BG e de formas genéticas não-B/não-G (1 F1, 4 CRF02_AG e 8 formas recombinantes únicas), respectivamente. Relativamente à pesquisa de mutações associadas a resistência (perfil genotípico), foram encontradas 15, presentes em 50,0% (22/44) dos indivíduos, com uma distribuição de 1-3/indivíduo (4, todas acessórias, na PR; 6 na RT; 5 na IN, uma principal e 4 acessórias). Todavia, apenas 26,7% (4/15) dessas mutações conferiam uma expressão fenotípica de resistência a uma das classes de inibidores (da RT ou IN), em 9,1% (4/44) dos indivíduos. Foi ainda observada uma elevada frequência de outros polimorfismos genéticos, mais frequentes em subtipos não-B, alguns dos quais considerados assinaturas de subtipo. A homologia genética total ou parcial com os subtipos B e G, reconhecida neste estudo, reflectirá a sua predominância na população de IDUs. Este resultado sugere também que a epidemia de HIV-1 em Portugal poderá estar a evoluir para um padrão epidemiológico singular, no qual os subtipos B, G e suas formas recombinantes predominam. A proporção observada de indivíduos portadores de vírus com mutações associadas a resistência, mesmo em indivíduos naive relativamente à terapêutica, indica que a sua transmissão se encontra em curso entre a população de IDUs, tendo, certamente, um impacto relevante ao nível da abordagem terapêutica e monitorização da infecção.

Desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHA-MULTIPLE REGION HYBRIDIZATION ASSAY) para identificação presumível de vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) dos subtipos B, G e de formas recombinantes CRF14_BG e CRF02_AG circulantes em Portugal

A maioria dos métodos utilizados na caracterização genética do HIV-1 baseia-se na análise de regiões específicas do genoma viral, fornecendo informação parcial sobre o mesmo e, por consequência, revelando-se inadequados para a identificação de vírus recombinantes. O único método que permite uma caracterização integral do genoma viral passa pela sua sequenciação completa. No entanto, este é um método dispendioso, laborioso e de difícil implementação quando se pretende a análise de elevados números de amostras. Como alternativa a este último, o conjunto de métodos genericamente designados de MHA (Multiple Region Hybridization Assay) baseiam-se na amplificação, por PCR em tempo-real, de várias regiões ao longo do genoma viral e na sua caracterização com sondas específicas (TaqMan). Tendo este modelo por base, o objectivo deste estudo foi o desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHABG0214) passível de ser aplicado ao estudo de um elevado número de amostras. Este método foi desenvolvido tendo como objectivo a genotipagem as estirpes circulantes dominantes na epidemia Portuguesa, nomeadamente os subtipos B, G e formas genéticas recombinantes CRF02_AG e CRF14_BG. Com base em alinhamentos de sequências de referência de genoma completo, delinearam-se primers universais e subtipo-específicos para a amplificação de diversas regiões codificantes distribuídas ao longo do genoma do HIV-1 (Gag, Protease, Transcriptase Reversa, Integrase, Rev, Gp120 e Gp41). A optimização foi efectuada, inicialmente, para um conjunto de amostras de referência e seguidamente avaliada num conjunto de 50 amostras clínicas. O MHABG0214 foi implementado numa estratégia de PCR em tempo-real, numa detecção dependente de SYBR® Green I para todas as regiões ou, como alternativa, usando sondas TaqMan (Gp41). Apresentamos ainda uma estratégia em que a análise de resultados se baseia, simplesmente, numa abordagem usando PCR/gel de agarose convencional. Estas abordagens constituem ferramentas úteis na identificação das estirpes de HIV-1 em Portugal.

Aspectos epidemiológicos das infecções por rota vírus no Distrito Federal, Brasil

Rotavírus foram pesquisados em 607amostrasfecais de crianças de até 6 anos de idade com quadros de diarréia aguda, no período de maio de 1986 a abril de 1990. Foi utilizada a técnica de eletroforese em gel depoliacrilamida (PAGE), sendo os rotavírus detectados em 123 amostras (20,27%) das quais 107(87,00%) apresentaram perfil eletroforético longo, compatível com o subgrupo II. Os rotavírus não foram encontrados no grupo controle constituído de crianças sadias, sendo porém detectados em 7,80% das crianças internadas por outras causas que não diarréia aguda. A maioria das crianças positivas para rotavírus encontrava-se na faixa etária de 6a24 meses (73,98%). A média depositividade nos meses chuvosos (outubro a abril) foi igual a 9,60% e no período seco, 34,48% com picos que variaram entre 53,17 e 73,27% nos meses de junho e julho, os mais frios do ano.

Ocorrência de rota vírus e adeno vírus em crianças de até 11 anos de idade sem sintomatologia de diarréia em Goiânia - GO

Trezentas e oitenta e cinco amostras fecais provenientes de crianças na faixa etária de até 11 anos, sem sintomatologia de diarréia, foram estudadas objetivando-se a detecção de rotavirus. Desta amostragem, 268foram obtidas de crianças habitantes de creches e 117 de crianças atendidas no ambulatório do Hospital Lúcio Rebelo de Goiânia-Goiás. Todas as amostrasforam analisadas através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA- SDS), e 89 foram também analisadas pelo ensaio imunoenzimático adaptado para rotavirus e adenovirus (E1ARA). Rotavirus e adenovirus só foram detectados nas crianças atendidas no ambulatório, num percentual de 1,7% e 1,6% respectivamente, não havendo nenhuma positividade nas crianças de creches. Ambos os vírus ocorrerarh na faixa etária de 1 a 2 anos.

Sistema nervoso autônomo intracardíaco em caso humano fatal de doença de Chagas aguda

Procedeu-se à análise do sistema nervoso autônomo intracardíaco (SNAIC) em 150 cortes histológicos obtidos a partir de fragmentos atriais de homem de 74 anos, falecido de insuficiência cardíaca consecutiva à doença de Chagas aguda (DCA), provavelmente adquirida por via digestiva. Em 10 lâminas havia discretos infiltrados de mononucleares em torno de gânglios e/ou filetes nervosos sem alterações morfológicas significativas dos neurônios; em um preparado constatou-se ganglionite e periganglionite, de moderada intensidade, associadas a alterações neuronais. Epicardite focal, em geral discreta, foi observada em todas as lâminas. Os achados sugerem que a inflamação dos gânglios e fibras do SNAIC na DCA ocorre, pelo menos em parte, da propagação da epicardite adjacente e, que mesmo nos casos fatais da Tripanosomose cruzi as lesões morfológicas do SNAIC podem ser discretas.

O vírus da hepatite B na doença hepática alcoólica: avaliação clínica e bioquímica

Foram estudados prospectiva e seqüencialmente 107 pacientes com doença hepática alcoólica (DHA) crônica, sendo 83 casos de cirrose e 24de hepatite alcoólica. Além do etilismo, ingestão mínima de 70 gramas de etanol puro ao dia por período superior a sete anos, todos apresentaram disfunção hepatocelular. De acordo com o perfil sorológico para o VHB os pacientes foram alocados em quatro grupos a saber: grupo I infectados: AgHBs e anti-HBc positivos; grupo II imunes: anti-HBs e anti-HBc positivos; grupo III sem marcadores do VHB: AgHBs, anti-HBc e anti-HBs negativos; grupo IV anti-HBc positivo isoladamente. A prevalência de infecção pelo VHB na DHA foi alta: 42,06% apesar dos índices pouco elevados de imunidade: 26,17% sugerindo que na DHA ocorre maior exposição ao VHB com resposta imunológica deficiente. A análise dos parâmetros clínico-bioquímicos, quando considerados isoladamente, não mostrou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos I, II, e III, entretanto a classificação de Child/Campbell, discriminou o grupo infectado, onde houve predomínio da classe C, de pior prognóstico.

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.