Rôle des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte contre Streptococcus suis

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis.

Influence de la mécanoréception faciale sur les comportements moteurs chez l’opossum nouveau-né, Monodelphis domestica

L’opossum nait dans un état très immature, mais rampe avec ses membres antérieurs (MA) de l’orifice urogénital de la mère à une tétine, où il s’attache pour poursuivre son développement. Des informations sensorielles sont nécessaires pour guider le nouveau-né vers une tétine et déclencher son attachement. Des expériences précédentes ont montré que le système du trijumeau, dont dépend l’innervation somesthésique du museau, influence les mouvements précoces des MA. Le présent projet vise à déterminer si les mécanorécepteurs faciaux sont fonctionnels et exercent une influence sur les MA. On s’intéresse particulièrement aux cellules de Merkel, un mécanorécepteur épidermique innervé par des fibres à adaptation lente de type I (SA I). Ces cellules ont été localisées sur le pourtour du museau de l’opossum nouveau-né en utilisant un traceur cellulaire, l’AM1-43. Nous avons analysé les réponses musculaires des MA consécutives à l’application de forces calibrées au museau sur des préparations in vitro. Ces réponses sont bilatérales et simultanées, très variables, et leur intensité augmente avec la force de la stimulation. Lors de stimulations répétitives pendant 60 min, les réponses diminuent avec le temps. Le retrait de la peau faciale abolit presque ces réponses. De plus, l’application d’un antagoniste des récepteurs métabotropiques du glutamate, qui affecte l’activité des fibres SA I, ou d’un antagoniste des récepteurs purinergiques les diminue fortement, suggérant une participation des cellules de Merkel. Ces résultats soutiennent que le sens du toucher facial relayé par le système du trijumeau est fonctionnel chez l’opossum nouveau-né et qu’il pourrait influencer les mouvements des MA.

Neurotensinergic modulation of glutamatergic neurotransmission in VTA neurons.

L’aire tegmentaire ventrale (VTA) contient une forte densité de terminaisons neurotensinergiques ainsi que des récepteurs à la surface des neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques. Le VTA a été impliqué dans des maladies comme la schizophrénie, les psychoses et l’abus de substance. Les drogues d’abus sont connues pour induire le phénomène de sensibilisation - un processus de facilitation par lequel l’exposition à un stimulus produit une réponse augmentée lors de l’exposition subséquente au même stimulus. La sensibilisation se développe dans le VTA et implique mécanismes dopaminergiques et glutamatergiques. Il a été montré que les antagonistes neurotensinergiques bloquaient le développement de la sensibilisation et certains mécanismes de récompense et ces effets pourraient être médiés indirectement par une modulation de la neurotransmission glutamatergique. Cependant, on connaît peu les mécanismes de modulation de la transmission glutamatergique par la neurotensine (NT) dans le VTA. Le but de la présente thèse était d’étudier la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique du patch clamp dans la cellule entière dans des tranches horizontales du VTA pour étudier les effets de différents agonistes et antagonistes neurotensinergiques. Les neurones ont été identifié comme Ih+ (présumés dopaminergiques) ou Ih- (présumés non-dopaminergiques) selon qu’ils exprimaient ou non un courant cationique activé par l’hyperpolarisation (Ih). Des techniques d’immunocytochimie ont été utilisées pour marquer les neurones et vérifier leur localisation dans le VTA. Dans une première étude nous avons trouvé que la neurotensine indigène (NT1-13) ou son fragment C-terminal, NT8-13, induisait une augmentation comparable des courants postsynaptiques excitateurs glutamatergiques (CPSEs) dans les neurones Ih+ ou Ih- du VTA. L'augmentation induite dans les neurones Ih+ par la NT8-13 a été bloquée par le SR48692, un antagoniste des récepteurs NTS1, et par le SR142948A, un antagoniste des récepteurs NTS1 et NTS2, suggérant que l'augmentation était médiée par l’activation des récepteurs NTS1. Dans les neurones Ih- l'augmentation n’a été bloquée que par le SR142948A indiquant une implication des récepteurs NTS2. Dans une deuxième étude, nous avons testé les effets de la D-Tyr[11]NT (un analogue neurotensinergique ayant différentes affinités de liaison pour les sous-types de récepteurs neurotensinergiques) sur les CPSEs glutamatergiques dans les neurones Ih+ et Ih- en parallèle avec une série d’expériences comportementales utilisant un paradigme de préférence de place conditionnée (PPC) menée dans le laboratoire de Pierre-Paul Rompré. Nous avons constaté que la D-Tyr[11]NT induisaient une inhibition dépendante de la dose dans les neurones Ih+ médiée par l'activation de récepteurs NTS2. En revanche, la D-Tyr[11]NT a produit une augmentation des CPSEs glutamatergiques médiée par des récepteurs NTS1 dans les neurones Ih-. Les résultats des expériences comportementales ont montré que des microinjections bilatérales de D-Tyr[11]NT dans le VTA induisait une PPC bloquée uniquement par la co-injection de SR142948A et SR48692, indiquant un rôle pour les deux types de récepteurs, NTS1 et NTS2. Cette étude nous a permis de conclure que i) la D-Tyr[11]NT agit dans le VTA via des récepteurs NTS1 et NTS2 pour induire un effet de récompense et ii) que cet effet est dû, au moins en partie, à une augmentation de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones non-dopaminergiques (Ih-). Dans une troisième étude nous nous sommes intéressés aux effets de la D-Tyr[11]NT sur les réponses isolées médiées par les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et acide α-amino-3- hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) dans les neurones du VTA. Nous avons constaté que dans les neurones Ih+ l’amplitude des CPSEs NMDA et AMPA étaient atténuées de la même manière par la D-Tyr[11] NT. Cette modulation des réponses était médiée par les récepteurs NTS1 et NTS2. Au contraire, dans les neurones Ih-, l’amplitude des réponses NMDA et AMPA étaient augmentées en présence de D-Tyr[11]NT et ces effets dépendaient de l’activation des récepteurs NTS1 localisés sur les terminaisons glutamatergiques. Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire que le NT exerce une modulation bidirectionnelle sur la neurotransmission glutamatergique dans les neurones du VTA et met en évidence un nouveau type de modulation peptidergique des neurones non-dopaminergiques qui pourrait être impliqué dans la sensibilisation. En conclusion, la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA se fait en sens opposé soit, respectivement, par une inhibition ou par une excitation. De plus, ces effets sont médiés par différents types de récepteurs neurotensinergiques. En outre, nos études mettent en évidence une modulation peptidergique de la neurotransmission glutamatergique dans le VTA qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de lutte contre la toxicomanie.

Rôle de la PKC delta dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine via le récepteur GPIb alpha

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques.

Role of Reactive Gliosis and Neuroinflammation in Experimental Glaucoma

Le glaucome est la principale cause de cécité irréversible dans le monde. Chez les patients atteints de cette pathologie, la perte de la vue résulte de la mort sélective des cellules ganglionnaires (CGR) de la rétine ainsi que de la dégénérescence axonale. La pression intraoculaire élevée est considérée le facteur de risque majeur pour le développement de cette maladie. Les thérapies actuelles emploient des traitements pharmacologiques et/ou chirurgicaux pour diminuer la pression oculaire. Néanmoins, la perte du champ visuel continue à progresser, impliquant des mécanismes indépendants de la pression intraoculaire dans la progression de la maladie. Il a été récemment démontré que des facteurs neuroinflammatoires pourraient être impliqués dans le développement du glaucome. Cette réponse est caractérisée par une régulation positive des cytokines pro-inflammatoires, en particulier du facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). Cependant, le mécanisme par lequel le processus neuroinflammatoire agit sur la mort neuronale reste à clarifier. L’hypothèse principale de ce doctorat propose que les facteurs pro-inflammatoires comme le TNFα et la phosphodiestérase 4 (PDE4) interagissent avec les mécanismes moléculaires de la mort neuronale, favorisant ainsi la survie et la protection des CGRs au cours du glaucome. Dans la première partie de ma thèse, J’ai utilisé un modèle in vivo de glaucome chez des rats Brown Norway pour montrer que l’expression du TNFα est augmentée après l'induction de l'hypertension oculaire. L'hypothèse spécifique de cette étude suggère que les niveaux élevés de TNFα provoquent la mort des CGRs en favorisant l'insertion de récepteurs AMPA perméables au calcium (CP-AMPAR) à la membrane cytoplasmique. Pour tester cette hypothèse, j’ai utilisé un inhibiteur sélectif de la forme soluble du TNFα, le XPro1595. L'administration de cet agent pharmacologique a induit une protection significative des somas et des axones des neurones rétiniens. L'évaluation de la perméabilité au cobalt a montré que le TNFα soluble est impliqué dans l'insertion de CP-AMPAR à la membrane des CGRs lors du glaucome. L’exposition des neurones à une pression oculaire élevée est à l’origine de la hausse de la densité membranaire des CP-AMPARs, grâce à une diminution de l’expression de la sous-unité GluA2. La présence de GluA2 au sein du récepteur ne permet pas l’entrée du calcium à l’intérieur de la cellule. L'administration intraoculaire d’antagonistes spécifiques des CP-AMPARs promeut la protection des somas et des axones des CGRs. Ces résultats montrent que les CP-AMPARs jouent un rôle important dans la pathologie du glaucome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé l'effet neuroprotecteur d’un inhibiteur de la PDE4, l’ibudilast, dans notre modèle de glaucome. L'hypothèse spécifique s’oriente vers une atténuation de la réponse neuroinflammatoire et de la gliose par l’administration d’ibudilast, favorisant ainsi la protection neuronale. Les résultats montrent que dans les rétines glaucomateuses, l’ibudilast diminue la gliose et l'expression de plusieurs facteurs tels que le TNFα, l'interleukine-1β (IL-1β), l’interleukine-6 (IL-6) et le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF). Chez les rats glaucomateux, nous avons observé une expression notable de PDE4A dans les cellules de Müller, qui est en corrélation avec l'accumulation de l’AMP cyclique (AMPc) dans ces cellules après un traitement d’ibudilast. Finalement, nous avons démontré que la protection des CGRs via l’administration d’ibudilast est un mécanisme dépendent de l’AMPc et de la protéine kinase A (PKA). En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse identifient deux mécanismes différents impliqués dans la perte des CGRs au cours du glaucome. Ces mécanismes pourraient fournir des perspectives potentielles pour le développement de nouvelles stratégies de traitement du glaucome.

Le rôle de la neurotensine dans l’expression de la sensibilisation dopaminergique induite par un traitement continu aux antipsychotiques

Les médicaments antipsychotiques améliorent les symptômes de la schizophrénie, mais peuvent perdre leur efficacité à long terme en sensibilisant le système dopaminergique. Les mécanismes sous-tendant cette sensibilisation ne sont pas connus. Le neuropeptide neurotensine module le système dopaminergique et est régulé par les antipsychotiques dans le noyau accumbens. Dans cette région, la neurotensine peut avoir des effets anti- et pro-dopaminergiques via les récepteurs NTS1. Nous avions pour hypothèse que la neurotensine du noyau accumbens module l’expression de la sensibilisation dopaminergique induite par les antipsychotiques. Ainsi, nous avons traité par intermittence ou continuellement des rats à l’antipsychotique halopéridol. Seule l’administration continue sensibilise le système dopaminergique et donc sensibilise aux effets locomoteurs de l’amphétamine. Des microinjections de neurotensine dans le noyau accumbens ont diminué l’hyperlocomotion induite par l’amphétamine chez les rats témoins et ceux traités par intermittence aux antipsychotiques. Au contraire, la sensibilisation dopaminergique induite par un traitement continu serait liée à une augmentation des effets pro-dopaminergiques de la neurotensine. Ceci est indépendant d’un changement de densité des récepteurs NTS1 dans le noyau accumbens. Un traitement intermittent n’a pas d’effet sur cette mesure également. De plus, autant un traitement antipsychotique continu qu’intermittent augmentent la transcription de proneurotensine. Donc, seule l’altération de la fonction de la neurotensine du noyau accumbens corrèle avec la sensibilisation dopaminergique. En parallèle, dans le caudé-putamen, un traitement continu augmente la transcription de proneurotensine et un traitement intermittent augmente la densité des récepteurs NTS1. En somme, la neurotensine du noyau accumbens module la sensibilisation dopaminergique induite par les antipsychotiques.

Mécanismes moléculaires de l’hypertrophie vasculaire dans le modèle animal d’hypertension essentielle (SHR)

La voie de signalisation des phosphoinositides joue un rôle clé dans la régulation du tonus vasculaire. Plusieurs études rapportent une production endogène de l’angiotensin II (Ang II) et de l’endothéline-1 (ET-1) par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) de rats spontanément hypertendus (spontaneously hypertensive rats : SHR). De plus, l’Ang II exogène induit son effet prohypertrophique sur les CMLVs selon un mécanisme dépendant de la protéine Gqα et de la PKCẟ. Cependant, le rôle de l’axe Gqα/PLCβ/PKCẟ dans l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal de l’hypertension artérielle n’est pas encore étudié. L’objectif principal de cette thèse est d’examiner le rôle de l’axe Gqα/PLCβ1 dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal d’hypertension artérielle essentielle (spontaneously hypertensive rats : SHR). Nos premiers résultats indiquent que contrairement aux CMLVs de SHR âgés de 12 semaines (absence d’hypertrophie cardiaque), les CMLVs de SHR âgés de 16 semaines (présence d’hypertrophie cardiaque) présentent une surexpression protéique endogène de Gqα et de PLCβ1 par rapport aux CMLVs de rats WKY appariés pour l’âge. L’inhibition du taux d’expression protéique de Gqα et de PLCβ1 par des siRNAs spécifiques diminue significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. De plus, la surexpression endogène des Gqα et PLCβ1, l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR de 16 semaines ont été atténués significativement par des antagonistes des récepteurs AT1 (losartan) et ETA (BQ123), mais pas par l’antagoniste du récepteur ETB (BQ788). L’inhibition pharmacologique des MAPKs par PD98059 diminue significativement la surexpression endogène de Gqα/PLCβ1 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. D’un côté, l’inhibition du stress oxydatif (par DPI, inhibiteur de la NAD(P)H oxidase, et NAC , molécule anti-oxydante), de la molécule c-Src (PP2) et des récepteurs de facteurs de croissance (AG1024 (inhibiteur de l’IGF1-R), AG1478 (inhibiteur de l’EGFR) et AG1295 (inhibiteur du PDGFR)) a permis d’atténuer significativement la surexpression endogène élevée de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. D’un autre côté, DPI, NAC et PP2 atténuent significativement l’hyperphosphorylation de la molécule c-Src, des RTKs (récepteurs à activité tyrosine kinase) et de la molécule ERK1/2. Dans une autre étude, nous avons aussi démontré que la PKCẟ montre une hyperphosphorylation en Tyr311 dans les CMLVs de SHR comparées aux CMLVs de WKY. La rottlerin, utilisée comme inhibiteur spécifique de la PKCẟ, inhibe significativement cette hyperphosphorylation en Tyr311 dépendamment de la concentration. L’inhibition de l’activité de la PKCẟ par la rottlerin a été aussi associée à une atténuation significative de la surexpression protéique endogène de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. De plus, l’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, en amont du stress oxydatif, a permis d’inhiber significativement l’activité de la NADPH, le taux de production élevée de l’ion superoxyde ainsi que l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2, de la molécule c-Src et des RTKs. À notre surprise, nous avons aussi remarqué une surexpression protéique de l’EGFR et de l’IGF-1R dans les CMLVs de SHR à l’âge de 16 semaines. L’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, de la molécule c-Src et du stress oxydatif a permis d’inhiber significativement la surexpression protéique endogène de ces RTKs. De plus, l’inhibition de l’expression protéique de l’EGFR et de la molécule c-Src par des siRNA spécifiques atténue significativement le taux d’expression protéique élevé de Gqα et de PLCβ1 ainsi que le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. Des siRNAs spécifiques à la PKCẟ ont permis d’atténuer significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR et confirment le rôle important de la PKCẟ dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs selon une voie dépendante du stress oxydatif. En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle important de l’activation endogène de l’axe Gqα-PLCβ-PKCẟ dans le processus d’hypertrophie vasculaire selon un mécanisme impliquant une activation endogène des récepteurs AT1/ETa, de la molécule c-Src, du stress oxidatif, des RTKs et des MAPKs.

Modulation allostérique du récepteur FP dans le cancer colorectal

Les prostaglandines modulent d’importants rôles physiologiques. Elles sont aussi impliquées dans le développement d’une variété de conditions pathologiques telles l’inflammation, la douleur et le cancer. La prostaglandine PGF2α et son récepteur (récepteur FP) se trouvent impliqué dans la modulation de nombreuses pathologies tels lors de l’accouchement préterme et le cancer colorectal. Récemment, nous avons fait partie d’un groupe de recherche ayant développé des modulateurs allostériques du récepteur FP. Dans une première étude, l’action du PGF2α sur le déclenchement des contractions myométriales a été évaluée, car peu d’information est connue sur la signalisation de cette prostaglandine lors de l’accouchement. Ainsi, nous avons utilisé un peptidomimétique de la deuxième boucle extracellulaire, dénommée PDC113.824. Nos résultats ont démontré que le PDC113.824 permettait de retarder la mise bas chez des souris gestantes, mais agissait de manière différente sur les multiples voies de signalisation de la PGF2α. Ainsi, le PDC113.824 inhibait la voie RhoA-ROCK, dépendante de l’activation de la protéine Gα12 par le. Les protéines RhoA-ROCK sont des acteurs clés dans le remodelage du cytosquelette d’actine et des contractions myométriales lors de l’accouchement. De plus, le PDC113.824 en présence de PGF2α agit comme un modulateur positif sur la voie dépendante de l’activation de la protéine Gαq. Le PDC113.824 serait donc un modulateur allostérique non compétitif possédant des actions à la fois de modulateurs positifs et négatifs sur la signalisation du récepteur FP Dans une seconde étude, des analogues du PDC113.824 ont été conçus et analysés dans un second modèle pathologique, le cancer colorectal. Ce cancer possède de hauts niveaux de récepteur FP. Nous avons donc étudié le rôle du récepteur FP dans le développement et la progression du cancer colorectal et l’effet de modulateurs allostériques. Il est généralement accepté que dans le cancer colorectal, la prostaglandine PGE2 permet la croissance et l’invasion tumorale, ainsi que l’angiogenèse. Toutefois, peu d’informations sont connues sur le rôle du PGF2α dans le cancer colorectal. C’est dans ce contexte que nous avons décidé d’examiner la contribution de ce récepteur dans la progression du cancer colorectal et cherché à déterminer si la modulation des fonctions du récepteur FP a un impact sur la croissance de tumeurs colorectales. Nos recherches ont révélé que l’activation du récepteur FP permet la migration et la prolifération de plusieurs lignées cellulaires humaines et murines d’adénocarcinomes colorectaux. Dans ce contexte, nos expériences ont démontré que la migration des cellules cancéreuses était dépendante de l’activation de la voie Rho. Nos résultats démontrent qu’en effet, l’activation de RhoA, une petite GTPase clé de la voie Gα12, est inhibée de façon sélective par nos composés. De plus, nos molécules allostériques sont également efficaces pour inhiber la voie de signalisation de la ß-caténine, une protéine impliquée dans la genèse du cancer colorectal. In vivo, le traitement de souris avec un des ces modulateurs a permis une inhibition effective de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent donc que les modulateurs allostériques des récepteurs FP pourraient constituer une nouvelle classe de médicaments utilisés pour le traitement du cancer colorectal.

Mécanismes moléculaires de l’hypertrophie vasculaire dans le modèle animal d’hypertension essentielle (SHR)

La voie de signalisation des phosphoinositides joue un rôle clé dans la régulation du tonus vasculaire. Plusieurs études rapportent une production endogène de l’angiotensin II (Ang II) et de l’endothéline-1 (ET-1) par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) de rats spontanément hypertendus (spontaneously hypertensive rats : SHR). De plus, l’Ang II exogène induit son effet prohypertrophique sur les CMLVs selon un mécanisme dépendant de la protéine Gqα et de la PKCẟ. Cependant, le rôle de l’axe Gqα/PLCβ/PKCẟ dans l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal de l’hypertension artérielle n’est pas encore étudié. L’objectif principal de cette thèse est d’examiner le rôle de l’axe Gqα/PLCβ1 dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal d’hypertension artérielle essentielle (spontaneously hypertensive rats : SHR). Nos premiers résultats indiquent que contrairement aux CMLVs de SHR âgés de 12 semaines (absence d’hypertrophie cardiaque), les CMLVs de SHR âgés de 16 semaines (présence d’hypertrophie cardiaque) présentent une surexpression protéique endogène de Gqα et de PLCβ1 par rapport aux CMLVs de rats WKY appariés pour l’âge. L’inhibition du taux d’expression protéique de Gqα et de PLCβ1 par des siRNAs spécifiques diminue significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. De plus, la surexpression endogène des Gqα et PLCβ1, l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR de 16 semaines ont été atténués significativement par des antagonistes des récepteurs AT1 (losartan) et ETA (BQ123), mais pas par l’antagoniste du récepteur ETB (BQ788). L’inhibition pharmacologique des MAPKs par PD98059 diminue significativement la surexpression endogène de Gqα/PLCβ1 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. D’un côté, l’inhibition du stress oxydatif (par DPI, inhibiteur de la NAD(P)H oxidase, et NAC , molécule anti-oxydante), de la molécule c-Src (PP2) et des récepteurs de facteurs de croissance (AG1024 (inhibiteur de l’IGF1-R), AG1478 (inhibiteur de l’EGFR) et AG1295 (inhibiteur du PDGFR)) a permis d’atténuer significativement la surexpression endogène élevée de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. D’un autre côté, DPI, NAC et PP2 atténuent significativement l’hyperphosphorylation de la molécule c-Src, des RTKs (récepteurs à activité tyrosine kinase) et de la molécule ERK1/2. Dans une autre étude, nous avons aussi démontré que la PKCẟ montre une hyperphosphorylation en Tyr311 dans les CMLVs de SHR comparées aux CMLVs de WKY. La rottlerin, utilisée comme inhibiteur spécifique de la PKCẟ, inhibe significativement cette hyperphosphorylation en Tyr311 dépendamment de la concentration. L’inhibition de l’activité de la PKCẟ par la rottlerin a été aussi associée à une atténuation significative de la surexpression protéique endogène de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. De plus, l’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, en amont du stress oxydatif, a permis d’inhiber significativement l’activité de la NADPH, le taux de production élevée de l’ion superoxyde ainsi que l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2, de la molécule c-Src et des RTKs. À notre surprise, nous avons aussi remarqué une surexpression protéique de l’EGFR et de l’IGF-1R dans les CMLVs de SHR à l’âge de 16 semaines. L’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, de la molécule c-Src et du stress oxydatif a permis d’inhiber significativement la surexpression protéique endogène de ces RTKs. De plus, l’inhibition de l’expression protéique de l’EGFR et de la molécule c-Src par des siRNA spécifiques atténue significativement le taux d’expression protéique élevé de Gqα et de PLCβ1 ainsi que le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. Des siRNAs spécifiques à la PKCẟ ont permis d’atténuer significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR et confirment le rôle important de la PKCẟ dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs selon une voie dépendante du stress oxydatif. En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle important de l’activation endogène de l’axe Gqα-PLCβ-PKCẟ dans le processus d’hypertrophie vasculaire selon un mécanisme impliquant une activation endogène des récepteurs AT1/ETa, de la molécule c-Src, du stress oxidatif, des RTKs et des MAPKs.

Modulation allostérique du récepteur FP dans le cancer colorectal

Les prostaglandines modulent d’importants rôles physiologiques. Elles sont aussi impliquées dans le développement d’une variété de conditions pathologiques telles l’inflammation, la douleur et le cancer. La prostaglandine PGF2α et son récepteur (récepteur FP) se trouvent impliqué dans la modulation de nombreuses pathologies tels lors de l’accouchement préterme et le cancer colorectal. Récemment, nous avons fait partie d’un groupe de recherche ayant développé des modulateurs allostériques du récepteur FP. Dans une première étude, l’action du PGF2α sur le déclenchement des contractions myométriales a été évaluée, car peu d’information est connue sur la signalisation de cette prostaglandine lors de l’accouchement. Ainsi, nous avons utilisé un peptidomimétique de la deuxième boucle extracellulaire, dénommée PDC113.824. Nos résultats ont démontré que le PDC113.824 permettait de retarder la mise bas chez des souris gestantes, mais agissait de manière différente sur les multiples voies de signalisation de la PGF2α. Ainsi, le PDC113.824 inhibait la voie RhoA-ROCK, dépendante de l’activation de la protéine Gα12 par le. Les protéines RhoA-ROCK sont des acteurs clés dans le remodelage du cytosquelette d’actine et des contractions myométriales lors de l’accouchement. De plus, le PDC113.824 en présence de PGF2α agit comme un modulateur positif sur la voie dépendante de l’activation de la protéine Gαq. Le PDC113.824 serait donc un modulateur allostérique non compétitif possédant des actions à la fois de modulateurs positifs et négatifs sur la signalisation du récepteur FP Dans une seconde étude, des analogues du PDC113.824 ont été conçus et analysés dans un second modèle pathologique, le cancer colorectal. Ce cancer possède de hauts niveaux de récepteur FP. Nous avons donc étudié le rôle du récepteur FP dans le développement et la progression du cancer colorectal et l’effet de modulateurs allostériques. Il est généralement accepté que dans le cancer colorectal, la prostaglandine PGE2 permet la croissance et l’invasion tumorale, ainsi que l’angiogenèse. Toutefois, peu d’informations sont connues sur le rôle du PGF2α dans le cancer colorectal. C’est dans ce contexte que nous avons décidé d’examiner la contribution de ce récepteur dans la progression du cancer colorectal et cherché à déterminer si la modulation des fonctions du récepteur FP a un impact sur la croissance de tumeurs colorectales. Nos recherches ont révélé que l’activation du récepteur FP permet la migration et la prolifération de plusieurs lignées cellulaires humaines et murines d’adénocarcinomes colorectaux. Dans ce contexte, nos expériences ont démontré que la migration des cellules cancéreuses était dépendante de l’activation de la voie Rho. Nos résultats démontrent qu’en effet, l’activation de RhoA, une petite GTPase clé de la voie Gα12, est inhibée de façon sélective par nos composés. De plus, nos molécules allostériques sont également efficaces pour inhiber la voie de signalisation de la ß-caténine, une protéine impliquée dans la genèse du cancer colorectal. In vivo, le traitement de souris avec un des ces modulateurs a permis une inhibition effective de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent donc que les modulateurs allostériques des récepteurs FP pourraient constituer une nouvelle classe de médicaments utilisés pour le traitement du cancer colorectal.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Novel surface-tethered estrogen polymeric platforms in cardiovascular regenerative medicine

L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro.

L'acide salicylique prévient la liaison de l'endothéline-1 dans les myocytes de rat adulte

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dimérisation du récepteur de chimiokine CXCR4

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.