Stepwise Photoinhibition of Photosystem II1 : Studies with Synechocystis Species PCC 6803 Mutants with a Modified D-E Loop of the Reaction Center Polypeptide D1

Several mutant strains of Synechocystis sp. PCC 6803 with large deletions in the D-E loop of the photosystem II (PSII) reaction center polypeptide D1 were subjected to high light to investigate the role of this hydrophilic loop in the photoinhibition cascade of PSII. The tolerance of PSII to photoinhibition in the autotrophic mutant ΔR225-F239 (PD), when oxygen evolution was monitored with 2,6-dichloro-p-benzoquinone and the equal susceptibility compared with control when monitored with bicarbonate, suggested an inactivation of the QB-binding niche as the first event in the photoinhibition cascade in vivo. This step in PD was largely reversible at low light without the need for protein synthesis. Only the next event, inactivation of QA reduction, was irreversible and gave a signal for D1 polypeptide degradation. The heterotrophic deletion mutants ΔG240-V249 and ΔR225-V249 had severely modified QB pockets, yet exhibited high rates of 2,6-dichloro-p-benzoquinone-mediated oxygen evolution and less tolerance to photoinhibition than PD. Moreover, the protein-synthesis-dependent recovery of PSII from photoinhibition was impaired in the ΔG240-V249 and ΔR225-V249 mutants because of the effects of the mutations on the expression of the psbA-2 gene. No specific sequences in the D-E loop were found to be essential for high rates of D1 polypeptide degradation.

Expression of cyclin D1 in epithelial tissues of transgenic mice results in epidermal hyperproliferation and severe thymic hyperplasia.

To study the involvement of cyclin D1 in epithelial growth and differentiation and its putative role as an oncogene in skin, transgenic mice were developed carrying the human cyclin D1 gene driven by a bovine keratin 5 promoter. As expected, all squamous epithelia including skin, oral mucosa, trachea, vaginal epithelium, and the epithelial compartment of the thymus expressed aberrant levels of cyclin D1. The rate of epidermal proliferation increased dramatically in transgenic mice, which also showed basal cell hyperplasia. However, epidermal differentiation was unaffected, as shown by normal growth arrest of newborn primary keratinocytes in response to high extracellular calcium. Moreover, an unexpected phenotype was observed in the thymus. Transgenic mice developed a severe thymic hyperplasia that caused premature death due to cardio-respiratory failure within 4 months of age. By 14 weeks, the thymi of transgenic mice increased in weight up to 40-fold, representing 10% of total body weight. The hyperplastic thymi had normal histology revealing a well-differentiated cortex and medulla, which supported an apparently normal T-cell developmental program based on the distribution of thymocyte subsets. These results suggest that proliferation and differentiation of epithelial cells are under independent genetic controls in these organs and that cyclin D1 can modulate epithelial proliferation without altering the initiation of differentiation programs. No spontaneous development of epithelial tumors or thymic lymphomas was perceived in transgenic mice during their first 8 months of life, although they continue under observation. This model provides in vivo evidence of the action of cyclin D1 as a pure mediator of proliferation in epithelial cells.

Translation initiation of ornithine decarboxylase and nucleocytoplasmic transport of cyclin D1 mRNA are increased in cells overexpressing eukaryotic initiation factor 4E.

The structure of m7GpppN (where N is any nucleotide), termed cap, is present at the 5' end of all eukaryotic cellular mRNAs (except organellar). The eukaryotic initiation factor 4E (eIF-4E) binds to the cap and facilitates the formation of translation initiation complexes. eIF-4E is implicated in control of cell growth, as its overexpression causes malignant transformation of rodent cells and deregulates HeLa cell growth. It was suggested that overexpression of eIF-4E results in the enhanced translation of poorly translated mRNAs that encode growth-promoting proteins. Indeed, enhanced expression of several proteins, including cyclin D1 and ornithine decarboxylase (ODC), was documented in eIF-4E-overexpressing NTH 3T3 cells. However, the mechanism underlying this increase has not been elucidated. Here, we studied the mode by which eIF-4E increases the expression of cyclin D1 and ODC. We show that the increase in the amount of cyclin D1 and ODC is directly proportional to the degree of eIF-4E overexpression. Two mechanisms, which are not mutually exclusive, are responsible for the increase. In eIF-4E-overexpressing cells the rate of translation initiation of ODC mRNA was increased inasmuch as the mRNA sedimented with heavier polysomes. For cyclin D1 mRNA, translation initiation was not increased, but rather its amount in the cytoplasm increased, without a significant increase in total mRNA. Whereas, in the parental NIH 3T3 cell line, a large proportion of the cyclin D1 mRNA was confined to the nucleus, in eIF-4E-overexpressing cells the vast majority of the mRNA was present in the cytoplasm. These results indicate that eIF-4E affects directly or indirectly mRNA nucleocytoplasmic transport, in addition to its role in translation initiation.

Agonist-induced desensitization of dopamine D1 receptor-stimulated adenylyl cyclase activity is temporally and biochemically separated from D1 receptor internalization.

The regulation of the dopamine D1 receptor was investigated by using c-myc epitope-tagged D1 receptors expressed in Sf9 (fall armyworm ovary) cells. Treatment of D1 receptors with 10 microM dopamine for 15 min led to a loss of the dopamine-detected high-affinity state of the receptor accompanying a 40% reduction in the ability of the receptor to mediate maximal dopamine stimulation of adenylyl cyclase activity. After 60 min of agonist exposure, 45 min after the occurrence of desensitization, 28% of the cell surface receptors were internalized into an intracellular light vesicular membrane fraction as determined by radioligand binding and supported by photoaffinity labeling, immunocytochemical staining, and immunoblot analysis. Pretreatment of cells with concanavalin A or sucrose completely blocked agonist-induced D1 receptor internalization without preventing agonist-induced desensitization, indicating a biochemical separation of these processes. Collectively, these findings indicate that the desensitization of D1 receptor-coupled adenylyl cyclase activity and D1 receptor internalization are temporarily and biochemically distinct mechanisms regulating D1 receptor function following agonist activation.

Signaling by ABL oncogenes through cyclin D1.

Oncogenic signals induce cellular proliferation by deregulating the cell division cycle. Cyclin D1, a regulator of G1-phase progression, acts synergistically with ABL oncogenes in transforming fibroblasts and hematopoietic cells in culture. Synergy with v-Abl depended on a motif in cyclin D1 that mediates its binding to the retinoblastoma protein, suggesting that ABL oncogenes in part mediate their mitogenic effects via a retinoblastoma protein-dependent pathway. Overexpression of cyclin D1, but not cyclin E, rescued a signaling-defective src-homology 2 (SH2) domain mutant of BCR-ABL for transformation of cells in culture and malignant tumor formation in vivo. These results demonstrate that cyclin D1 can provide essential signals for malignant transformation in concert with an activated tyrosine kinase.

D1 cap region involved in the receptor recognition and neural cell survival activity of human ciliary neurotrophic factor.

Human ciliary neurotrophic factor (hCNTF), which promotes the cell survival and differentiation of motor and other neurons, is a protein belonging structurally to the alpha-helical cytokine family. hCNTF was subjected to three-dimensional structure modeling and site-directed mutagenesis to analyze its structure-function relationship. The replacement of Lys-155 with any other amino acid residue resulted in abolishment of neural cell survival activity, and some of the Glu-153 mutant proteins had 5- to 10-fold higher biological activity. The D1 cap region (around the boundary between the CD loop and helix D) of hCNTF, including both Glu-153 and Lys-155, was shown to play a key role in the biological activity of hCNTF as one of the putative receptor-recognition sites. In this article, the D1 cap region of the 4-helix-bundle proteins is proposed to be important in receptor recognition and biological activity common to alpha-helical cytokine proteins reactive with gp130, a component protein of the receptors.

D1/D5 receptor agonists induce a protein synthesis-dependent late potentiation in the CA1 region of the hippocampus.

Agonists of the dopamine D1/D5 receptors that are positively coupled to adenylyl cyclase specifically induce a slowly developing long-lasting potentiation of the field excitatory postsynaptic potential in the CA1 region of the hippocampus that lasts for > 6 hr. This potentiation is blocked by the specific D1/D5 receptor antagonist SCH 23390 and is occluded by the potentiation induced by cAMP agonists. An agonist of the D2 receptor, which is negatively coupled to adenylyl cyclase through G alpha i, did not induce potentiation. Although this slow D1/D5 agonist-induced potentiation is partially independent of N-methyl-D-aspartate receptors, it seems to share some steps with and is occluded by the late phase of long-term potentiation (LTP) produced by three repeated trains of nerve stimuli applied to the Schaffer collateral pathway. Similarly, the D1/D5 antagonist SCH 23390 attenuates the late phase of the LTP induced by repeated trains, and the D1/D5 agonist-induced potentiation is blocked by the protein synthesis inhibitor anisomycin. These results suggest that the D1/D5 receptor may be involved in the late, protein synthesis-dependent component of LTP in the hippocampal CA1 region, either as an ancillary component or as a mediator directly contributing to the late phase.

Estudo do exossomo de Archaea e de sua interação com a proteína reguladora PaNip7

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'→5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo.

Ação da proteína amiloide sérica A em melanomas

Concentrações séricas basais da proteína amiloide sérica A (SAA) estão significativamente aumentadas em pacientes com câncer e alguns autores sugerem uma relação causal. Trabalho anterior do grupo mostrou que a SAA induz a proliferação de duas linhagens de glioblastoma humano e afeta os processos de invasividade in vitro, sustentando um papel pró-tumoral para esta proteína. Com base nesse trabalho, investigamos a abrangência dos efeitos de SAA para outro tipo de célula tumoral e para isso escolhemos um painel de linhagens de melanoma humano e uma linhagem primária obtida a partir de aspirado de linfonodo de paciente com melanoma, por nós isolada. Observamos que apesar da célula precursora de melanomas, isto é, melanócito, não produzir SAA, todas as linhagens de melanoma produziram a proteína e expressaram alguns dos seus receptores. Além disso, quando estas células foram estimuladas com SAA houve uma inibição da proliferação em tempos curtos de exposição (48 horas) e efeitos citotóxicos após um tempo maior (7 dias). A SAA também afetou processos de invasividade e a produção das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-α. Aos avaliarmos o efeito da SAA na interação das células de melanoma com células do sistema imune, vimos que a SAA ativou uma resposta imune anti-tumoral aumentando a expressão de moléculas co-estumolatórias, como CD69 e HLA-DR, e sua função citotóxica. Ainda, vimos que a produção de TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-1β e IL-8 estimuladas por SAA podem contribuir com os efeitos desta. De forma geral estes resultados nos levam a crer que a SAA tem atividade anti-tumoral em melanomas. Finalizando, com base na importância do desenvolvimento da resistência às terapias atuais para o melanoma, observamos que em células resistentes ao PLX4032, um inibidor de BRAF, os efeitos imunomodulatórios induzidos pela SAA estão abolidos, possivelmente identificando um novo componente da resistência.

Análise da expressão da proteína NY-ESO-1 no melanoma cutâneo

INTRODUÇÃO: o câncer é a doença que mais mata pessoas com idade abaixo de 85 anos e é um problema de saúde pública. Os tumores podem expressar em determinada fase de seu desenvolvimento proteínas anômalas que podem ser alvo de métodos diagnósticos e de intervenções terapêuticas. A expressão de NY-ESO-1 é detectada em 20 a 40% dos melanomas. Há evidências que esta expressão é mais freqüente em tumores de estágios mais avançados e está associada a um pior prognóstico. OBJETIVOS: determinar a frequência de expressão da proteína NY-ESO-1 no melanoma cutâneo e tentar correlacioná-la com o índice de Breslow, aspectos histopatológicos do melanoma, incluindo o infiltrado linfocítico tumoral, e a morbi-mortalidade dos pacientes. MÉTODOS: o presente estudo é longitudinal de coorte retrospectiva e foi realizado de agosto de 2009 a outubro de 2015. Foram selecionados 89 melanomas de 87 pacientes do Ambulatório de Tumores do Departamento de Dermatologia da FMUSP, divididos em 3 grupos, sendo: grupo 1: 34 melanomas com índice de Breslow <= 1,0 mm; grupo 2: 29 melanomas com índice de Breslow entre 1,1 - 4,0 mm e grupo 3: 26 melanomas com índice de Breslow >= 4,0 mm. As lâminas dos exames anátomo-patológicos destes pacientes foram revisadas quanto ao diagnóstico de melanoma, seu índice de Breslow e a presença de infiltrado linfocítico tumoral. A seguir, realizou-se exame de imunohistoquímica para a determinação da presença do antígeno NY-ESO-1 em todos os 89 tumores coletados e em mais 20 nevos (11 displásicos e 9 intradérmicos) escolhidos ao acaso. Através da revisão dos dados do prontuário, foram obtidos os dados clínicos de: idade, sexo, raça, fototipo da pele, local de aparecimento do melanoma, status do linfonodo sentinela quando realizado, desenvolvimento de metástases e sobrevida dos pacientes. Os dados anátomo-patológicos do tumor analisados foram: tipo histológico, presença de ulceração, e tipo de infiltrado linfocítico tumoral. Nos melanomas que apresentavam infiltrado linfocítico tumoral, foram realizados testes imunohistoquímicos para pesquisa de células CD3+, CD8+, FoxP3+ e CD8+FoxP3+ (duplamente positivas). RESULTADOS: O antígeno NY-ESO-1 esteve presente em 19% dos melanomas cutâneos primários e não foi detectado em nenhum dos 20 nevos pesquisados. A expressão do antígeno NY-ESO-1 esteve estatisticamente relacionada a tumores com espessuras maiores. Apresentou também uma associação inversa com o tipo extensivo superficial em relação aos outros tipos histológicos. O infiltrado linfocítico tumoral dos melanomas NY-ESO-1 positivos continha menor número de células CD3+, que se encontravam isoladas ou arranjadas em pequenos grupos de até 5 células, o que contrastava significantemente com os tumores NY-ESO-1 negativos, com maior densidade de células CD3+, dispostas em grandes grupos, com 6 ou mais células. A expressão da proteína NY-ESO-1 não esteve associada à idade, ao sexo, ao fototipo, ao sítio primário do tumor, à presença de ulceração, ao status do linfonodo sentinela, ao desenvolvimento de metástases ou à sobrevida. CONCLUSÕES: Há expressão de NY-ESO-1 em uma porcentagem considerável dos melanomas, principalmente nos mais espessos. O menor número de células CD3+ no infiltrado linfocítico tumoral, acrescido ao fato destas células estarem isoladas ou em pequenos grupos, sugere que embora imunogênico, a expressão do antígeno NY-ESO-1 não resulta num estímulo eficaz do sistema imune no combate ao tumor. O desenvolvimento de uma vacina para estes pacientes poderá, no futuro, aumentar as possibilidades terapêuticas do melanoma

Koala: sistema para integração de métodos de predição e análise de estruturas de proteína

A Biologia Computacional tem desenvolvido algoritmos aplicados a problemas relevantes da Biologia. Um desses problemas é a Protein Structure Prediction (PSP). Vários métodos têm sido desenvolvidos na literatura para lidar com esse problema. Porém a reprodução de resultados e a comparação dos mesmos não têm sido uma tarefa fácil. Nesse sentido, o Critical Assessment of protein Structure Prediction (CASP), busca entre seus objetivos, realizar tais comparações. Além disso, os sistemas desenvolvidos para esse problema em geral não possuem interface amigável, não favorecendo o uso por não especialistas da computação. Buscando reduzir essas dificuldades, este trabalho propões o Koala, um sistema baseado em uma plataforma web, que integra vários métodos de predição e análises de estruturas de proteínas, possibilitando a execução de experimentos complexos com o uso de fluxos de trabalhos. Os métodos de predição disponíveis podem ser integrados para a realização de análises dos resultados, usando as métricas RMSD, GDT-TS ou TM-Score. Além disso, o método Sort by front dominance (baseado no critério de optimalidade de Pareto), proposto nesse trabalho, consegue avaliar predições sem uma estrutura de referência. Os resultados obtidos, usando proteínas alvo de artigos recentes e do CASP11, indicam que o Koala tem capacidade de realizar um conjunto relativamente grande de experimentos estruturados, beneficiando a determinação de melhores estruturas de proteínas, bem como o desenvolvimento de novas abordagens para predição e análise por meio de fluxos de trabalho.

Blood markers and recurrence of stroke in patients with transient ischemic attack

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Uptake of antigen encapsulated in polyethylcyanoacrylate nanoparticles by D1-dendritic cells

Polyethylcyanoacrylate (PECA) nanoparticles were prepared by interfacial polymerization of a water-in-oil microemulsion. Nanoparticles were isolated from the polymerization template by sequential ethanol washing and centrifugation. A nanocapsule preparation yielding the original particle size and distribution following redispersion in an aqueous solution was achieved by freeze-drying the isolated nanoparticles in a solution of 5% w/v sugar. The cytotoxicity and uptake of nanocapsules by dendritic cells was investigated using a murine-derived cell line (D1). PECA nanoparticles were found to adversely effect cell viability at concentrations greater than 10 mug/ml of polymer in the culture medium. In comparison to antigen in solution, cell uptake of antigen encapsulated within nanoparticles was significantly higher at both 4 and 37 degreesC. Following a 24 h incubation period, the percentage of cells taking-up antigen was also increased when antigen was encapsulated in nanoparticles as compared to antigen in solution. The uptake of nanoparticles and the effect of antigen formulation on morphological cell changes indicative of cell maturation were also investigated by scanning electron microscopy (SEM). SEM clearly demonstrated the adherence of nanoparticles to the cell surface. Incubation of D1 dendritic cells with nanoparticles containing antigen also resulted in morphological changes indicative of cell maturation similar to that observed when the cells were incubated with lipopolysaccharide. In contrast, cells incubated with antigen solution did not demonstrate such morphological changes and appeared similar to immature cells that had not been exposed to antigen.