Caracterização genética de amostras de Conyza sp. do estado do Paraná

Crescente interesse tem se estabelecido para a análise da diversidade genética de espécies Conyza bonariensis, C.canadensis e C.sumatrensis, popularmente conhecidas como buva ou voadeira, que nos últimos anos vêm causando vários prejuízos nas lavouras do Brasil e do mundo, principalmente nas plantações de soja. A proposta do presente estudo foi estimar a variabilidade genética de amostras de C.sumatrensis provenientes da região noroeste do Estado do Paraná. A análise de isozimas em tecidos de folhas das plantas de C. sumatrensis foi realizada para estimar a variabilidade genética dentro de cada população e entre populações diferentes, no sentido de recomendar um tratamento diferencial ou uniforme para o controle dessas plantas daninhas na referida região. Foram analisados quatro sistemas enzimáticos (ACP, GPI, MDH e PGM) e detectados 10 locos com 10 alelos, os quais não apresentaram diversidade genética dentro e entre as populações analisadas, comprovado pela presença de apenas indivíduos homozigotos. As enzimas analisadas no presente estudo indicaram que as plantas das três regiões são geneticamente uniformes, e a uniformidade genética verificada para os referidos locos é um indicativo prévio de que é possível utilizar doses equivalentes do glifosato para controlar o crescimento desses biótipos.

Estrutura genética de populações de pindaíba (Xylopia brasiliensis Sprengel) por isoenzimas

Duas populações de Xylopia brasiliensis Sprengel foram estudadas por meio da eletroforese de isoenzimas, visando determinar os níveis de variabilidade genética mantidos entre e dentro das populações, sua estrutura genética, o fluxo gênico e o tamanho efetivo populacional. As amostragens foram efetuadas na "Reserva Florestal da UFLA" (População 1) e no sub-bosque de um plantio experimental com várias espécies de eucalipto (População 2) na região de Lavras, sul do Estado de Minas Gerais. Na População 1 coletou-se tecido foliar de 20 indivíduos reprodutivos e na População 2 foram coletados 20 plântulas e 20 indivíduos jovens. A análise das duas populações por meio de sete sistemas enzimáticos revelou a presença de 36 alelos totais distribuídos em 16 locos. O polimorfismo (P) com limite de freqüência igual ou inferior a 0,95 foi de 68,8% para a População 1 e de 87,5% para a População 2. O número médio de alelos por loco (A) variou de 1,9 a 2,2 e a diversidade genética medida pela heterozigosidade média esperada (e) variou de 0,313 a 0,424. A estrutura genética revelou que há uma tendência de excesso de heterozigotos para o conjunto das populações ( ou = -0,221). As populações apresentaram divergência genética de p= 0,092. O fluxo gênico medido pelo número de migrantes foi baixo m= 0,50. A área mínima estimada para a conservação in situ de uma população de X. brasiliensis foi de 10,08 ha.

Variabilidade isoenzimática em populações naturais de jacarandá paulista (Machaerium villosum Vog.)

Com o intuito de determinar os níveis de variabilidade genética mantidos entre e dentro de populações, a estrutura genética e o tamanho efetivo populacional foram estudadas por meio da eletroforese de isoenzimas em populações naturais de Machaerium villosum. Foram amostrados tecidos foliares de três populações naturais fragmentadas, onde coletou-se 30 indivíduos adultos nas populações 1 e 3 (Matinha e Bom Sucesso) e 35 indivíduos na população 2 (Subestação). Foram identificados vinte seis alelos distribuídos em 10 locos. Os índices de diversidade estimados para as três populações revelaram média de 2,4 alelos por loco e heterozigosidade média observada maior que a esperada para as três populações, revelando um excesso de heterozigotos. O polimorfismo foi de 90,0% nas populações 1 e 2 e de 100% na população 3. O índice de fixação (f) foi negativo em todas populações. A estrutura genética revelou que há excesso de heterozigotos para o conjunto das populações (F = -0.121). A divergência genética entre as populações foi baixa (0,061), revelando que 6,1% da variabilidade genética encontram-se entre e 93,9% dentro das populações. O tamanho efetivo estimado para cada população foi de 32, 48 e 42 indivíduos, respectivamente. Para a coleta de sementes, este parâmetro indicou a amostragem de 21 matrizes, de forma a garantir a manutenção da variabilidade genética.

Morfologia e anatomia foliar de três morfotipos de Marcetia taxifolia (A. St.-Hil.) DC. (Melastomataceae) na Serra do Cipó, MG

Nos campos rupestres da Serra do Cipó, MG, é possível distinguir morfotipos de M. taxifolia com intenso polimorfismo. Os objetivos deste estudo foram caracterizar e interpretar comparativamente a morfologia e a anatomia foliar de três morfotipos em condições de campo e cultivados, relacionando os fenótipos com variações ambientais. Os morfotipos foram denominados "Rosa", "Branco" e "Rosa Cristal" devido à cor das flores e ao aspecto do solo. Foram medidos no campo: altura da planta, área da copa, diâmetro da base caulinar e número de eixos caulinares. Em casa de vegetação, sementes de cada morfotipo germinaram em seu solo de origem e no dos outros dois morfotipos. Lâminas histológicas permanentes e temporárias de folha foram feitas para estudo anatômico. Os parâmetros mais significativos foram altura das plantas, número de caules e área foliar, que nas plantas do campo apresentaram-se maior no morfotipo "Branco" e menores no "Rosa Cristal". O número de eixos caulinares foi significativamente maior em "Rosa Cristal". Marcetia taxifolia apresenta grande plasticidade fenotípica, evidenciada pela heterogeneidade encontrada nos três morfotipos estudados, no campo e em casa de vegetação. A maior divergência ocorreu entre os morfotipos "Rosa Cristal" e "Branco". A plasticidade da espécie é pouco refletida em nível anatômico, sendo as variações encontradas, insuficientes para diferenciar os morfotipos. Fatores ambientais, como a composição química do solo, especialmente as concentrações de ferro e alumínio, e a disponibilidade hídrica foram os principais fatores que influenciaram as divergências relatadas.

Biologia reprodutiva de Rourea induta Planch. (Connaraceae), uma espécie heterostílica de cerrado do Brasil Central

A heterostilia é um polimorfismo floral geralmente associado a sistemas genéticos de intramorfo incompatibilidade. Nós avaliamos aspectos reprodutivos da heterostilia de uma população de Rourea induta Planch. em uma área de cerrado de Brasília, DF. Foram conduzidos estudos sobre sua biologia floral, sistema reprodutivo, produção e maturação de frutos, germinação de sementes, fenologia reprodutiva e visitantes florais. As flores são pequenas (11 mm de diâmetro), com morfologia simples e possuem dois grupos de cinco estames de comprimentos diferentes e cinco pistilos. O comprimento médio de estames e pistilos diferiu significativamente entre o morfo brevistilo e o longistilo. No entanto, não houve hercogamia recíproca completa entre os dois morfos florais. Os dois morfos são intramorfo incompatíveis, mas o morfo brevistilo é completamente auto-incompatível enquanto o longistilo é parcialmente autocompatível. Apesar das diferenças na morfologia floral e no sistema reprodutivo entre os morfos, estes apresentam igual sucesso reprodutivo em condições naturais, uma vez que a produção e a maturação de frutos por planta e a taxa de germinação das sementes não diferiram significativamente. A população de R. induta apresentou floração tipo "pulsed bang" com alta sincronia intra-individual e inter-individual de floração. Grande variedade de insetos, principalmente pequenas abelhas sociais, foi observada visitando as flores. Nossos resultados sugerem que a auto-incompatibilidade parcial, a incompatibilidade intramorfo e as diferenças nas alturas dos verticilos reprodutivos entre os dois morfos reduzem os níveis de autogamia em R. induta. Em última análise, a maior produção de frutos por polinização intermorfo, promoveu a razão isoplética na população estudada e indicou que R. induta é dependente dos polinizadores para a reprodução sexuada.

Diversidade genética, endogamia e fluxo gênico em pequena população fragmentada de Copaifera langsdorffii

O objetivo deste trabalho foi investigar a taxa de imigração e a distância de dispersão de pólen e sementes em uma pequena população fragmentada de Copaifera langsdorffii Desf., com base no polimorfismo de oito locos microssatélites. Foram mapeadas e genotipadas todas as 47 árvores adultas e 65 subadultas existentes no fragmento. Adultos tinham um total número menor de alelos (142) do que subadultos (164), sendo 20 alelos exclusivos aos adultos e 41 aos subadultos. Adultos tinham significativamente menor diversidade genética e maior endogamia (Â = 17,75 ± 0,51; Âe = 8,97 ± 0,27; ^F = 0,191 ± 0,017) do que subadultos (Â = 20,5 ± 0,65; Âe = 10,86 ± 0,29; ^F = 0,119 ± 0,013). O poder de exclusão do primeiro parente foi alto para o conjunto de locos nos adultos (P1º Parente = 0,9994), mostrando que estes oito locos microssatélites têm alto poder de resolver testes de parentescos. Dos 65 subadultos, foi encontrado o parental materno para 12 e o materno e paterno para apenas dois indivíduos, o que indica uma taxa de imigração de sementes e pólen na população de 81% (m sementes) e 97% (m pólen), respectivamente. Estes resultados sugerem uma alta taxa de fluxo gênico no passado. A distância média de dispersão de sementes foi de 38,4 m. Os resultados evidenciam que a população apresenta altos níveis de diversidade genética, devido a uma intensa taxa de imigração de sementes e pólen.

Efficient retrovirus-mediated transfer of cell-cycle control genes to transformed cells

The use of gene therapy continues to be a promising, yet elusive, alternative for the treatment of cancer. The origins of cancer must be well understood so that the therapeutic gene can be chosen with the highest chance of successful tumor regression. The gene delivery system must be tailored for optimum transfer of the therapeutic gene to the target tissue. In order to accomplish this, we study models of G1 cell-cycle control in both normal and transformed cells in order to understand the reasons for uncontrolled cellular proliferation. We then use this information to choose the gene to be delivered to the cells. We have chosen to study p16, p21, p53 and pRb gene transfer using the pCL-retrovirus. Described here are some general concepts and specific results of our work that indicate continued hope for the development of genetically based cancer treatments.

Expression of neuronal nitric oxide synthase in the developing superficial layers of the rat superior colliculus

We investigated the level of expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in the retinorecipient layers of the rat superior colliculus during early postnatal development. Male and female Lister rats ranging in age between the day of birth (P0) and the fourth postnatal week were used in the present study. Two biochemical methods were used, i.e., in vitro measurement of NOS specific activity by the conversion of [³H]-arginine to [³H]-citrulline, and analysis of Western blotting immunoreactive bands from superior colliculus homogenates. As revealed by Western blotting, very weak immunoreactive bands were observed as early as P0-2, and their intensity increased progressively at least until P21. The analysis of specific activity of NOS showed similar results. There was a progressive increase in enzymatic activity until near the end of the second postnatal week, and a nonsignificant tendency to an increase until the end of the third week was also observed. Thus, these results indicated an increase in the amount of nNOS during the first weeks after birth. Our results confirm and extend previous reports using histochemistry for NADPH-diaphorase and immunocytochemistry for nNOS, which showed a progressive increase in the number of stained cells in the superficial layers during the first two postnatal weeks, reaching an adult pattern at the end of the third week. Furthermore, our results suggested that nNOS is present in an active form in the rat superior colliculus during the period of refinement of the retinocollicular pathway.

TIMP-1 mediates the inhibitory effect of interleukin-6 on the proliferation of a hepatocarcinoma cell line in a STAT3-dependent manner

The tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-1 is a multifunctional protein which is not only an inhibitor of matrix metalloproteinases (MMPs) but also to have a possible "cytokine-like" action. Here, we first compared mRNA expression of TIMP-1 and MMP-9 in BEL-7402 (a hepatocellular carcinoma cell line), L-02 (a normal liver cell line) and QSG-7701 (a cell line derived from peripheral tissue of liver carcinoma) using real-time quantitative RT-PCR. By evaluating the variation of the MMP-9/TIMP-1 ratio as an index of reciprocal changes of the expression of the two genes, we observed that the MMP-9/TIMP-1 ratio was about 13- and 5-fold higher in BEL-7402 than in L-02 and QSG-7701, respectively. Significantly, overexpression of TIMP-1 decreased the MMP-9/TIMP-1 ratio in BEL-7402 and then inhibited the cell growth to 60% and reduced the migration to about 30%. Meanwhile, our data showed that interleukin-6 (IL-6) (100 ng/mL) could also inhibited the cell growth of BEL-7402. Further studies indicated that TIMP-1 mediated the inhibitory effect of IL-6 on BEL-7402 cell proliferation in a STAT3-dependent manner, which could further accelerate the expression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21. A dominant negative STAT3 mutant totally abolished IL-6-induced TIMP-1 expression and its biological functions. The present results demonstrate that TIMP-1 may be one of the mediators that regulate the inhibitory effect of IL-6 on BEL-7402 proliferation in which STAT3 signal transduction and p21 up-regulation also play important roles.

A DNA enzyme targeting Egr-1 inhibits rat vascular smooth muscle cell proliferation by down-regulation of cyclin D1 and TGF-β1

We have demonstrated that a synthetic DNA enzyme targeting early growth response factor-1 (Egr-1) can inhibit neointimal hyperplasia following vascular injury. However, the detailed mechanism of this inhibition is not known. Thus, the objective of the present study was to further investigate potential inhibitory mechanisms. Catalytic DNA (ED5) and scrambled control DNA enzyme (ED5SCR) were synthesized and transfected into primary cultures of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs). VSMC proliferation and DNA synthesis were analyzed by the MTT method and BrdU staining, respectively. Egr-1, TGF-β1, p53, p21, Bax, and cyclin D1 expression was detected by RT-PCR and Western blot. Apoptosis and cell cycle assays were performed by FACS. Green fluorescence could be seen localized in the cytoplasm of 70.6 ± 1.52 and 72 ± 2.73% VSMCs 24 h after transfection of FITC-labeled ED5 and ED5SCR, respectively. We found that transfection with ED5 significantly inhibited cultured VSMC proliferation in vitro after 24, 48, and 72 h of serum stimulation, and also effectively decreased the uptake of BrdU by VSMC. ED5 specifically reduced serum-induced Egr-1 expression in VSMCs, further down-regulated the expression of cyclin D1 and TGF-β1, and arrested the cells at G0/G1, inhibiting entry into the S phase. FACS analysis indicated that there was no significant difference in the rate of apoptosis between ED5- and ED5SCR-transfected cells. Thus, ED5 can specifically inhibit Egr-1 expression, and probably inhibits VSMC proliferation by down-regulating the expressions of cyclin D1 and TGF-β1. However, ED5 has no effect on VSMC apoptosis.

Hypoxic-ischemic injury decreases anxiety-like behavior in rats when associated with loss of tyrosine-hydroxylase immunoreactive neurons of the substantia nigra

Neonatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control, mild hypoxia-ischemia (HI), and severe HI groups (N = 10 in each group at each time) on postnatal day 7 (P7) to study the effect of mild and severe HI on anxiety-like behavior and the expression of tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra (SN). The mild and severe HI groups were exposed to hypoxia (8% O2/92% N2) for 90 and 150 min, respectively. The elevated plus-maze (EPM) test was performed to assess anxiety-like behavior by measuring time spent in the open arms (OAT) and OAT%, and immunohistochemistry was used to determine the expression of TH in the SN at P14, P21, and P28. OAT and OAT% in the EPM were significantly increased in both the mild (1.88-, 1.99-, and 2.04-fold, and 1.94-, 1.51-, and 1.46-fold) and severe HI groups (1.69-, 1.68-, and 1.87-fold, and 1.83-, 1.43-, and 1.39-fold, respectively; P < 0.05). The percent of TH-positive cells occupying the SN area was significantly and similarly decreased in both the mild (17.7, 40.2, and 47.2%) and severe HI groups (16.3, 32.2, and 43.8%, respectively; P < 0.05). The decrease in the number of TH-positive cells in the SN and the level of protein expression were closely associated (Pearson correlation analysis: r = 0.991, P = 0.000 in the mild HI group and r = 0.974, P = 0.000 in the severe HI group) with the impaired anxiety-like behaviors. We conclude that neonatal HI results in decreased anxiety-like behavior during the juvenile period of Sprague-Dawley rats, which is associated with the decreased activity of TH in the SN. The impairment of anxiety and the expression of TH are not likely to be dependent on the severity of HI.

REGγ is a strong candidate for the regulation of cell cycle, proliferation and the invasion by poorly differentiated thyroid carcinoma cells

REGγ is a proteasome activator that facilitates the degradation of small peptides. Abnormally high expression of REGγ has been observed in thyroid carcinomas. The purpose of the present study was to explore the role of REGγ in poorly differentiated thyroid carcinoma (PDTC). For this purpose, small interfering RNA (siRNA) was introduced to down-regulate the level of REGγ in the PDTC cell line SW579. Down-regulation of REGγ at the mRNA and protein levels was confirmed by RT-PCR and Western blot analyses. FACS analysis revealed cell cycle arrest at the G1/S transition, the MTT assay showed inhibition of cell proliferation, and the Transwell assay showed restricted cell invasion. Furthermore, the expression of the p21 protein was increased, the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) protein decreased, and the expression of the p27 protein was unchanged as shown by Western blot analyses. REGγ plays a critical role in the cell cycle, proliferation and invasion of SW579 cells. The alteration of p21 and PCNA proteins related to the down-regulation of REGγ suggests that p21 and PCNA participate in the process of REGγ regulation of cell cycle progression and cell proliferation. Thus, targeting REGγ has a therapeutic potential in the management of PDTC patients.

Depressed nNOS expression during spine transition in the developing hippocampus of FMR1 KO mice

Nitric oxide (NO), synthesized as needed by NO synthase (NOS), is involved in spinogenesis and synaptogenesis. Immature spine morphology is characteristic of fragile X syndrome (FXS). The objective of this research was to investigate and compare changes of postnatal neuronal NOS (nNOS) expression in the hippocampus of male fragile X mental retardation 1 gene knockout mice (FMR1 KO mice, the animal model of FXS) and male wild-type mice (WT) at postnatal day 7 (P7), P14, P21, and P28. nNOS mRNA levels were analyzed by real-time quantitative PCR (N = 4-7) and nNOS protein was estimated by Western blot (N = 3) and immunohistochemistry (N = 1). In the PCR assessment, primers 5’-GTGGCCATCGTGTCCTACCATAC-3’ and 5’-GTTTCGAGGCAGGTGGAAGCTA-3’ were used for the detection of nNOS and primers 5’-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTA-3’ and 5’-CCCCAATACCACATCATCCAT-3’ were used for the detection of β-actin. Compared to the WT group, nNOS mRNA expression was significantly decreased in FMR1 KO mice at P21 (KO: 0.2857 ± 0.0150, WT: 0.5646 ± 0.0657; P < 0.05). Consistently, nNOS immunoreactivity also revealed reduced staining intensity at P21 in the FMR1 KO group. Western blot analysis validated the immunostaining results by demonstrating a significant reduction in nNOS protein levels in the FMR1 KO group compared to the WT group at P21 (KO: 0.3015 ± 0.0897, WT: 1.7542 ± 0.5455; P < 0.05). These results suggest that nNOS was involved in the postnatal development of the hippocampus in FXS and impaired NO production may retard spine maturation in FXS.

Sphingosine-1-phosphate-evoked invasion of follicular thyroid cancer cells : evidence for the involvement of HIF-Iα, MMP2 and MMP9

Sphingolipids are widely expressed molecules, which traditionally were considered to have majorly structural properties. Nowadays, however, they are implicated in a wide range of different biological processes. The bioactive lipid sphingosine 1-phosphate (S1P) has emerged during the past decade as one of the most studied molecules due to its proliferative and pro-migratory abilities both during normal physiology and in the pathology of a subset of different diseases. Migration and invasion of cancer cells require changes in cell behavior and modulation of the tissue microenvironment. Tumor aggressiveness is markedly enhanced by hypoxia, in which hypoxia inducible transcription factors 1-2α (HIF-1-2α) are activated to promote metabolism, proliferation and migration. Invasion requires degradation of the extracellular matrix (ECM) achieved by several degrading and remodeling enzymes. Matrix metalloproteinases (MMPs) are broadly expressed and well accepted as proteolytic enzymes with essential roles both in normal physiology and in pathology. Previously, S1P was shown to strongly evoke migration of follicular ML-1 thyroid cancer cells. The objective of this study was to further investigate and understand the mechanisms behind this regulation. In the first project it was demonstrated that S1P enhances the expression and activity of HIF-1α. S1P enhanced the expression of HIF-1α by increasing its synthesis and stability. The S1P-increased HIF-1α was mediated via S1P3, Gi/0, PI3K, PKCβI, ERK1/2, mTOR and translation factors p70S6K and eIF4E. Finally, it was shown that HIF-1α mediated S1P-induced migration. The ECM is constituted of a complex and coordinated assembly of many types of proteins. In order to be able to invade, cells need to break down the ECM, therefore several key players in this event were investigated in the second project. S1P increased the secretion and activity of MMP2 and MMP9 via S1P-receptor 1 and 3 and that these MMPs participated in the S1P-facilitated invasion of ML-1 cells. In this interplay, calpains and Rac1 were involved, both of which are crucial players in migration and invasion. The prognosis for some types of thyroid cancer is relatively good. However, there are forms of thyroid cancers, for which there are no treatments or the current available treatments are inefficient. Thus, new medical interventions are urgently needed. In the third project the significance of the S1P-receptor modulating drug FTY720, which is currently used for the treatment of multiple sclerosis (MS), was studied. The effect of FTY720 was tested on several thyroid cancer cell lines, and it inhibited the proliferation and invasion of all cancer cell lines tested. In ML-1 cells, FTY720 attenuated invasion by blocking signaling intermediates important for migration and invasion of the cells. Moreover, FTY720 inhibited the proliferation of ML-1 cells by increasing the expression of p21 and p27, hence, inducing cell arrest in G1 phase of the cell cycle. Thus, it can be suggested that FTY720 could be used in the treatment of thyroid cancer.

Análise da tendência temporal de dano renal agudo entre pacientes graves conforme polimorfi smos I/D e -262A > T da enzima conversora da angiotensina

A síndrome de disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (DMOS) e a disfunção renal aguda compartilham muitos dos fatores fisiológicos envolvidos em seu desenvolvimento. Estudos recentes correlacionam suscetibilidades individuais, determinadas geneticamente, à disfunção de órgãos em pacientes criticamente enfermos, situação em que o gene da enzima conversora da angiotensina (ECA) poderia ser um candidato para elucidar predisposição ou risco genético. Nosso objetivo foi examinar os efeitos da presença de dois polimorfismos, I/D e -262A > T, na disfunção renal em pacientes agudamente graves do Sul do Brasil. O escore SOFA (sequential organ failure assessment) à admissão e a tendência da função renal (medida pelo escore renal diário do SOFA) foram determinados em pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI). Um total de 153 pacientes adultos (79 homens) foi incluído no estudo. Houve monitoração diária da função renal durante toda a permanência na UTI e também pós-UTI. Observou-se a progressão para insuficiência renal (SOFA 3 e 4) nos primeiros sete dias de internação em UTI, bem como necessidade de diálise. As frequências genotípicas gerais em nossa amostra foram II = 0,17; ID = 0,46; DD = 0,37; e AA = 0,30; AT = 0,55; TT = 0,15; e as frequências alélicas foram I = 0,40, D = 0,60; e A = 0,56; T = 0,44. Este é o primeiro estudo para verificar a influência de polimorfismos I/D e -262A > T da ECA em disfunção renal aguda em pacientes críticos. Nenhuma associação significativa foi encontrada entre os genótipos ou as frequências alélicas e a evolução da função renal. Os polimorfismos I/D e -262A > T da ECA não têm impacto significativo sobre a evolução da função renal durante a primeira semana de internação na UTI nem exercem qualquer influência sobre a mortalidade em pacientes graves.