Analysis of PAX2 gene alterations in renal cell tumors

Dissertation for applying to a Master’s Degree in Molecular Genetics and Biomedicine submitted to the Sciences and Technology Faculty of New University of Lisbon

The Role of Small RNAs and Ribonucleases in the Control of Gene Expression in Salmonella Typhimurium

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Interplay of Exoribonucleases, Hfq and Small RNAs Structural Determinants in the Control of Gene Expression

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Overexpressing BDNF in Neural Stem Cells using non-viral gene delivery strategies

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene fosfolipase B(PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Regulation of gene expression by SnRK1 kinases and miRNAs during the plant stress response

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Plant Physiology

Caracterização do papel do gene bola: consequências na motilidade bacteriana e formação de biofilmes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Controlling gene expression in enterobacteriaceae: studies on sRNAs and strategies for synthetic biology

Dissertation presented to obtain the Master Degree in Molecular, Genetics and Biomedicine

Avaliação do polimorfismo no gene da metilenotetrahidrofolato redutase e concentração de folato e vitamina B12 em pacientes portadores do HIV-1 em tratamento com anti-retrovirais

Neste trabalho, investigamos concentração da vitamina B12 e folato, considerando-se a influência dos genótipos da metilenotetrahidrofolato redutase, o perfil imunológico e a terapia antiretroviral utilizada na população brasileira portadora do HIV. Um grupo de 86 indivíduos portadores do HIV-1 e 29 doadores de sangue foram recrutados para compor a casuística. Entre os infectados pelo HIV-1, observou-se menor concentração de B12 no grupo com maior número de linfócitos TCD4+. Não encontramos diferença na distribuição genotípica para as mutações MTHFR C677T e A1298C entre infectados e não infectados pelo HIV-1. Indivíduos portadores do HIV, genótipo C677C, apresentaram concentrações menores de B12 em relação ao grupo controle de mesmo genótipo. A terapia antiretroviral não mostrou qualquer influência nos valores de folato e vitamina B12. Estudos adicionais são necessários para reavaliar a prevalência de menores concentrações de B12 e folato e de hiperhomocisteinemia na população portadora do HIV sob a ótica do uso de HAART e da melhoria na sobrevida dos pacientes.

Digoxigenin-labeled probe for rabies virus nucleoprotein gene detection

A digoxigenin-labeled probe was produced from the Pasteur virus strain for the detection of the rabies virus N gene. The probe hybridization was performed from amplified N gene obtained by reverse transcription polymerase chain reaction and the results by RT-PCR and hybridization showed 100% agreement. The hybridization, when carried out in products amplified by RT-PCR, increases the sensitivity of this technique even more and confers specificity to the diagnosis. The technique described in this work will be useful in rabies diagnosis laboratories, once the cost is compatible with traditional rabies diagnostic techniques.

Nested-PCR do gene que codifica o antígeno b aplicada ao diagnóstico da tuberculose pulmonar

A reação em cadeia da polimerase usada para amplificação de uma seqüência interna de um fragmento previamente amplificado (nested-PCR) foi investigada como uma alternativa complementar a pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes e a cultura do Mycobacterium tuberculosis em meio de Lowenstein-Jensen. Foram investigadas 144 amostras de escarro de pacientes suspeitos de tuberculose encaminhados ao Laboratório de Tuberculose do Instituto Evandro Chagas em Belém, no período de junho de 2002 a dezembro de 2003. Das 144 amostras, 121 foram caracterizadas como tuberculose, 119 foram positivas na cultura, 95 na baciloscopia e 128 na nested-PCR. A sensibilidade da nested-PCR foi 96% (116/121), enquanto a especificidade foi 48% (11/23). A nested-PCR poderá ser uma ferramenta complementar para o diagnóstico da tuberculose, pois apresenta sensibilidade equivalente à cultura, no entanto, necessita de maiores avaliações visando minimizar o número de resultados falso-positivos.

Pesquisa de assinaturas de selecção de malária na região do gene humano TPI (triosefosfato isomerase)

A malária continua a ser a maior causa de doença e mortalidade no Mundo, sobretudo no continente Africano. Das cinco espécies do parasita causador de malária em humanos, Plasmodium falciparum é a mais letal. Em termos evolutivos a malária é um fenómeno recente com cerca de 10 000 anos, período onde tem atuado como importante pressão seletiva no genoma humano, contribuindo para a seleção de inúmeros polimorfismos que propiciam maior resistência ao protozoário parasita. Apesar da interação entre o parasita e o hospedeiro ser foco de inúmeros estudos, é bastante complexa e ainda está longe de ser totalmente compreendida, nomeadamente os fatores de suscetibilidade/resistência à infeção ou à doença. Este estudo teve como principal objetivo contribuir para o estudo dos polimorfismos eritrocitários associados à proteção contra a infeção malárica grave, centrando-se no gene TPI que codifica uma enzima glicolítica. Foi selecionada uma amostra populacional Africana (Moçambique) agrupada de acordo com a gravidade da doença (grupos clínicos). Fez-se o rastreio dos exões do gene TPI por SSCP, na busca de alterações no padrão de migração dos produtos amplificados, indiciadores de alterações na sequência nucleotídica que pudessem ser assinaturas de eventuais efeitos evolutivos exercidos pela malária; caracterizaram-se as variantes do promotor do gene TPI: -5A>G, -8G>A e -24T>G; e analisou-se o polimorfismo intrónico 2262 situado no intrão 5. Esta análise permitiu identificar o polimorfismo -8G>A como possível marcador associado à proteção contra a malária, observando-se diferenças estatisticamente significativas entre doentes com malária grave e não-grave [P = 0,032; OR = 0,230 (CI95%: 0,049-1,081)], quando associado ao haplótipo -5G/-8A/2262G. Através de um estudo de microssatélites nas regiões adjacentes ao gene TPI, estimou-se a antiguidade dos polimorfismos -5G>A e -8G>A, tendo-se obtido a idade de ~20 mil anos e ~14 mil anos, respetivamente. Ao nível bioquímico, o polimorfismo -8G>A poderá estar associado à acumulação celular de metilglioxal citotóxico, um potente inibidor da proliferação parasitária.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Surdez em Portugal: estudos genéticos e funcionais do gene da conexina

A surdez é a deficiência sensorial mais comum na população humana, afetando o desenvolvimento social do indivíduo afetado por esta patologia. Estima-se que 50% dos casos de deficiência auditiva podem ser evitáveis. Cerca de 1/1000 recém-nascidos apresentam surdez e 1/3 da população acima dos 65 anos é também afetada. No presente estudo, foram analisadas 19 famílias diferentes. Analisou-se ainda 399 amostras aleatórias de recém-nascidos provenientes das várias regiões de Portugal. Mutações no gene GJB2, que codifica para a Cx26, são a principal causa de surdez hereditária não sindrómica, como tal, foi analisado nos dois tipos de população em estudo, tal como o gene GJB6, que codifica para a Cx30. Nas famílias analisadas foram encontradas as mutações c.35delG, p.Met34Thr e p.R127H, no gene GJB2, as quais se contam entre as mutações mais comuns na população portuguesa. Na população aleatória foram encontradas as mutações c.35delG. p.Met34Thr e K224Q, assim como o polimorfismo F83L. Foram caracterizadas funcionalmente três mutações da Cx26 – a p.Leu213X, p.Gly160Ser e p.Gly160Cys. Verificou-se que as proteínas contendo a mutação p.Leu213X foram observadas principalmente no citoplasma, o que sugere que elas são aí retidas. O défice no seu tráfego para a membrana poderá estar relacionado com o facto de esta mutação originar um codão STOP no domínio C-terminal da proteína. As proteínas que continham a mutação p.Gly160Ser e a p.Gly160Cys são transportadas até à membrana plasmática, tal como a Cx26 selvagem. No entanto, a permeabilidade dos canais intercelulares compostos por Cx26 apresentando estas mutações não foi investigada. Este estudo contribui para o aprofundamento do conhecimento sobre a surdez hereditária e o espectro de mutações no locus DFNB1. Permitiu também a primeira caracterização funcional de três mutações da Cx26. Os estudos funcionais têm em vista a possível aplicação de terapias destinadas à recuperação da função nativa da Cx26.

Detecção do gene mecA em estafilococos coagulase negativa resistentes à oxacilina isolados da saliva de profissionais da enfermagem

Estafilococos coagulase negativa estão frequentemente associados às infecções nosocomiais e os profissionais da saúde podem ser reservatório e dissemina-los no hospital e comunidade. O objetivo desse estudo foi identificar espécies de estafilococos coagulase negativa isolados da saliva de profissionais da enfermagem, determinar o perfil de resistência e detectar o gene mecA. Foram selecionados 100 estafilococos coagulase negativa, sendo 41 identificados como Staphylococcus epidermidis, 25 Staphylococcus saprophyticus, 18 Staphylococcus haemolyticus, 8 Staphylococcus cohnii, 4 Staphylococcus lugdunenses, 3 Staphylococcus capitis, e 1 Staphylococcus Simulans. Desses, 32% apresentaram resistência à oxacilina, 84,4% à mupirocina, 32% à cefoxitina, e todos sensíveis a vancomicina. Dos estafilococos coagulase negativa resistentes à oxacilina, 93,7% desenvolveram-se no agar oxacilina (6µg/ml) e o gene mecA foi detectado em 75%. Os resultados sinalizam que maiores investimentos devem ser direcionados a identificação das espécies de estafilococos coagulase negativa nas instituições de saúde e na comunidade.