Role of milk and meat products as vehicles for antibiotic-resistant bacteria

This subject is reviewed under the following headings: Microbial contamination of raw meat and raw milk; Antibiotic resistance of food-borne pathogens; Antibiotic resistance of commensal and potentially pathogenic bacteria as a new threat in food microbiology; Antibiotic-resistant staphylococci in fermented meat and [in] milk products; Antibiotic-resistant Enterococcus sp. in fermented meat and [in] milk products; Enterococci in farm animals and meat; Enterococci in fermented food; Molecular characterization of resistance of food-borne enterococci; and Further ecological and epidemiological considerations of resistant live bacteria in food. It is concluded that further research is needed, particularly into the possible transfer of the resistance of bacteria consumed in meat or milk products to the indigenous bacteria of the human consumer.

In vitro activity of photoactivated disinfection using a diode laser in infected root canals

OBJECTIVE To investigate the lethal activity of photoactivated disinfection (PAD) on Enterococcus faecalis (ATCC 29212) and mixed populations of aerobic or anaerobic bacteria in infected root canals using a diode laser after the application of a photosensitizer (PS). MATERIALS AND METHODS First, the bactericidal activity of a low power diode laser (200 mW) against E. faecalis ATCC 29212 pre-treated with a PS (toluidine blue) for 2 min were examined after different irradiation times (30 s, 60 s and 90 s). The bactericidal activity in the presence of human serum or human serum albumin (HSA) was also examined. Second, root canals were infected with E. faecalis or with mixed aerobic or anaerobic microbial populations for 3 days and then irrigated with 1.5% sodium hypochlorite and exposed to PAD for 60 s. RESULTS Photosensitization followed by laser irradiation for 60 s was sufficient to kill E. faecalis. Bacteria suspended in human serum (25% v/v) were totally eradicated after 30 s of irradiation. The addition of HSA (25 mg/ml or 50 mg/ml) to bacterial suspensions increased the antimicrobial efficacy of PAD after an irradiation time of 30 s, but no longer. The bactericidal effect of sodium hypochlorite was only enhanced by PAD during the early stages of treatment. PAD did not enhance the activity of sodium hypochlorite against a mixture of anaerobic bacteria. CONCLUSIONS The bactericidal activity of PAD appears to be enhanced by serum proteins in vitro, but is limited to bacteria present within the root canal.

Chromosomally and extrachromosomally mediated high-level gentamicin resistance in Streptococcus agalactiae

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS) is a leading cause of sepsis in neonates. The rate of invasive GBS disease in non-pregnant adults also continues to climb. Aminoglycosides alone have little or no effect on GBS, but synergistic killing with penicillin has been shown in vitro. High-level gentamicin resistance (HLGR) in GBS isolates, however, leads to loss of a synergistic effect. We therefore performed a multicentre study to determine the frequency of HLGR GBS isolates and to elucidate the molecular mechanisms leading to gentamicin resistance. From eight centres in four countries, 1128 invasive and colonizing GBS isolates were pooled and investigated for the presence of HLGR. We identified two strains that displayed HLGR (BSU1203 and BSU452), both of which carried the aacA-aphD gene, typically conferring HLGR. Though, only one strain (BSU1203) also carried the previously described chromosomal gentamicin resistance transposon, designated Tn3706. In the other strain (BSU452), plasmid purification and subsequent DNA sequencing resulted in the detection of plasmid pIP501 carrying a remnant of a Tn3 family transposon. Its ability to confer HLGR was proven by transfer into an Enterococcus faecalis isolate. Conversely, loss of HLGR was documented after curing both GBS BSU452 and the transformed E. faecalis strain from the plasmid. This is the first report showing a plasmid mediated HLGR in GBS. Thus, in our clinical GBS isolates HLGR is mediated both chromosomally and extrachromosomally.

A dual oxidase generates a protective oxidative burst during infection in C. elegans

Caenorhabditis elegans has recently been developed as a model system to study both pathogen virulence mechanisms and host defense responses. We have shown that C. elegans produces reactive oxygen species (ROS) in response to exposure to the important Gram-positive, noscomial pathogen, Enterococcus faecalis. We have also shown evidence of oxidative stress and upregulation of stress response after exposure to the pathogen. As in mammalian systems, this work shows that production of ROS for innate immune functions occurs via an NADPH oxidase. Specifically, reducing expression of a dual oxidase, Ce-duox1/BLI-3 causes a decrease in ROS production in response to E. faecalis. We also present evidence that reduction of expression of Ce-duox1/BLI-3 increases susceptibility to this pathogen, specifically when expression is reduced in the intestine and the hypodermis. This dual oxidase has previously been localized to the hypodermis, but we show that it is additionally localized to the intestine of C. elegans. To further demonstrate the protective effects of the pathogen-induced ROS production, we demonstrate that antioxidants that scavenge ROS, increase the sensitivity of the nematode to the infection, in stark contrast to their longevity-promoting effects under non-pathogenic conditions. In conclusion, we postulate that the generation of ROS by NADPH oxidases in the barrier epithelium is an ancient, highly conserved innate immune defense mechanism.^

Novel microbicidal agents derived from Naja atra cardiotoxin 1 (CTX-1)

During my PhD course, I focused my research on antimicrobial peptides (AMPs), in particular on the aspects of their computational design and development. This work led to the development of a new family of AMPs that I designed, starting from the amino acid sequence of a snake venom toxin, the cardiotoxin 1 (CTX-1) of Naja atra. Naja atra atra cardiotoxin 1, produced by Chinese cobra snakes belonging to Elapidae family, is included in the three-finger toxin family and exerts high cytotoxicity and antimicrobial activity too. This toxin family is characterized by specific folding of three beta-sheet loops (“fingers”) extending from the central core and by four conserved disulfide bridges. Using as template the first loop of this toxin, different sequences of 20 amino acids linear cationic peptides have been designed in order to avoid toxic effects but to maintain and strengthen the antimicrobial activity. As a result, the sequence NCP-0 (Naja Cardiotoxin Peptide-0) was designed as ancestor and subsequently other 4 variant sequences of NCP0 were developed. These variant sequences have shown microbicidal activity towards a panel of reference strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi and an enveloped virus. In particular, the sequence designed as NCP-3 (Naja Cardiotoxin Peptide-3) and its variants NCP-3a and NCP-3b have shown the best antimicrobial activity together with low cytotoxicity against eukaryotic cells and low hemolytic activity. Bactericidal activity has been demonstrated by minimum bactericidal concentration (MBC) assay at values below 10 μg/ml for Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ( clinical isolates), Moraxella catharralis ATCC 25238, MRSA ATCC 43400, while towards Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus hirae ATCC 10541 and Streptococcus agalactiae ATCC 13813 the bactericidal activity was demonstrated even below 1.6 μg/ml concentration. This potent antimicrobial activity was confirmed even for unicellular fungi Candida albicans, Candida glabrata and Malassezia pachydermatis (MBC 32.26-6.4 μg/ml), and also against the fast-growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis DSMZ 43756 and Mycobacterium fortuitum DSMZ 46621 (MBC 100 μg/ml). Moreover, NCP-3 has shown a virucidal activity on the enveloped virus Bovine Herpesvirus 1 (BoHV1) belonging to herpesviridae family. The bactericidal activity is maintained in a high salt concentration (125 and 250 mM NaCl) medium and PB +20% Mueller Hinton Medium for E. coli, MRSA and Pseudomonas aeruginosa reference strains. Considering these in vitro obtained data, we propose NCP-3 and its variants NCP-3a and NCP-3b as promising antimicrobial candidates. For this reason, the whole novel AMPs family has been protected by a national patent (n°102015000015951).

Estratégias para conservação de carne armazenada sob refrigeração: embalagem em atmosfera modificada e processamento em alta pressão

A busca por produtos mais saudáveis e minimamente processados tem levado indústrias e pesquisadores a estudarem novas formas de preservação de alimentos. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar o efeito da embalagem com atmosfera modificada (ATM) na preservação de lombo ovino armazenado sob refrigeração e 2) Avaliar o efeito do processamento em alta pressão na conservação de carne bovina marinada e com teor de sódio reduzido. Em ambas as pesquisas, músculos Longissimus lumborum foram submetidos à contagem microbiana, avaliação de cor, pH, oxidação lipídica (TBARS), perdas por cocção (PPC) e força de cisalhamento. Para o estudo do efeito da embalagem em atmosfera modificada, as amostras foram acondicionadas em cinco sistemas de ATM, 15% O2 + 85% CO2; 30% de O2 + 70% de CO2; 45% de O2 + 55% de CO2; 60% de O2 + 40% de CO2 e Vácuo (controle) e armazenadas a 1°C durante 21 dias. As análises de cor, pH, TBARS, PPC e força de cisalhamento foram realizadas a cada sete dias e as microbiológicas duas vezes por semana. Diferentes concentrações de oxigênio dentro da embalagem trouxeram diferença significativa na intensidade de cor vermelha das carnes armazenadas em ATM. Até o sétimo dia de estocagem tratamentos com maior quantidade de O2 apresentaram melhor coloração, após esse período embalagens a vácuo conseguiram preservar melhor a mioglobina. Diferentes concentrações gasosas não trouxeram causaram diferença (p> 0,05) no pH da carne entre tratamentos. Nenhuma diferença significativa entre tratamentos foi encontrada para amostras embaladas em ATM nos parâmetros perda de peso por cocção e força de cisalhamento. A embalagem em atmosfera modificada foi capaz de retardar o crescimento da microbiota presente na carne. Isso levou á preservação da amostra por até 18 dias sob refrigeração, enquanto amostras a vácuo tiveram uma vida útil de 11 dias. Para o estudo do efeito da alta pressão em carne marinada com baixo teor de sódio, as carnes foram inoculadas com 106 UFC/g de carne com E. faecium e Listeria innocua e em seguida marinadas durante 18 horas, a 4°C, em diferentes soluções: 1% NaCl + 1% ácido cítrico, 1% NaCl + 2% ácido cítrico, 2% NaCl + 2% ácido cítrico e 2% NaCl + 2% ácido cítrico. Após a marinação as amostras foram submetidas ao tratamento nas seguintes pressões: Zero (controle), 300MPa, 450Mpa, 600MPa. As análises físico-químicas e microbiológicas foram realizadas logo após o tratamento. O tratamento em alta pressão foi capaz de reduzir a população microbiana em até seis ciclos logarítmicos quando 600Mpa foram aplicados em todas as soluções estudadas. A não aplicação de alta pressão proporcionou a redução de apenas um ciclo log na população de E. faecium quando as carnes foram marinadas com 2% NaCl + 2% ácido cítrico. A alta pressão e as diferentes concentrações de sal e ácido, não trouxeram diferença significativa na coloração das amostras. Já o maior teor de ácido cítrico na marinada causou maior (p<0,05) redução do pH da carne em comparação com as amostras em baixa concentração de ácido. Os experimentos demonstraram que a tanto embalagem a vácuo quanto a aplicação de ácido cítrico foram eficientes em retardar a oxidação lipídica. Pressões de 600Mpa tornaram a carne significativamente mais dura que as demais pressões aplicadas. Os resultados demonstraram a possibilidade de extensão da vida útil da carne refrigerada através da aplicação de diferentes tecnologias: a embalagem com atmosfera modificada para carne fresca e processamento em alta pressão de carnes marinadas com reduzido teor de sal.

Banho de clorexidina para prevenção de colonização e infecção por micro-organismos multirresistentes na unidade de transplante de células tronco e hematopoiéticas

Introdução: Infecções relacionadas à assistência de saúde (IRAS) representam hoje um dos principais desafios da qualidade do cuidado do paciente, principalmente em pacientes submetido a transplante de células tronco e hematopoiéticas (TCTH) O banho diário com a clorexidina (CHG) degermante a 2% tem sido proposto principalmente em unidades de terapia intensivas (UTIs) para diminuir a colonização bacteriana do paciente e assim diminuir IRAS. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do banho com CHG degermante a 2% em unidade de internação de TCTH na incidência de infecção e colonização por patógenos multirresistentes e ainda avaliar seu impacto na sensibilidade das bactérias ao antisséptico. Métodos: Foi realizado um estudo quasi-experimental, com duração de 9 anos, com início em janeiro/2005 até dezembro/2013. A intervenção foi iniciada em agosto de 2009, sendo que os períodos pré e pós-intervenção tiveram duração de 4,5 anos. As taxas de IRAS, infecção por gram-negativos multirresistentes e infecção e colonização por enterococo resistente a vancomicina (VRE) foram avaliadas através de série temporal, para estudar o impacto da intervenção. As concentrações inibitórias mínimas (CIM) das bactérias para a CHG com e sem o inibidor de bomba de efluxo (CCCP) foram avaliadas nos dois períodos. Os genes de resistência a CHG foram estudados por meio da PCR e a clonalidade dos isolados por eletroforese em campo pulsátil. Resultados: Foi observada redução significativa na incidência de infecção e colonização de VRE na unidade no período pós-intervenção (p: 0,001). Essa taxa permaneceu estável em outras UTIs clínicas do hospital. Contudo as taxas de infecção por Gram negativos multirresistentes aumentou nos últimos anos na unidade. Não ocorreu diminuição na taxa de IRAS na unidade. As CIMs testadas de CHG aumentaram nas amostras de VRE e K. pneumoniae após o período de exposição ao antisséptico, com queda importante da CIM após o uso do CCCP, revelando ser a bomba de efluxo, um importante mecanismo de resistência à CHG. As amostras de A. baumannii e P. aeruginosa não apresentaram aumento da CIM após período de exposição à clorexidina. As bombas de efluxo Ade A, B e C estiveram presentes na maioria dos A. baumannii do grupo controle (66%). A bomba cepA foi encontrada em 67% de todas as K. pneumoniae testadas e em 44,5% das P. aeruginosas do grupo pré intervenção. Observamos uma relação positiva entre a presença da CepA nas amostras de K. pneumoniae e a resposta ao CCCP: de todas as 49 amostras CepA positivas 67,3% obtiveram redução do seu MIC em 4 diluições após adição do CCCP. A avaliação de clonalidade demonstrou padrão policlonal das amostras de VRE, K. pneumoniae e A. baumannii avaliadas. Em relação às amostras de P. aeruginosa foi observado que no período pós-intervenção ocorreu predominância de um clone com > 80% semelhança em 10 das 22 amostras avaliadas pelo dendrograma. Conclusões: O banho de clorexidina teve impacto na redução da incidência de infecção e colonização por VRE na unidade de TCTH, e não teve o mesmo impacto nas bactérias gram-negativas. Os mecanismos moleculares de resistência à clorexidina estão intimamente ligados à presença de bomba de efluxo, sendo provavelmente o principal mecanismo de resistência e tolerância das bactérias ao antisséptico

Hemoculturas positivas num serviço de pediatria: 2003-2012

Introdução: Em situações clínicas selecionadas é aconselhada investigação complementar da criança com febre, nomeadamente realização de hemocultura. Objetivos: Analisar as hemoculturas positivas por bactérias patogénicas num serviço de pediatria, nomeadamente agentes mais frequentes, sua evolução, respetivos antibiogramas e correlação com dados clínicos. Material e Métodos: Estudo retrospetivo de dados micro- biológicos das bactérias patogénicas isoladas em hemoculturas e dados clínicos de crianças com idade entre um mês e 17 anos, admitidas num serviço de pediatria, entre 2003 e 2012. Resultados: No período estudado, a percentagem anual de hemoculturas positivas por bactérias potencialmente patogénicas variou entre 0,8% e 2,9%. No total isolaram-se 158 bactérias patogénicas, sendo mais frequentes: Staphylococcus aureus (29,1%), Streptococcus pneumoniae (27,8%), Escherichia coli (10,1%), Enterococcus faecalis (8,2%), Neisseria meningitidis (5,7%) e Streptococcus pyogenes (5,7%). Nenhuma Neisseria meningitidis foi resistente à resistente à ampicilina, 9% dos Streptococcus pneumoniae tiveram resistência intermédia à penicilina, 8,7% dos Staphylococcus aureus tiveram resistência à meticilina e 6,3% das Escherichia coli tinham resistência à amoxicilina/ácido clavulânico. Sessenta e sete porcento das hemoculturas positivas por bactérias patogénicas correspondiam a crianças com idade inferior a 36 meses. Os diagnósticos mais relevantes foram: bacteriémia oculta, pneumonia, sépsis, meningite e pielonefrite. Ocorreu um óbito devido a choque sético (Streptococcus pneumoniae). Conclusão: Nos 10 anos analisados, as bactérias mais frequentes foram: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Escherichia coli. Verificou-se diminuição da incidência da Neisseria meningitidis após 2005 e do Streptococcus pneumoniae após 2007. As suscetibilidades das diferentes bactérias patogénicas aos antimicrobianos mantiveram-se estáveis. Enfatiza-se a importância epidemiológica e clínica da monitorização de dados microbiológicos.

Atividade antibacteriana de sementes de açaí (Euterpe oleracea Mart.)

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antibacteriana de um extrato aquoso de sementes de açaí (Euterpe oleracea Mart.), proveniente do Brasil, em isolados clínicos. O extrato revelou atividade antibacteriana em todos os isolados clínicos testados com a exceção de Escherichia coli e de Klebsiella pneumoniae. Os melhores valores de CMIs (concentrações mínimas inibitórias) foram observados para Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) (0,25 mg/mL), Staphylococcus aureus sensível à meticilina (MSSA), Enterococcus faecalis e Streptococcus agalactiae com um valor de 0,5 mg/mL. O extrato testado parece ser uma opção a explorar no combate de bactérias resistentes.

Rugulotrosins A and B: Two new antibacterial metabolites from an Australian isolate of a penicillium sp.

Two new antibacterial agents, rugulotrosin A (1) and B (2), were obtained from cultures of a Penicillium sp. isolated from soil samples acquired near Sussex Inlet, New South Wales, Australia. Rugulotrosin A (1) is a chiral symmetric dimer, and its relative stereostructure was determined by spectroscopic and X-ray crystallographic analysis. Rugulotrosin B (2) is a chiral asymmetric dimer isomeric with 1. Its structure was determined by spectroscopic analysis with comparison to the co-metabolite 1 and previously reported fungal metabolites. Both rugulotrosins A and B displayed significant antibacterial activity against Bacillus subtilis, while rugulotrosin A was also strongly active against Enterococcus faecalis and B. cereus.

In vitro antibacterial activity of Australian native herb extracts against food-related bacteria

The antibacterial activities of water, ethanol and hexane extracts of five Australian herbs (Backhousia citriodora, Anetholea anisata, Eucalyptus staigerana, Eu. olida and Prostanthera incisa) against seven food-related bacteria (Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Enteritidis, Sal. Typhimurium and Staphylococcus aureus) were determined by the microtitre broth microdilution assay. The water extracts of all the herbs displayed no or low antimicrobial activity against all of the bacteria tested with the exception of S. aureus. Relatively high levels of activity (minimum inhibitory concentrations of 125-15.6 mu g ml(-1)) against this pathogen were present in water extracts from all herbs except P. incisa. The ethanol and hexane extracts of all herbs displayed some activity against a number of the bacteria tested, with no one particular herb displaying an obviously higher level or range of activity. Staphylococcus aureus proved to be the most sensitive of the bacteria tested against the solvent extracts with all extracts displaying activity ranging from 125 to 7.8 mu g ml(-1), while E. coli and L. monocytogenes, on the other hand, proved the least sensitive with only five of 15 herb/extract combinations displaying any activity against these pathogens. The extracts of the Australian native herbs examined in this study have potential for application in foods to increase shelf-life or promote safety. (c) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Active membrane transport and receptor proteins from bacteria

A general strategy for the expression of bacterial membrane transport and receptor genes in Escherichia coli is described. Expression is amplified so that the encoded proteins comprise 5-35% of E. coli inner membrane protein. Depending upon their topology, proteins are produced with RGSH6 or a Strep tag at the C-terminus. These enable purification in mg quantities for crystallization and NMR studies. Examples of one nutrient uptake and one multidrug extrusion protein from Helicobacter pylori are described. This strategy is successful for membrane proteins from H. pylori, E. coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Microbacterium liquefaciens, Brucella abortus, Brucella melitensis, Campylobacter jejuni, Neisseria meningitides, Streptomyces coelicolor and Rhodobacter sphaeroides. ©2005 Biochemical Society.