Design rationnel de nanothermomètres programmables à base d’ADN

Développer de nouveaux nanomatériaux, interrupteurs et machines nanométriques sensibles à de petites variations de température spécifiques devrait être de grande utilité pour une multitude de domaines œuvrant dans la nanotechnologie. De plus, l’objectif est de convaincre le lecteur que les nanotechnologies à base d’ADN offrent d’énormes possibilités pour la surveillance de température en temps réel à l’échelle nanométrique. Dans la section Résultats, nous exploitons les propriétés de l’ADN pour créer des thermomètres versatiles, robustes et faciles à employer. En utilisant une série de nouvelles stratégies inspirées par la nature, nous sommes en mesure de créer des nanothermomètres d’ADN capables de mesurer des températures de 25 à 95°C avec une précision de <0.1°C. En créant de nouveaux complexes d’ADN multimériques, nous arrivons à développer des thermomètres ultrasensibles pouvant augmenter leur fluorescence 20 fois sur un intervalle de 7°C. En combinant plusieurs brins d’ADN avec des plages dynamiques différentes, nous pouvons former des thermomètres montrant une transition de phase linéaire sur 50°C. Finalement, la vitesse de réponse et la précision des thermomètres développés et leur réversibilité sont illustrées à l’aide d’une expérience de surveillance de température à l’intérieur d’un unique puits d’un appareil de qPCR. En conclusion, les applications potentielles de tels nanothermomètres en biologie synthétique, imagerie thermique cellulaire, nanomachines d’ADN et livraison contrôlée seront considérées.

Novel surface-tethered estrogen polymeric platforms in cardiovascular regenerative medicine

L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro.

Design rationnel de nanothermomètres programmables à base d’ADN

Développer de nouveaux nanomatériaux, interrupteurs et machines nanométriques sensibles à de petites variations de température spécifiques devrait être de grande utilité pour une multitude de domaines œuvrant dans la nanotechnologie. De plus, l’objectif est de convaincre le lecteur que les nanotechnologies à base d’ADN offrent d’énormes possibilités pour la surveillance de température en temps réel à l’échelle nanométrique. Dans la section Résultats, nous exploitons les propriétés de l’ADN pour créer des thermomètres versatiles, robustes et faciles à employer. En utilisant une série de nouvelles stratégies inspirées par la nature, nous sommes en mesure de créer des nanothermomètres d’ADN capables de mesurer des températures de 25 à 95°C avec une précision de <0.1°C. En créant de nouveaux complexes d’ADN multimériques, nous arrivons à développer des thermomètres ultrasensibles pouvant augmenter leur fluorescence 20 fois sur un intervalle de 7°C. En combinant plusieurs brins d’ADN avec des plages dynamiques différentes, nous pouvons former des thermomètres montrant une transition de phase linéaire sur 50°C. Finalement, la vitesse de réponse et la précision des thermomètres développés et leur réversibilité sont illustrées à l’aide d’une expérience de surveillance de température à l’intérieur d’un unique puits d’un appareil de qPCR. En conclusion, les applications potentielles de tels nanothermomètres en biologie synthétique, imagerie thermique cellulaire, nanomachines d’ADN et livraison contrôlée seront considérées.

Novel surface-tethered estrogen polymeric platforms in cardiovascular regenerative medicine

L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro.

Development of nanostructured hydrogel for spatial and temporal controlled release of active compounds

L’utilisation de nanovecteurs pour la livraison contrôlée de principes actifs est un concept commun de nous jours. Les systèmes de livraison actuels présentent encore cependant des limites au niveau du taux de relargage des principes actifs ainsi que de la stabilité des transporteurs. Les systèmes composés à la fois de nanovecteurs (liposomes, microgels et nanogels) et d’hydrogels peuvent cependant permettre de résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous avons développé un système de livraison contrôlé se basant sur l’incorporation d’un nanovecteur dans une matrice hydrogel dans le but de combler les lacunes des systèmes se basant sur un vecteur uniquement. Une telle combinaison pourrait permettre un contrôle accru du relargage par stabilisation réciproque. Plus spécifiquement, nous avons développé un hydrogel structuré intégrant des liposomes, microgels et nanogels séparément chargés en principes actifs modèles potentiellement relargués de manière contrôlé. Ce contrôle a été obtenu par la modification de différents paramètres tels que la température ainsi que la composition et la concentration en nanovecteurs. Nous avons comparé la capacité de chargement et la cinétique de relargage de la sulforhodamine B et de la rhodamine 6G en utilisant des liposomes de DOPC et DPPC à différents ratios, des nanogels de chitosan/acide hyaluronique et des microgels de N-isopropylacrylamide (NIPAM) à différents ratios d’acide méthacrylique, incorporés dans un hydrogel modèle d’acrylamide. Les liposomes présentaient des capacités de chargement modérés avec un relargage prolongé sur plus de dix jours alors que les nanogels présentaient des capacités de chargement plus élevées mais une cinétique de relargage plus rapide avec un épuisement de la cargaison en deux jours. Comparativement, les microgels relarguaient complétement leur contenu en un jour. Malgré une cinétique de relargage plus rapide, les microgels ont démontré la possibilité de contrôler finement le chargement en principe actif. Ce contrôle peut être atteint par la modification des propriétés structurelles ou en changeant le milieu d’incubation, comme l’a montré la corrélation avec les isothermes de Langmuir. Chaque système développé a démontré un potentiel contrôle du taux de relargage, ce qui en fait des candidats pour des investigations futures.

Nanotechnology in food industry II: risk assessment and legislation

Currently, there is increasing use of nanomaterials in the food industry thanks to the many advantages offered and make the products that contain them more competitive in the market. Their physicochemical properties often differ from those of bulk materials, which require specialized risk assessment. This should cover the risks to the health of workers and consumers as well as possible environmental risks. The risk assessment methods must go updating due to more widespread use of nanomaterials, especially now that are making their way down to consumer products. Today there is no specific legislation for nanomaterials, but there are several european dispositions and regulations that include them. This review gives an overview of the risk assessment and the existing current legislation regarding the use of nanotechnology in the food industry.

The Weapons of Mass Destruction and the Global Security Strategy of the EU

The proliferation of weapons of mass destruction (WMD), nuclear, biological and chemical (NBC) is one of the main security challenges facing the international community today. However the new Global Security Strategy of 2016 raises the question of non-proliferation of WMD only as an incidental matter, not addressing directly the threat, a fundamental threat in the regional and global security. This is a clear step backwards for the European common security.

An Infection-Responsive Approach to Reduce Bacterial Adhesion in Urinary Biomaterials

Infection is an inevitable consequence of chronic urinary catheterisation, with associated problems of recurrent catheter encrustation and blockage experienced by approximately 50% of all long-term catheterised patients. In this work we have exploited, for the first time, the reported pathogen-induced elevation of urine pH as a trigger for ‘intelligent’ antimicrobial release from novel hydrogel drug delivery systems of 2-hydroxyethyl methacrylate and vinyl-functionalised nalidixic acid derivatives, developed as candidate infection-resistant urinary catheter coatings. Demonstrating up to 20-fold faster rates of drug release at pH 10, representing infected urine pH, than at pH 7, and achieving reductions of up to 96.5% in in vitro bacterial adherence, our paradigm of pH-responsive drug delivery, which requires no external manipulation, therefore represents a promising development towards the prevention of catheter-associated urinary tract infections (CAUTIs) in vivo.

MiRNA 34a: a therapeutic target for castration-resistant prostate cancer

INTRODUCTION: Development of a therapy for bone metastases is of paramount importance for castration-resistant prostate cancer (CRPC). The osteomimetic properties of CRPC confer a propensity to metastasize to osseous sites. Micro-ribonucleic acid (miRNA) is non-coding RNA that acts as a post-transcriptional regulator of multiple proteins and associated pathways. Therefore identification of miRNAs could reveal a valid third generation therapy for CRPC. Areas covered: miR34a has been found to play an integral role in the progression of prostate cancer, particularly in the regulation of metastatic genes involved in migration, intravasation, extravasation, bone attachment and bone homeostasis. The correlation between miR34a down-regulation and metastatic progression has generated substantial interest in this field. Expert opinion: Examination of the evidence reveals that miR34a is an ideal target for gene therapy for metastatic CRPC. We also conclude that future studies should focus on the effects of miR34a upregulation in CRPC with respect to migration, translocation to bone micro-environment and osteomimetic phenotype development. The success of miR34a as a therapeutic is reliant on the development of appropriate delivery systems and targeting to the bone micro-environment. In tandem with any therapeutic studies, biomarker serum levels should also be ascertained as an indicator of successful miR34a delivery.

Water-retaining hydrogels – the unsung heroes of medicine

Hydrogels, materials that can absorb and retain large quantities of water, could revolutionise medicine. Our bodies contain up to 60% water, but hydrogels can hold up to 90%. It is this similarity to human tissue that has led researchers to examine if these materials could be used to improve the treatment of a range of medical conditions including heart disease and cancer.

Discrete-event Simulation and Optimization to Improve the Performance of a Healthcare System

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-08

Improving interfaces for nerve repair

Autologous nerve grafts are the current gold standard for the repair of peripheral nerve injuries. However, there is a need to develop an alternative to this technique, as donor-site morbidities such as neuroma formation and permanent loss of function are a few of the limitations concerned with this technique. Artificial nerve conduits have therefore emerged as an alternative for the repair of short peripheral nerve defects of less than 30 mm, however they do not surpass autologous nerve grafts clinically. To develop a nerve conduit that supports regeneration over long nerve gaps and in large diameter nerves, researchers have focused on functionalizing of the conduits by studying the components that enhance nerve regeneration such as micro/nano-topography, growth factor delivery systems, supportive cells and extracellular matrix (ECM) proteins as well as understanding the complex biological reactions that take place during peripheral nerve regeneration. This thesis presents strategies to improve peripheral nerve interfaces to better the regenerative potential by using dorsal root ganglions (DRGs) isolated from neonatal rats as an in vitro model of nerve regeneration. The work started off by investigating the usefulness of a frog foam protein Ranaspumin-2 (Rsn2) to coat biomaterials for compatibility, this lead to the discovery of temporary cell adhesion on polydimethylsiloxane (PDMS), which was investigated as a suitable tool to derive cell-sheets for nerve repair. The influence of Rsn2 anchored to specific adhesion peptide sequences, such as isoleucine-lysine-valine-alanine-valine (IKVAV), a sequence derived from laminin proven to promote cell adhesion and neurite outgrowth, was tested as a useful means to influence nerve regeneration. This approach improves the axonal outgrowth and maintains outgrowth long term. Based on the hypothesis that combinational modulation of substrate topography, stiffness and neurotrophic support, affects axonal outgrowth in whole DRGs, dissociated DRGs were used to assess if these factors similarly act at the single cell level. Rho associated protein kinase (ROCK) and myosin II inhibitors, which affect cytoskeletal contractility, were used to influence growth cone traction forces and have shown that these factors work in combination by interfering with growth cone dynamic creating a different response in axonal outgrowth at the single cell level.

Hybrid materials for biomedical applications

The increased longevity of humans and the demand for a better quality of life have led to a continuous search for new implant materials. Scientific development coupled with a growing multidisciplinarity between materials science and life sciences has given rise to new approaches such as regenerative medicine and tissue engineering. The search for a material with mechanical properties close to those of human bone produced a new family of hybrid materials that take advantage of the synergy between inorganic silica (SiO4) domains, based on sol-gel bioactive glass compositions, and organic polydimethylsiloxane, PDMS ((CH3)2.SiO2)n, domains. Several studies have shown that hybrid materials based on the system PDMS-SiO2 constitute a promising group of biomaterials with several potential applications from bone tissue regeneration to brain tissue recovery, passing by bioactive coatings and drug delivery systems. The objective of the present work was to prepare hybrid materials for biomedical applications based on the PDMS-SiO2 system and to achieve a better understanding of the relationship among the sol-gel processing conditions, the chemical structures, the microstructure and the macroscopic properties. For that, different characterization techniques were used: Fourier transform infrared spectrometry, liquid and solid state nuclear magnetic resonance techniques, X-ray diffraction, small-angle X-ray scattering, smallangle neutron scattering, surface area analysis by Brunauer–Emmett–Teller method, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Surface roughness and wettability were analyzed by 3D optical profilometry and by contact angle measurements respectively. Bioactivity was evaluated in vitro by immersion of the materials in Kokubos’s simulated body fluid and posterior surface analysis by different techniques as well as supernatant liquid analysis by inductively coupled plasma spectroscopy. Biocompatibility was assessed using MG63 osteoblastic cells. PDMS-SiO2-CaO materials were first prepared using nitrate as a calcium source. To avoid the presence of nitrate residues in the final product due to its potential toxicity, a heat-treatment step (above 400 °C) is required. In order to enhance the thermal stability of the materials subjected to high temperatures titanium was added to the hybrid system, and a material containing calcium, with no traces of nitrate and the preservation of a significant amount of methyl groups was successfully obtained. The difficulty in eliminating all nitrates from bulk PDMS-SiO2-CaO samples obtained by sol-gel synthesis and subsequent heat-treatment created a new goal which was the search for alternative sources of calcium. New calcium sources were evaluated in order to substitute the nitrate and calcium acetate was chosen due to its good solubility in water. Preparation solgel protocols were tested and homogeneous monolithic samples were obtained. Besides their ability to improve the bioactivity, titanium and zirconium influence the structural and microstructural features of the SiO2-TiO2 and SiO2-ZrO2 binary systems, and also of the PDMS-TiO2 and PDMS-ZrO2 systems. Detailed studies with different sol-gel conditions allowed the understanding of the roles of titanium and zirconium as additives in the PDMS-SiO2 system. It was concluded that titanium and zirconium influence the kinetics of the sol-gel process due to their different alkoxide reactivity leading to hybrid xerogels with dissimilar characteristics and morphologies. Titanium isopropoxide, less reactive than zirconium propoxide, was chosen as source of titanium, used as an additive to the system PDMS-SiO2-CaO. Two different sol-gel preparation routes were followed, using the same base composition and calcium acetate as calcium source. Different microstructures with high hydrophobicit were obtained and both proved to be biocompatible after tested with MG63 osteoblastic cells. Finally, the role of strontium (typically known in bioglasses to promote bone formation and reduce bone resorption) was studied in the PDMS-SiO2-CaOTiO2 hybrid system. A biocompatible material, tested with MG63 osteoblastic cells, was obtained with the ability to release strontium within the values reported as suitable for bone tissue regeneration.

Lipid-Based Liquid Crystals As Carriers for Antimicrobial Peptides: Phase Behavior and Antimicrobial Effect

International audience

Formulation and nebulization of fluticasone propionate-loaded lipid nanocarriers.

International audience