Studies on the anti-inflammatory effect of S-Adenosyl-L-methionine

1. S-adenosyl-L-methionine (SAMe) had no effect on cytochrome C reduction by superoxide generated from xanthine oxidase except at high concentrations. This was due to direct inhibition of the enzyme. 2. SAMe inhibited the neutrophil respiratory burst , measured by luminol enhanced chemiluminescence, to FMLP and zymosan A but not to PMA. 3. Adenosine and methylthioadenosine (MTA) inhibited the respiratory burst elicited by FMLP. 4. SAMe inhibited the phagocytosis of latex particles by neutrophils at high concentrations but methionine and S-adenosyl L-homocysteine had no effect. 5. Treatment with SAMe had no effect on cell infiltration or PGE2 production in 6-day air pouches. 6. Treatment with SAMe at the optimum dose of 50mg/kg inhibited the early phases of carrageenan induced rat hind paw inflammation but had a lesser effect on the secondary response. The antiinflammatory effect was sustained after inhibiton of polyamine synthesis. 7. SAMe increased liver putrescine levels in the presence and absence of inflammation Spermidine levels were increased in the presence of inflammation but spermine levels were unaffected by any of the treatments. 8. MT A and adenosine increased liver putrescine and spermidine levels 9. Treatment with SAMe had no effect on the polyamine status of blood. lO.Treatment with SAMe had no effect on the levels of glutathione in liver or blood. 11.SAMe and MTA inhibited histamine and platelet-activating factor (PAF) induced hind paw inflammation but had no effect on inflammation induced by dextran, zymosan, compound 48/80, 5-hydroxytryptamine, arachidonic acid or glucose oxidase. MTA was more effective than SAMe. 12. PAP-induced rat hind paw inflammation was inhibited by isoprenaline and verapamil. Combinations of these drugs with SAMe or MT A had no further enhancement of effect. 13. Incubation of rat PMNLs with [14c ] SAMe increased the intracellular levels of S-adenosyl-L-homocysteine in a dose dependent manner, but had no effect on the intracellular levels of SAMe, adenosine or MT A. 14. Pharmacokinetic studies of plasma SAMe following a single dose of the drug (50mg/kg) i.p. demonstrated that SAMe is rapidly absorbed and metabolised

Induction of apoptosis by a cachectic-factor in murine myotubes and inhibition by eicosapentaenoic acid

Treatment of C2C12 myotubes with a tumour-derived proteolysis-inducing factor (PIF) at concentrations between 1 and 10 nM was shown to stimulate the activity of the apoptotic initiator caspases-8 and -9 and the apoptotic effector caspases-2,-3 and -6. This increased caspase activity was attenuated in myotubes pretreated with 50 μM eicosapentaenoic acid (EPA). At least part of the increase in caspase activity may be related to the increased proteasome proteolytic activity, since a caspase-3 inhibitor completely attenuated the PIF-induced increase in 'chymotrypsin-like' enzyme activity, the predominant proteolytic activity of the proteasome. However, Western blot analysis showed that PIF induced an increase in expression of the active form of caspase-3, which was also attenuated by EPA. Further Western blot analysis showed PIF increased the cytosolic content of cytochrome c, as well as expression of the pro-apoptotic protein bax but not the antiapoptotic protein bcl-2, which were both attenuated by 50 μM EPA. Induction of apoptosis by PIF in murine myotubes was confirmed by an increase in free nucleasomes formation and increased DNA fragmentation evidenced by a nucleasomal ladder typical of apoptotic cells. This process was again inhibited by pre-incubation with EPA. These results suggest that in addition to activating the proteasome, PIF induces apoptosis in C2C12 myotubes, possibly through the common intermediate arachidonic acid. Both of these processes would contribute to the loss of skeletal muscle in cancer cachexia.

Mechanical and electrical properties of single-walled carbon nanotubes synthesized by chemical vapor deposition

Despite the tremendous application potentials of carbon nanotubes (CNTs) proposed by researchers in the last two decades, efficient experimental techniques and methods are still in need for controllable production of CNTs in large scale, and for conclusive characterizations of their properties in order to apply CNTs in high accuracy engineering. In this dissertation, horizontally well-aligned high quality single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) have been successfully synthesized on St-cut quartz substrate by chemical vapor deposition (CVD). Effective radial moduli (Eradial) of these straight SWCNTs have been measured by using well-calibrated tapping mode and contact mode atomic force microscopy (AFM). It was found that the measured Eradial decreased from 57 to 9 GPa as the diameter of the SWCNTs increased from 0.92 to 1.91 nm. The experimental results were consistent with the recently reported theoretical simulation data. The method used in this mechanical property test can be easily applied to measure the mechanical properties of other low-dimension nanostructures, such as nanowires and nanodots. The characterized sample is also an ideal platform for electrochemical tests. The electrochemical activities of redox probes Fe(CN)63-/4-, Ru(NH3) 63+, Ru(bpy)32+ and protein cytochrome c have been studied on these pristine thin films by using aligned SWCNTs as working electrodes. A simple and high performance electrochemical sensor was fabricated. Flow sensing capability of the device has been tested for detecting neurotransmitter dopamine at physiological conditions with the presence of Bovine serum albumin. Good sensitivity, fast response, high stability and anti-fouling capability were observed. Therefore, the fabricated sensor showed great potential for sensing applications in complicated solution.^

Multimode Analysis of Nanoscale Biomolecular Interactions

Biomolecular interactions, including protein-protein, protein-DNA, and protein-ligand interactions, are of special importance in all biological systems. These interactions may occer during the loading of biomolecules to interfaces, the translocation of biomolecules through transmembrane protein pores, and the movement of biomolecules in a crowded intracellular environment. The molecular interaction of a protein with its binding partners is crucial in fundamental biological processes such as electron transfer, intracellular signal transmission and regulation, neuroprotective mechanisms, and regulation of DNA topology. In this dissertation, a customized surface plasmon resonance (SPR) has been optimized and new theoretical and label free experimental methods with related analytical calculations have been developed for the analysis of biomolecular interactions. Human neuroglobin (hNgb) and cytochrome c from equine heart (Cyt c) proteins have been used to optimize the customized SPR instrument. The obtained Kd value (~13 µM), from SPR results, for Cyt c-hNgb molecular interactions is in general agreement with a previously published result. The SPR results also confirmed no significant impact of the internal disulfide bridge between Cys 46 and Cys 55 on hNgb binding to Cyt c. Using SPR, E. coli topoisomerase I enzyme turnover during plasmid DNA relaxation was found to be enhanced in the presence of Mg2+. In addition, a new theoretical approach of analyzing biphasic SPR data has been introduced based on analytical solutions of the biphasic rate equations. In order to develop a new label free method to quantitatively study protein-protein interactions, quartz nanopipettes were chemically modified. The derived Kd (~20 µM) value for the Cyt c-hNgb complex formations matched very well with SPR measurements (Kd ~16 µM). The finite element numerical simulation results were similar to the nanopipette experimental results. These results demonstrate that nanopipettes can potentially be used as a new class of a label-free analytical method to quantitatively characterize protein-protein interactions in attoliter sensing volumes, based on a charge sensing mechanism. Moreover, the molecule-based selective nature of hydrophobic and nanometer sized carbon nanotube (CNT) pores was observed. This result might be helpful to understand the selective nature of cellular transport through transmembrane protein pores.

AFM and SPR studies of protein adsorption at solid/liquid interface

Membrane-like structure formed by surfactant molecules of didodecyldimethylammonium bromide (DDAB) on both HOPG and gold electrodes were studied with AFM and SPR techniques. The study shows that the thickness of the adsorbed layer of DDAB is strongly dependent on the concentration of the vesicle solution. We have also investigated the adsorption of redox protein, Cytochrome c, on graphite electrode with in situ tapping mode AFM. The protein adsorbs spontaneously onto the electrode covered with an adsorbed phosphate layer and forms a uniform monolayer. The adsorbed protein exhibits a reversible electron transfer at 0.17 V (Ag/AgCI) once the electrode potential has been increased to 0.75V. Using surface plasmon resonance spectroscopy we have measured subtle conformational change in protein, Cyt c, due to electron transfer of a single electron on MPA-coated gold electrode. The electron transfer induced change in the resonant angle is about 0.006 deg., which corresponds to ~ 0.2 A decreases in the thickness. This is consistent with that reduced state is more compact than the oxidized state.

Experiment: Elevated temperature and PCO2 affect enzyme activities in differentially oxidative tissues of Notothenia rossii

Mitochondrial plasticity plays a central role in setting the capacity for acclimation of aerobic metabolism in ectotherms in response to environmental changes. We still lack a clear picture if and to what extent the energy metabolism and mitochondrial enzymes of Antarctic fish can compensate for changing temperatures or PCO2 and whether capacities for compensation differ between tissues. We therefore measured activities of key mitochondrial enzymes (citrate synthase (CS), cytochrome c oxidase (COX)) from heart, red muscle, white muscle and liver in the Antarctic fish Notothenia rossii after warm- (7 °C) and hypercapnia- (0.2 kPa CO2) acclimation vs. control conditions (1 °C, 0.04 kPa CO2). In heart, enzymes showed elevated activities after cold-hypercapnia acclimation, and a warm-acclimation-induced upward shift in thermal optima. The strongest increase in enzyme activities in response to hypercapnia occurred in red muscle. In white muscle, enzyme activities were temperature-compensated. CS activity in liver decreased after warm-normocapnia acclimation (temperature-compensation), while COX activities were lower after cold- and warm-hypercapnia exposure, but increased after warm-normocapnia acclimation. In conclusion, warm-acclimated N. rossii display low thermal compensation in response to rising energy demand in highly aerobic tissues, such as heart and red muscle. Chronic environmental hypercapnia elicits increased enzyme activities in these tissues, possibly to compensate for an elevated energy demand for acid-base regulation or a compromised mitochondrial metabolism, that is predicted to occur in response to hypercapnia exposure. This might be supported by enhanced metabolisation of liver energy stores. These patterns reflect a limited capacity of N. rossii to reorganise energy metabolism in response to rising temperature and PCO2.

Dysfonctions mitochondriales associées à l’acidose lactique du Saguenay-Lac-Saint-Jean révélées par l’étude d’un nouveau modèle murin de la maladie

Le syndrome de Leigh version canadienne-française (LSFC) est une maladie autosomale récessive causée par une mutation du gène LRPPRC, encodant une protéine du même nom. LRPPRC est impliquée dans la traduction des gènes mitochondriaux qui encodent certains complexes de la chaine respiratoire. Les répercussions biochimiques incluent un déficit tissu spécifique de la cytochrome c oxydase (COX), principalement dans le foie et le cerveau, et la survenue de crises d’acidose fatales chez 80 % des enfants atteints avant l’âge de 3-4 ans. L’identification d’options thérapeutiques demeure encore un défi de taille et ceci est en partie relié au manque de connaissances des fonctions biologiques de LRPPRC et des mécanismes impliqués dans la pathogenèse du LSFC, au niveau des dysfonctions mitochondriales résultantes. Afin d’étudier ces mécanismes, le consortium de l’acidose lactique, dont fait partie notre laboratoire, a récemment développé un modèle murin portant une ablation de LRPPRC spécifique au foie (souris H-Lrpprc-/-). L’objectif principal est de déterminer si ce modèle reproduit le phénotype pathologique observé dans les cultures de fibroblastes humains issus de biopsies de peau de patients LSFC. Dans le cadre des travaux de ce mémoire, nous avons amorcé la caractérisation de ce nouveau modèle, en examinant le phénotype général, l’histopathologie hépatique et les fonctions mitochondriales, et en nous focalisant principalement sur les fonctions respiratoires et la capacité à oxyder divers types de substrats. Nous avons observé un retard de croissance, une hépatomégalie ainsi que plusieurs anomalies histologiques du foie chez la souris HLrpprc-/-. De plus, l’ablation de LRPPRC induit un déficit du complexe IV, mais aussi de l’ATP synthase, et affecte l’oxydation des acides gras à longues chaines. À la lumière de ces résultats, nous croyons que le modèle murin H-Lrpprc-/- contribuera à l’avancement des connaissances générales sur LRPPRC, nous permettant de mieux comprendre l’influence de la protéine sur les fonctions mitochondriales.

Seawater carbonate chemistry, mass, length and gene expression of Sepia officinalis during experiments, 2011

The specific transporters involved in maintenance of blood pH homeostasis in cephalopod molluscs have not been identified to date. Using in situ hybridization and immuno histochemical methods, we demonstrate that Na+/K+-ATPase (soNKA), a V-type H+-ATPase (soV-HA), and Na+/HCO3- cotransporter (soNBC) are co-localized in NKA-rich cells in the gills of Sepia officinalis. mRNA expression patterns of these transporters and selected metabolic genes were examined in response to moderately elevated seawater pCO2 (0.16 and 0.35 kPa) over a time-course of six weeks in different ontogenetic stages. The applied CO2 concentrations are relevant for ocean acidification scenarios projected for the coming decades. We determined strong expression changes in late stage embryos and hatchlings, with one to three log2-fold reductions in soNKA, soNBCe, socCAII and COX. In contrast, no hypercapnia induced changes in mRNA expression were observed in juveniles during both short- and long-term exposure. However a transiently increased demand of ion regulatory demand was evident during the initial acclimation reaction to elevated seawater pCO2. Gill Na+/K+-ATPase activity and protein concentration were increased by approximately 15% in during short (2-11 day), but not long term (42 day) exposure. Our findings support the hypothesis that the energy budget of adult cephalopods is not significantly compromised during long-term exposure to moderate environmental hypercapnia. However, the down regulation of ion-regulatory and metabolic genes in late stage embryos, taken together with a significant reduction in somatic growth, indicates that cephalopod early life stages are challenged by elevated seawater pCO2.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

High glucose mediates prooxidant and antioxidant enzyme activities in coronary endothelial cells

Objective: Excess levels of free radicals such as nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2-)are associated with the pathogenesis of endothelial cell dysfunction in diabetes mellitus. This study was designed to investigate the underlying causes of oxidative stress in coronary microvascular endothelial cells (CMEC) exposed to hyperglycaemia. Methods: CMEC were cultured under normal (5.5 mmol/L) or high glucose (22 mmol/L)concentrations for 7 days. The activity and expression (protein level) of eNOS, iNOS, NAD(P)H oxidase and antioxidant enzymes, namely, superoxide dismutase (SOD), catalase and glutahione peroxidase (GPx) were investigated by specific activity assays and Western analyses,respectively while the effects of hyperglycaemia on nitrite and O2 - generation were investigated by Griess reaction and cytochrome C reduction assay, respectively. Results: Hyperglycaemia did not alter eNOS or iNOS protein expressions and overall nitrite generation, an index of NO production. However, it significantly reduced the levels of intracellular antioxidant glutathione by 50% (p<0.05) and increased the protein expressions and/or activities of p22-phox, a membrane-bound component of pro-oxidant NAD(P)H oxidase and antioxidant enzymes (p<0.05). Free radical-scavengers, namely, Tiron and MPG (0.1-1 mol/L) reduced hyperglycaemia-induced antioxidant enzyme activity and increased glutathione and nitrite generation to the levels observed in CMEC cultured in normoglycaemic medium (p<0.01). The differences in enzyme activity and expressions were independent of the increased osmolarity generated by high glucose levels as investigated by using equimolar concentrations of mannitol in parallel experiments. Conclusions: These results suggest that hyperglycaemia-induced oxidative stress may arise in CMEC as a result of enhanced prooxidant enzyme activity and diminished generation of 3 antioxidant glutathione. By increasing the antioxidant enzyme capacity CMEC may protect themselves against free radical-induced cell damage in diabetic conditions. The definitive version is available at http://www.blackwell-synergy.com

Projeto de aplicação de cuidados anestésicos na monitorização de situações clínicas de hipoperfusão orgânica

Apesar dos avanços na sua abordagem terapêutica, a hemorragia severa continua a ser a principal causa de morbilidade e mortalidade em animais vítimas de trauma ou sujeitos a intervenção cirúrgica. O aparecimento de lesões decorrentes, ou da morte consequente, deve-se ao deficit de volume de fluidos intravasculares e subsequente desenvolvimento do estado hipovolémico. Em termos fisiológicos, a consequência mais devastadora desta condição é a diminuição, absoluta ou relativa, da pré-carga cardíaca, resultando num baixo débito cardíaco, perfusão tecidular inadequada e diminuição do aporte de oxigénio aos tecidos, o qual compromete, inequivocamente, a função celular. O controlo da hipovolémia passa pela resolução da hemorragia e pela correção do deficit de volume intravascular causado e envolve, obrigatoriamente, o recurso à administração de fluidos intravenosos. A escolha do tipo de fluido mais adequado para a terapia intravenosa, em cada ocorrência, é uma tarefa que exige reflexão e ponderação. A seleção dos fluidos apropriados é da responsabilidade do médico veterinário, sendo, no entanto, fundamental que o enfermeiro veterinário detenha conhecimentos básicos sobre as diferenças entre os fluidos disponíveis para a fluidoterapia. O objetivo deste projeto é determinar qual o tipo de fluido mais adequado para ajudar a preservar a integridade e funcionalidade hepática, em situações de hipoperfusão, e assim ajudar a padronizar a sua escolha no momento da decisão pela fluidoterapia. Para atingir este objetivo recorreu-se ao modelo suíno, a fim de recrear a situação de hipoperfusão e posteriormente avaliar os efeitos de dois fluidos diferentes administrados na reposição volémica, o lactato de Ringer e hidroxietilamido 130/0,4. Os animais foram sujeitos a uma hemorragia controlada, após a qual foi reposta a volémia com os respetivos fluidos. Após esta reposição volémica os animais foram eutanaziados e foram obtidas amostras de vários órgãos, incluindo fígado, objeto do presente estudo, alvo de diversas técnicas histopatológicas, nomeadamente o estudo histopatológico de rotina, através de hematoxilina e eosina, e diversos métodos para deteção de eventos apoptóticos, incluindo citocromo c, TUNEL e M30.Após a avaliação exaustiva dos resultados obtidos através das técnicas realizadas, foi possível concluir que o lactato de Ringer confere uma maior proteção contra a lesão de reperfusão, quando comparado com o hidroxietilamido 130/0,4.

Soybean lunasin mediates colon carcinogenesis by inducing apoptosis and preventing outgrowth of metastasis

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. Various factors such as age, lifestyle and dietary patterns affect the risk of having CRC. Epidemiological studies showed a chemopreventive effect of soy consumption against CRC. However, which component(s) of soybean is associated with this reduced risk is not yet fully delineated. The objective of this research was to evaluate the anti-colon cancer potential of lunasin isolated from defatted soybean flour using in vitro and in vivo models of CRC. Lunasin was isolated from defatted soybean flour by a combination of different chromatographic and ultrafiltration techniques. The anti-colon cancer potential of lunasin was determined using different human colon cancer cell lines in vitro and a CRC liver metastasis model in vivo. Lunasin caused cytotoxicity to different human colon cancer cells with an IC50 value of 13.0, 21.6, 26.3 and 61.7 µM for KM12L4, RKO, HCT-116 and HT-29 human colon cancer cells, respectively. This cytotoxicity correlated with the expression of the α5 integrin on human colon cancer cells with a correlation coefficient of 0.78. The mechanism involved in the cytotoxic effect of lunasin was through cell cycle arrest and induction of the mitochondrial pathway of apoptosis. In KM12L4 human colon cancer cells, lunasin caused a G2/M phase arrest increasing the percentage of cells at G2/M phase from 12% (PBS-treated) to 24% (treated with 10 µM lunasin). This arrest was attributed to the capability of lunasin to increase the expression of cyclin dependent kinase inhibitors p21 and p27. At 10 µM, lunasin increased the expression of p21 and p27 in KM12L4 colon cancer cells by 2.2- and 2.3-fold, respectively. Flow cytometric analysis showed that lunasin at 10 µM increased the percentage of cells undergoing apoptosis from 13.6% to 24.7%. This is further supported by fluorescence microscopic analysis of KM12L4 cells treated with 10 µM lunasin showing chromatin condensation and DNA fragmentation. The mechanism involved is through modification of proteins involved in the mitochondrial pathway of apoptosis in KM12L4 cells as 10 µM lunasin reduced the expression of the anti-apoptotic Bcl-2 protein by 2-fold and increased the expression of the pro-apoptotic proteins Bax, cytochrome c and nuclear clusterin by 2.2-, 2.1- and 2.3- fold, respectively. This led to increased expression and activity of the executioner of apoptosis, caspase-3 by 1.8- and 2.3-fold, respectively. This pro-apoptotic property of lunasin can be attributed to its capability to internalize into the cytoplasm and nucleus of colon cancer cells 24 h and 72 h after treatment, respectively. In addition, lunasin mediated metastasis of colon cancer cells in vitro by inhibiting the focal adhesion kinase activation thereby reducing expression of extracellular regulated kinase and nuclear factor kappa B and finally inhibiting migration of colon cancer cells. In KM12L4 colon cancer cells, 10 µM lunasin resulted in the reduction of phosphorylation of focal adhesion kinase and extracellular regulated kinase by 2.5-fold, resulting in the reduced nuclear translocation of p50 and p65 NF-κB subunits by 3.8- and 1.4-fold, respectively. In an in vivo model of CRC liver metastasis, daily intraperitoneal administration of lunasin at 4 mg/kg body weight resulted in the inhibition of KM12L4 liver metastasis as shown by the reduction of the number of liver metastases from 28 (PBS-treated) to 14 (lunasin-treated, P = 0.047) and reduction in tumor burden as measured by liver weight/body weight from 0.13 (PBS-treated) to 0.10 (lunasin-treated, P = 0.039). Moreover, lunasin potentiated the anti-metastatic effect of the chemotherapeutic drug oxaliplatin given at 5 mg/kg body weight twice per week. Lunasin and oxaliplatin combination resulted in a more potent inhibition of outgrowth of KM12L4 cell metastases to the liver reducing the number of liver metastases by 6-fold and reducing the tumor burden in the liver by 3-fold when compared to PBS-treated group. This can be attributed by the capability of lunasin and oxaliplatin to reduce expression of proliferating cell nuclear antigen in liver-tumor tissue as measured by immunohistochemical staining. The results of this research for the first time demonstrated the anti-colon cancer potential of lunasin isolated from defatted soybean flour which might contribute to the chemopreventive effect of soybean in CRC as seen in different epidemiological studies. In conclusion, lunasin isolated from defatted soybean flour mediated colon carcinogenesis by inducing apoptosis and preventing outgrowth of metastasis. We suggest that the results of this research serve as a basis for further study on the chemopreventive effect of lunasin against CRC and a possible adjuvant role for lunasin in therapy of patients with metastatic CRC.

Atividades biológicas de xilana de sabugo de milho

The corn cob is an agricultural by-product still little used, this in part due to the low knowledge of the biotechnological potential of their molecules. Xylan from corn cobs (XSM) is a polysaccharide present in greater quantity in the structure of plant and its biotechnology potential is little known. This study aimed to the extraction, chemical characterization and evaluation of biological activities of xylan from corn cobs. To this end, corncobs were cleaned, cut, dried and crushed, resulting in flour. This was subjected to a methodology that combines the use of alkaline conditions with waves of ultrasound. After methanol precipitation, centrifugation and drying was obtained a yield of 40% (g/g flour). Chemical analysis indicated a high percentage of polysaccharides in the sample (60%) and low contamination by protein (0.4%) and phenolic compounds (> 0.01%). Analysis of monosaccharide composition indicated the presence of xylose:glucose:arabinose:galactose:mannose:glucuronic acid in a molar ratio 50:20:15:10:2.5:2.5. The presence of xylan in the sample was confirmed by nuclear magnetic resonance (¹H and ¹³C) and infrared spectroscopy (IR). Tests were conducted to evaluate the antioxidant potential of XSM. This showed a total antioxidant capacity of 48.45 EAA/g sample. However, did not show scavenging activity of superoxide and hydroxyl radical and also reducing power. But, showing a high capacity chelating iron ions with 70% with about 2 mg/mL. The ability to XSM to influence cell proliferation in culture was also evaluated. This polymer did not influence the proliferation of normal fibroblast cells (3T3), however, decreased the rate of proliferation of tumor cells (HeLa) in a dose-dependent, reaching an inhibition of about 50% with a concentration around 2 mg/mL. Analyzing proteins related to cell death, by immunoblotting, XSM increases the amount of Bax, Bcl-2 decrease, increase cytochrome c and AIF, and reduce pro-caspase-3, indicating the induction of cell death induced apoptosis dependent and independent of caspase. XSM did not show anticoagulant activity in the PT test. However, the test of activated partial thromboplastin time (aPTT), XSM increased clotting time at about 5 times with 600 μg of sample compared with the negative control. The presence of sulfate on the XSM was discarded by agarose gel electrophoresis and IR. After carboxyl-reduction of XSM the anticoagulant activity decreased dramatically. The data of this study demonstrate that XSM has potential as antioxidant, antiproliferative and anticoagulant compound. Future studies to characterize these activities of XSM will help to increase knowledge about this molecule extracted from corn and allow their use in functional foods, pharmaceuticals and chemical industries.

Dysfonctions mitochondriales associées à l’acidose lactique du Saguenay-Lac-Saint-Jean révélées par l’étude d’un nouveau modèle murin de la maladie

Le syndrome de Leigh version canadienne-française (LSFC) est une maladie autosomale récessive causée par une mutation du gène LRPPRC, encodant une protéine du même nom. LRPPRC est impliquée dans la traduction des gènes mitochondriaux qui encodent certains complexes de la chaine respiratoire. Les répercussions biochimiques incluent un déficit tissu spécifique de la cytochrome c oxydase (COX), principalement dans le foie et le cerveau, et la survenue de crises d’acidose fatales chez 80 % des enfants atteints avant l’âge de 3-4 ans. L’identification d’options thérapeutiques demeure encore un défi de taille et ceci est en partie relié au manque de connaissances des fonctions biologiques de LRPPRC et des mécanismes impliqués dans la pathogenèse du LSFC, au niveau des dysfonctions mitochondriales résultantes. Afin d’étudier ces mécanismes, le consortium de l’acidose lactique, dont fait partie notre laboratoire, a récemment développé un modèle murin portant une ablation de LRPPRC spécifique au foie (souris H-Lrpprc-/-). L’objectif principal est de déterminer si ce modèle reproduit le phénotype pathologique observé dans les cultures de fibroblastes humains issus de biopsies de peau de patients LSFC. Dans le cadre des travaux de ce mémoire, nous avons amorcé la caractérisation de ce nouveau modèle, en examinant le phénotype général, l’histopathologie hépatique et les fonctions mitochondriales, et en nous focalisant principalement sur les fonctions respiratoires et la capacité à oxyder divers types de substrats. Nous avons observé un retard de croissance, une hépatomégalie ainsi que plusieurs anomalies histologiques du foie chez la souris HLrpprc-/-. De plus, l’ablation de LRPPRC induit un déficit du complexe IV, mais aussi de l’ATP synthase, et affecte l’oxydation des acides gras à longues chaines. À la lumière de ces résultats, nous croyons que le modèle murin H-Lrpprc-/- contribuera à l’avancement des connaissances générales sur LRPPRC, nous permettant de mieux comprendre l’influence de la protéine sur les fonctions mitochondriales.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.