Étude et modélisation de la cinétique orale de l'amoxicilline chez le porcelet

Il est rapporté que la biodisponibilité orale de l’amoxicilline chez le porc est environ trois fois moindre que chez l’homme. Pour élucider les raisons de cette différence, la pharmacocinétique artérielle, veineuse porte et urinaire de cet antibiotique a été caractérisée à des doses intragastriques de 4 à 30 mg/kg et différents modèles compartimentaux physiologiques ont été conçus pour l’analyse des données. La biodisponibilité orale de l’amoxicilline est maximale à 4 mg/kg, avec une valeur moyenne de 52%. Les différences porto-systémiques de concentrations plasmatiques d’amoxicilline et la clairance urinaire ont permis de démontrer une augmentation de la clairance hépatique jusqu’à la dose de 30 mg/kg. Un modèle compartimental comprenant deux voies parallèles d’absorption (de type Michaelis- Menten d’accessibilité limitée dans le temps et d’ordre 1), deux compartiments de distribution (central et périphérique) deux voies d’élimination (excrétions urinaire et biliaire) est celui qui prédit le mieux les données observées. Ces résultats mettent en évidence le rôle prépondérant du transporteur saturable PepT1 dans l’absorption orale de l’amoxicilline administrée à faible dose, ainsi que l’importance croissante de l’absorption passive lors d’administration à forte dose.

Base moléculaire et rôle du courant potassique transitoire I(A) des interneurones de l'hippocampe chez le rongeur

Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire et l’apprentissage chez les mammifères sont incomplètement compris. Le rythme thêta de l’hippocampe constitue l’état « en ligne » de cette structure qui est cruciale pour la mémoire déclarative. Dans la région CA1 de l’hippocampe, les interneurones inhibiteurs LM/RAD démontrent des oscillations de potentiel membranaire (OPM) intrinsèques qui pourraient se révéler importantes pour la génération du rythme thêta. Des travaux préliminaires ont suggéré que le courant K+ I(A) pourrait être impliqué dans la génération de ces oscillations. Néanmoins, peu de choses sont connues au sujet de l’identité des sous-unités protéiques principales et auxiliaires qui soutiennent le courant I(A) ainsi que l’ampleur de la contribution fonctionnelle de ce courant K+ dans les interneurones. Ainsi, cette thèse de doctorat démontre que le courant I(A) soutient la génération des OPM dans les interneurones LM/RAD et que des protéines Kv4.3 forment des canaux qui contribuent à ce courant. De plus, elle approfondit les connaissances sur les mécanismes qui régissent les interactions entre les sous-unités principales de canaux Kv4.3 et les protéines accessoires KChIP1. Finalement, elle révèle que la protéine KChIP1 module le courant I(A)-Kv4.3 natif et la fréquence de décharge des potentiels d’action dans les interneurones. Nos travaux contribuent à l’avancement des connaissances dans le domaine de la modulation de l’excitabilité des interneurones inhibiteurs de l’hippocampe et permettent ainsi de mieux saisir les mécanismes qui soutiennent la fonction de l’hippocampe et possiblement la mémoire chez les mammifères.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.

Mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de l’acide polysialique (PSA) dans le néocortex visuel des souris durant la maturation des synapses GABAergiques

Le fonctionnement du cortex cérébral nécessite l’action coordonnée de deux des sous-types majeurs de neurones, soient les neurones à projections glutamatergiques et les interneurones GABAergiques. Les interneurones GABAergiques ne constituent que 20 à 30% des cellules corticales par rapport au grand nombre de neurones glutamatergiques. Leur rôle est toutefois prépondérant puisqu’ils modulent fortement la dynamique et la plasticité des réseaux néocorticaux. Il n’est donc pas surprenant que les altérations de développement des circuits GABAergiques soient associées à plusieurs maladies du cerveau, incluant l’épilepsie, le syndrome de Rett et la schizophrénie. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant le développement des circuits GABAergiques est une étape essentielle menant vers une meilleure compréhension de la façon dont les anormalités se produisent. Conséquemment, nous nous intéressons au rôle de l’acide polysialique (PSA) dans le développement des synapses GABAergiques. PSA est un homopolymère de chaînons polysialylés en α-2,8, et est exclusivement lié à la molécule d’adhésion aux cellules neuronales (NCAM) dans les cerveaux de mammifères. PSA est impliqué dans plusieurs processus développementaux, y compris la formation et la plasticité des synapses glutamatergiques, mais son rôle dans les réseaux GABAergiques reste à préciser. Les données générées dans le laboratoire du Dr. Di Cristo démontrent que PSA est fortement exprimé post- natalement dans le néocortex des rongeurs, que son abondance diminue au cours du développement, et, faits importants, que son expression dépend de l’activité visuelle i et est inversement corrélée à la maturation des synapses GABAergiques. La présente propose de caractériser les mécanismes moléculaires régulant l’expression de PSA dans le néocortex visuel de la souris. Les enzymes polysialyltransférases ST8SiaII (STX) et ST8SiaIV (PST) sont responsables de la formation de la chaîne de PSA sur NCAM. En contrôlant ainsi la quantité de PSA sur NCAM, ils influenceraient le développement des synapses GABAergiques. Mon projet consiste à déterminer comment l’expression des polysialyltransférases est régulée dans le néocortex visuel des souris durant la période post-natale; ces données sont à la fois inconnues, et cruciales. Nous utilisons un système de cultures organotypiques dont la maturation des synapses GABAergiques est comparable au modèle in vivo. L’analyse de l’expression génique par qPCR a démontré que l’expression des polysialyltransférases diminue au cours du développement; une baisse majeure corrélant avec l’ouverture des yeux chez la souris. Nous avons de plus illustré pour la première fois que l’expression de STX, et non celle de PST, est activité-dépendante, et que ce processus requiert l’activation du récepteur NMDA, une augmentation du niveau de calcium intracellulaire et la protéine kinase C (PKC). Ces données démontrent que STX est l’enzyme régulant préférentiellement le niveau de PSA sur NCAM au cours de la période post-natale dans le cortex visuel des souris. Des données préliminaires d’un second volet de notre investigation suggèrent que l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN pourraient également contribuer à la régulation de la transcription de cette enzyme durant le développement. Plus d’investigations seront toutefois nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. En somme, la connaissance des mécanismes par lesquels l’expression des ii polysialyltransférases est modulée est essentielle à la compréhension du processus de maturation des synapses GABAergiques. Ceci permettrait de moduler pharmacologiquement l’expression de ces enzymes; la sur-expression de STX et/ou PST pourrait produire une plus grande quantité de PSA, déstabiliser les synapses GABAergiques, et conséquemment, ré-induire la plasticité cérébrale.

Determination of viral load and integration status of HPV 16 in normal and LSIL exfoliated cervical cells

L’intégration du génome du virus papilloma humain (VPH) a été reconnu jusqu’`a récemment comme étant un événnement fréquent mais pourtant tardif dans la progression de la maladie du col de l’utérus. La perspective temporelle vient, pourtant, d’être mise au défi par la détection de formes intégrées de VPH dans les tissus normaux et dans les lésions prénéoplasiques. Notre objectif était de déterminer la charge virale de VPH-16 et son état physique dans une série de 220 échantillons provenant de cols uterins normaux et avec des lésions de bas-grade. La technique quantitative de PCR en temps réel, méthode Taqman, nous a permis de quantifier le nombre de copies des gènes E6, E2, et de la B-globine, permettant ainsi l’évaluation de la charge virale et le ratio de E6/E2 pour chaque spécimen. Le ratio E6/E2 de 1.2 ou plus était suggestif d’intégration. Par la suite, le site d’intégration du VPH dans le génome humain a été déterminé par la téchnique de RS-PCR. La charge virale moyenne était de 57.5±324.6 copies d'ADN par cellule et le ratio E6/E2 a évalué neuf échantillons avec des formes d’HPV intégrées. Ces intégrants ont été amplifiés par RS-PCR, suivi de séquençage, et l’homologie des amplicons a été déterminée par le programme BLAST de NCBI afin d’identifier les jonctions virales-humaines. On a réussi `a identifier les jonctions humaines-virales pour le contrôle positif, c'est-à-dire les cellules SiHa, pourtant nous n’avons pas detecté d’intégration par la technique de RS-PCR dans les échantillons de cellules cervicales exfoliées provenant de tissus normaux et de lésions de bas-grade. Le VPH-16 est rarement intégré dans les spécimens de jeunes patientes.

Estrogen withdrawal and liver fat accumulation : contribution of hepatic VLDL-TG production and effect of exercise training

L’accumulation de triglycérides (TG) dans les hépatocytes est caractéristique de la stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA). Cette dernière se produit dans diverses conditions dont le facteur commun est le métabolisme anormal des lipides. Le processus conduisant à l'accumulation des lipides dans le foie n’a pas encore été totalement élucidé. Toutefois, des lipides s'accumulent dans le foie lorsque les mécanismes qui favorisent leur exportation (oxydation et sécrétion) sont insuffisants par rapport aux mécanismes qui favorisent leur importation ou leur biosynthèse. De nos jours il est admis que la carence en œstrogènes est associée au développement de la stéatose hépatique. Bien que les résultats des études récentes révèlent l'implication des hormones ovariennes dans l'accumulation de lipides dans le foie, les mécanismes qui sous-tendent ce phénomène doivent encore être étudiés. En conséquence, les trois études présentées dans cette thèse ont été menées sur des rates ovariectomizées (Ovx), comme modèle animal de femmes post-ménopausées, pour étudier les effets du retrait des œstrogènes sur le métabolisme des lipides dans le foie, en considérant l'entraînement physique comme étant un élément positif pouvant contrecarrer ces effets. Il a été démontré que l'entraînement physique peut réduire l'accumulation de graisses dans le foie chez les rates Ovx. Dans la première étude, nous avons montré que chez les rates Ovx nourries à la diète riche en lipides (HF), les contenus de TG hépatiques étaient élevées (P < 0.01) comparativement aux rates Sham, 5 semaines après la chirurgie. Le changement de la diète HF par la diète standard (SD) chez les rates Sham a diminué l’accumulation de lipides dans le foie. Toutefois, chez les rates Ovx, 8 semaines après le changement de la HF par la SD le niveau de TG dans le foie était maintenu aussi élevé que chez les rates nourries continuellement avec la diète HF. Lorsque les TG hépatiques mesurés à la 13e semaine ont été comparés aux valeurs correspondant au retrait initial de la diète HF effectué à la 5e semaine, les niveaux de TG hépatiques chez les animaux Ovx ont été maintenus, indépendamment du changement du régime alimentaire; tandis que chez les rats Sham le passage à la SD a réduit (P < 0.05) les TG dans le foie. Les mêmes comparaisons avec la concentration des TG plasmatiques ont révélé une relation inverse. Ces résultats suggèrent que la résorption des lipides au foie est contrée par l'absence des œstrogènes. Dans cette continuité, nous avons utilisé une approche physiologique dans notre seconde étude pour investiguer la façon dont la carence en œstrogènes entraîne l’accumulation de graisses dans le foie, en nous focalisant sur la voie de l'exportation des lipides du foie. Les résultats de cette étude ont révélé que le retrait des œstrogènes a entraîné une augmentation (P < 0.01) de l’accumulation de lipides dans le foie en concomitance avec la baisse (P < 0.01) de production de VLDL-TG et une réduction l'ARNm et de la teneur en protéines microsomales de transfert des triglycérides (MTP). Tous ces effets ont été corrigés par la supplémentation en œstrogènes chez les rates Ovx. En outre, l'entraînement physique chez les rates Ovx a entraîné une réduction (P < 0.01) de l’accumulation de lipides dans le foie ainsi qu’une diminution (P < 0.01) de production de VLDL-TG accompagnée de celle de l'expression des gènes MTP et DGAT-2 (diacylglycérol acyltransférase-2). Des études récentes suggèrent que le peptide natriurétique auriculaire (ANP) devrait être au centre des intérêts des recherches sur les métabolismes énergétiques et lipidiques. Le ANP est relâché dans le plasma par les cellules cardiaques lorsque stimulée par l’oxytocine et exerce ses fonctions en se liant à son récepteur, le guanylyl cyclase-A (GC-A). En conséquence, dans la troisième étude, nous avons étudié les effets du blocage du système ocytocine-peptide natriurétique auriculaire (OT-ANP) en utilisant un antagoniste de l’ocytocine (OTA), sur l'expression des gènes guanylyl cyclase-A et certains marqueurs de l’inflammation dans le foie de rates Ovx. Nous avons observé une diminution (P < 0.05) de l’ARNm de la GC-A chez les rates Ovx et Sham sédentaires traitées avec l’OTA, tandis qu’une augmentation (P < 0.05) de l'expression de l’ARNm de la protéine C-réactive (CRP) hépatique a été notée chez ces animaux. L’exercice physique n'a apporté aucun changement sur l'expression hépatique de ces gènes que ce soit chez les rates Ovx ou Sham traitées avec l’OTA. En résumé, pour expliquer l’observation selon laquelle l’accumulation et la résorption de lipides dans le foie dépendent des mécanismes associés à des niveaux d’œstrogènes, nos résultats suggèrent que la diminution de production de VLDL-TG induite par une déficience en œstrogènes, pourrait être un des mecanismes responsables de l’accumulation de lipides dans le foie. L’exercice physique quant à lui diminue l'infiltration de lipides dans le foie ainsi que la production de VLDL-TG indépendamment des niveaux d'œstrogènes. En outre, l'expression des récepteurs de l’ANP a diminué par l'OTA chez les rates Ovx et Sham suggérant une action indirecte de l’ocytocine (OT) au niveau du foie indépendamment de la présence ou non des estrogènes. L’axe ocytocine-peptide natriurétique auriculaire, dans des conditions physiologiques normales, protègerait le foie contre l'inflammation à travers la modulation de l’expression de la GC-A.

Développement de procédés efficaces pour la construction et la production de vecteurs adénoviraux

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum.

Statistical potentials for evolutionary studies

Les séquences protéiques naturelles sont le résultat net de l’interaction entre les mécanismes de mutation, de sélection naturelle et de dérive stochastique au cours des temps évolutifs. Les modèles probabilistes d’évolution moléculaire qui tiennent compte de ces différents facteurs ont été substantiellement améliorés au cours des dernières années. En particulier, ont été proposés des modèles incorporant explicitement la structure des protéines et les interdépendances entre sites, ainsi que les outils statistiques pour évaluer la performance de ces modèles. Toutefois, en dépit des avancées significatives dans cette direction, seules des représentations très simplifiées de la structure protéique ont été utilisées jusqu’à présent. Dans ce contexte, le sujet général de cette thèse est la modélisation de la structure tridimensionnelle des protéines, en tenant compte des limitations pratiques imposées par l’utilisation de méthodes phylogénétiques très gourmandes en temps de calcul. Dans un premier temps, une méthode statistique générale est présentée, visant à optimiser les paramètres d’un potentiel statistique (qui est une pseudo-énergie mesurant la compatibilité séquence-structure). La forme fonctionnelle du potentiel est par la suite raffinée, en augmentant le niveau de détails dans la description structurale sans alourdir les coûts computationnels. Plusieurs éléments structuraux sont explorés : interactions entre pairs de résidus, accessibilité au solvant, conformation de la chaîne principale et flexibilité. Les potentiels sont ensuite inclus dans un modèle d’évolution et leur performance est évaluée en termes d’ajustement statistique à des données réelles, et contrastée avec des modèles d’évolution standards. Finalement, le nouveau modèle structurellement contraint ainsi obtenu est utilisé pour mieux comprendre les relations entre niveau d’expression des gènes et sélection et conservation de leur séquence protéique.

Pathogenèse moléculaire de la neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

Growth factor activation of ErbB2/ErbB3 signaling pathways regulate the activity of Estrogen Receptors (ER)

La signalisation par l’estrogène a longtemps été considérée comme jouant un rôle critique dans le développement et la progression des cancers hormono-dépendants tel que le cancer du sein. Deux tiers des cancers du sein expriment le récepteur des estrogènes (ER) qui constitue un élément indiscutable dans cette pathologie. L’acquisition d’une résistance endocrinienne est cependant un obstacle majeur au traitement de cette forme de cancer. L’émergence de cancers hormono-indépendants peut est produite par l’activation de ER en absence d’estrogène, l’hypersensibilité du récepteur aux faibles concentrations plasmique d’estrogène ainsi que l’activation de ER par des modulateurs sélectifs. L’activité du ER est fortement influencée par l’environnement cellulaire tel que l’activation de voie de signalisation des facteurs de croissances, la disponibilité de protéines co-régulatrices et des séquences promotrices ciblées. Présentement, les études ont principalement considérées le rôle de ERα, cependant avec la découverte de ERβ, notre compréhension de la diversité des mécanismes potentiels impliquant des réponses ER-dépendantes s’est améliorée. L’activation des voies des kinases par les facteurs de croissance entraîne le développement d’un phénotype tumoral résistant aux traitements actuels. Nos connaissances des voies impliquées dans l’activation de ER sont restreintes. ERα est considéré comme le sous-type dominant et corrèle avec la plupart des facteurs de pronostic dans le cancer du sein. Le rôle de ERβ reste imprécis. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre l’implication de ERβ dans la prolifération cellulaire par l’étude du comportement de ERβ et ERα suite à l’activation des voies de signalisation par les facteurs de croissance. Nous démontrons que l’activation des récepteurs de surfaces de la famille ErbB, spécifiquement ErbB2/ErbB3, inhibe l’activité transcriptionnelle de ERβ, malgré la présence du coactivateur CBP, tout en activant ERα. De plus, l’inhibition de ERβ est attribuée à un résidu sérine (Ser-255) situé dans la région charnière, absente dans ERα. Des études supplémentaires de ErbB2/ErbB3 ont révélé qu’ils activent la voie PI3K/Akt ciblant à son tour la Ser-255. En effet, cette phosphorylation de ERβ par PI3K/Akt induit une augmentation de l’ubiquitination du récepteur qui promeut sa dégradation par le système ubiquitine-protéasome. Cette dégradation est spécifique pour ERβ. De façon intéressante, la dégradation par le protéasome requiert la présence du coactivateur CBP normalement requis pour l’activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires. Malgré le fait que l’activation de la voie PI3K/Akt corrèle avec une diminution de l’expression des gènes sous le contrôle de ERβ, on observe une augmentation de la prolifération des cellules cancéreuses. L’inhibition de la dégradation de ERβ réduit cette prolifération excessive causée par le traitement avec Hrgβ1, un ligand de ErbB3. Un nombre croissant d’évidences indique que les voies de signalisations des facteurs de croissance peuvent sélectivement réguler l’activité transcriptionnelle de sous-types de ER. De plus, le ratio ERα/ERβ dans les cancers du sein devient un outil de diagnostique populaire afin de déterminer la sévérité d’une tumeur. En conclusion, la caractérisation moléculaire du couplage entre la signalisation des facteurs de croissance et la fonction des ERs permettra le développement de nouveaux traitements afin de limiter l’apparition de cellules tumorales résistantes aux thérapies endocriniennes actuelles.

Dynamique de la biodiversité dans la Serra do Itajaí, Brésil : une approche bioacoustique de la conservation

Le suivi des populations animales et végétales nous a amené à constater une perte importante de la diversité biologique. Les objectifs de la Convention sur la diversité biologique à atteindre pour 2010 sous-tendent la poursuite détaillée de ce suivi à l’échelle mondiale (CBD 2000). Cependant, il est difficile d’avoir une perception d’ensemble de la biodiversité d’un territoire, car les écosystèmes sont des entités dynamiques et évolutives, dans l’espace et dans le temps. Le choix d’un indicateur relevant de l’ensemble des ces caractéristiques devient donc primordial, bien qu’il s’agisse d’une tâche laborieuse. Ce projet propose d’utiliser la bioacoustique comme indicateur environnemental pour faire le suivi des espèces animales en milieu tropical. Afin de faire un suivi à une échelle régionale de la biodiversité, et ce, dans l’un des biomes les plus menacés de la planète, soit celui de la Mata Atlântica brésilienne, ce projet de recherche a comme objectif général de démontrer qu’il est possible d’associer la biophonie (événements sonores), à des événements biologiques (la richesse spécifique animale) en quantifiant des événements sonores (à l’aide des chants produits par les oiseaux, les insectes chanteurs de même que par les anoures) et en tentant de les associer aux fluctuations de la biodiversité. En plus de répondre à cet objectif général, trois objectifs spécifiques ont été définis : 1) comparer la biophonie et l’anthropophonie de milieux soumis à différents niveaux d’anthropisation ou de conservation afin d’évaluer l’impact anthropique sur le milieu, 2) évaluer la variabilité spatiale de la biodiversité, de même que 3) sa variabilité temporelle. Les résultats ont démontré que la biophonie est représentative de la biodiversité d’un milieu, et ce, même dans des conditions de biodiversité maximale puisqu’il existe une très forte relation entre les deux variables. De plus, les résultats révèlent une différence significative dans le ratio anthropophonie/biophonie de milieux soumis à différents niveaux de protection du territoire. La différenciation d’indices de puissance relative (dB/kHz) nous indique également l’importance de la variabilité spatiale et temporelle de la biodiversité, et par conséquent, l’importance de faire le suivi des espèces dans divers milieux et à diverses périodes afin d’obtenir une vision adéquate de la biodiversité régionale.

Mécanismes de subversion de l'immunité innée par le virus de l'Hépatite C (VHC)

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés.

Étude de la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus dans la noirceur

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.