Krüppel-associated box-mediated repression of RNA polymerase II promoters is influenced by the arrangement of basal promoter elements.

The evolutionarily conserved Krüppel-associated box (KRAB) is present in the N-terminal regions of more than one-third of all Krüppel-class zinc finger proteins. Recent experiments have demonstrated that the KRAB-A domain tethered to a promoter DNA by connecting to heterologous DNA-binding protein domain or targeted to a promoter-proximal RNA sequence acts as a transcriptional silencing of RNA polymerase II promoters. Here we show that expression of KRAB domain suppresses in vivo the activating function of various defined activating transcription factors, and we demonstrate that the KRAB domain specifically silences the activity of promoters whose initiation is dependent on the presence of a TATA box. Promoters whose accurate transcription initiation is directed by a pyrimidine-rich initiator element, however, are relatively unaffected. We also report in vitro transcription experiments indicating that the KRAB domain is able to repress both activated and basal promoter activity. Thus, the KRAB domain appears to repress the activity of certain promoters through direct communication with TATA box-dependent basal transcription machinery.

Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis.

Resting epidermal keratinocytes contain large amounts of interleukin 1 (IL-1), but the function of this cytokine in the skin remains unclear. To further define the role of IL-1 in cutaneous biology, we have generated two lines of transgenic mice (TgIL-1.1 and TgIL-1.2) which overexpress IL-1 alpha in basal keratinocytes. There was high-level tissue-specific expression of transgene mRNA and protein and large quantities of IL-1 alpha were liberated into the circulation from epidermis in both lines. TgIL-1.1 mice, which had the highest level of transgene expression, developed a spontaneous skin disease characterized by hair loss, scaling, and focal inflammatory skin lesions. Histologically, nonlesional skin of these animals was characterized by hyperkeratosis and a dermal mononuclear cell infiltrate of macrophage/monocyte lineage. Inflammatory lesions were marked by a mixed cellular infiltrate, acanthosis, and, in some cases, parakeratosis. These findings confirm the concept of IL-1 as a primary cytokine, release of which is able to initiate and localize an inflammatory reaction. Furthermore, these mice provide the first definitive evidence that inflammatory mediators can be released from the epidermis to enter the systemic circulation and thereby influence, in a paracrine or endocrine fashion, a wide variety of other cell types.

Nitric oxide inhibits the release of norepinephrine and dopamine from the medial basal hypothalamus of the rat.

Previous research indicates that norepinephrine and dopamine stimulate release of luteinizing hormone (LH)-releasing hormone (LHRH), which then reaches the adenohypophysis via the hypophyseal portal vessels to release LH. Norepinephrine exerts its effect via alpha 1-adrenergic receptors, which stimulate the release of nitric oxide (NO) from nitricoxidergic (NOergic) neurons in the medial basal hypothalamus (MBH). The NO activates guanylate cyclase and cyclooxygenase, thereby inducing release of LHRH into the hypophyseal portal vessels. We tested the hypothesis that these two catecholamines modulate NO release by local feedback. MBH explants were incubated in the presence of sodium nitroprusside (NP), a releaser of NO, and the effect on release of catecholamines was determined. NP inhibited release of norepinephrine. Basal release was increased by incubation of the tissue with the NO scavenger hemoglobin (20 micrograms/ml). Hemoglobin also blocked the inhibitory effect of NP. In the presence of high-potassium (40 mM) medium to depolarize cell membranes, norepinephrine release was increased by a factor of 3, and this was significantly inhibited by NP. Hemoglobin again produced a further increase in norepinephrine release and also blocked the action of NP. When constitutive NO synthase was inhibited by the competitive inhibitor NG-monomethyl-L-arginine (NMMA) at 300 microM, basal release of norepinephrine was increased, as was potassium-evoked release, and this was associated in the latter instance with a decrease in tissue concentration, presumably because synthesis did not keep up with the increased release in the presence of NMMA. The results were very similar with dopamine, except that reduction of potassium-evoked dopamine release by NP was not significant. However, the increase following incubation with hemoglobin was significant, and hemoglobin, when incubated with NP, caused a significant elevation in dopamine release above that with NP alone. In this case, NP increased tissue concentration of dopamine along with inhibiting release, suggesting that synthesis continued, thereby raising the tissue concentration in the face of diminished release. When the tissue was incubated with NP plus hemoglobin, which caused an increase in release above that obtained with NP alone, the tissue concentration decreased significantly compared with that in the absence of hemoglobin, indicating that, with increased release, release exceeded synthesis, causing a fall in tissue concentration. When NO synthase was blocked by NMMA, the release of dopamine, under either basal or potassium-evoked conditions, was increased. Again, in the latter instance the tissue concentration declined significantly, presumably because synthesis did not match release. Therefore, the results were very similar with both catecholamines and indicate that NO acts to suppress release of both amines. Since both catecholamines activate the release of LHRH, the inhibition of their release by NO serves as an ultra-short-loop negative feedback by which NO inhibits the release of the catecholamines, thereby reducing the activation of the NOergic neurons and decreasing the release of LHRH. This may be an important means for terminating the pulses of release of LHRH, which generate the pulsatile release of LH that stimulates gonadal function in both male and female mammals.

Basal expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene is dependent on protein kinase A activity.

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) functions as a Cl- channel that becomes activated after phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase (PKA). We demonstrate that PKA also plays a crucial role in maintaining basal expression of the CFTR gene in the human colon carcinoma cell line T84. Inhibition of PKA activity by expression of a dominant-negative regulatory subunit or treatment with the PKA-selective inhibitor N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H-89) caused a complete suppression of CFTR gene expression without affecting other constitutively active genes. Basal expression of a 2.2-kb region of the CFTR promoter linked to a luciferase reporter gene (CFTR-luc) exhibited the same dependence on PKA. The ability of cAMP to induce CFTR over basal levels is cell-type specific. In T84 cells, both the endogenous CFTR gene and CFTR-luc exhibited only a modest inducibility (approximately 2-fold), whereas in the human choriocarcinoma cell line JEG-3, CFTR-luc could be induced at least 4-fold. A variant cAMP-response element is present at position -48 to -41 in the CFTR promoter, and mutation of this sequence blocks basal expression. We conclude that cAMP, acting through PKA, is an essential regulator of basal CFTR gene expression and may mediate an induction of CFTR in responsive cell types.

Basal body-associated DNA: in situ studies in Chlamydomonas reinhardtii.

We have explored the localization of the uni chromosome (LG XIX) of Chlamydomonas reinhardtii using the technique of in situ hybridization. Using standardized methods of cell fixation together with large chromosome-specific probes we have studied the position of uni DNA sequences in metaphase and interphase cells. We find that in dividing cells uni probes identify a condensed metaphase chromosome that shows no specialized orientation. In interphase cells uni hybridization signals occur on the anterior edge of the nucleus at a position where basal bodies are normally associated with the nuclear envelope. These data reveal an underlying spatial organization of uni chromosomal DNA within the interphase nucleus that may be significant in terms of the fact that this chromosome encodes numerous functions affecting basal body and flagellar assembly.

A kinase-deficient transcription factor TFIIH is functional in basal and activated transcription.

Phosphorylation of the carboxyl-terminal domain (CTD) of the large subunit of RNA polymerase II has been suggested to be critical for transcription initiation, activation, or elongation. A kinase activity specific for CTD is a component of the general transcription factor TFIIH. Recently, a cyclin-dependent kinase-activator kinase (MO15 and cyclin H) was found to be associated with TFIIH preparations and was suggested to be the CTD kinase. TFIIH preparations containing mutant, kinase-deficient MO15 lack CTD kinase activity, indicating that MO15 is critical for polymerase phosphorylation. Nonetheless, these mutant TFIIH preparations were fully functional (in vitro) in both basal and activated transcription. These results indicate that CTD phosphorylation is not required for transcription with a highly purified system.

Human general transcription factor TFIIA: characterization of a cDNA encoding the small subunit and requirement for basal and activated transcription.

The human general transcription factor TFIIA is one of several factors involved in specific transcription by RNA polymerase II, possibly by regulating the activity of the TATA-binding subunit (TBP) of TFIID. TFIIA purified from HeLa extracts consists of 35-, 19-, and 12-kDa subunits. Here we describe the isolation of a cDNA clone (hTFIIA gamma) encoding the 12-kDa subunit. Using expression constructs derived from hTFIIA gamma and TFIIA alpha/beta (which encodes a 55-kDa precursor to the alpha and beta subunits of natural TFIIA), we have constructed a synthetic TFIIA with a polypeptide composition similar to that of natural TFIIA. The recombinant complex supports the formation of a DNA-TBP-TFIIA complex and mediates both basal and Gal4-VP16-activated transcription by RNA polymerase II in TFIIA-depleted nuclear extracts. In contrast, TFIIA has no effect on tRNA and 5S RNA transcription by RNA polymerase III in this system. We also present evidence that both the p55 and p12 recombinant subunits interact with TBP and that the basic region of TBP is critical for the TFIIA-dependent function of TBP in nuclear extracts.

Análise da microbiota intestinal em adultos com hábitos alimentares distintos e de associações com a inflamação e resistência à insulina

Introdução: A microbiota intestinal possui grande diversidade de bactérias, predominantemente dos filos Bacteroidetes e Firmicutes, com múltiplas funções. A alimentação pode alterar sua composição e função. Alto teor de gordura saturada altera a permeabilidade intestinal, eleva os lipopolissacarídeos e predispõe à inflamação subclínica crônica. Dieta rica em fibras, como a vegetariana, induz elevação de ácidos graxos de cadeia curta e benefícios metabólicos. Objetivos: Para analisar a composição da microbiota intestinal de adventistas com diferentes hábitos alimentares e associá-los à inflamação subclínica e resistência à insulina, esta tese incluiu: 1) revisão dos mecanismos que associam a alimentação à microbiota intestinal e ao risco cardiometabólico; 2) verificação da composição da microbiota intestinal segundo diferentes hábitos alimentares e de associações com biomarcadores de doenças cardiometabólicas; 3) avaliação da associação entre a abundância de Akkermansia muciniphila e o metabolismo da glicose; 4) análise da presença de enterótipos e de associações com características clínicas. Métodos: Este estudo transversal incluiu 295 adventistas estratificados segundo hábitos alimentares (vegetariano estrito, ovo-lacto-vegetariano e onívoro). Foram avaliadas associações com dados clínicos, bioquímicos e inflamatórios. O perfil da microbiota foi obtido por sequenciamento do gene 16S rRNA (Illumina® Miseq). Resultados: 1) Há evidências de que as relações entre dieta, inflamação, resistência à insulina e risco cardiometabólico são em parte mediadas pela composição da microbiota intestinal. 2) Vegetarianos apresentaram melhor perfil clínico quando comparados aos onívoros. Confirmou-se maior abundância de Firmicutes e Bacteroidetes, que não diferiram segundo a adiposidade corporal. Entretanto, vegetarianos estritos apresentaram mais Bacteroidetes, menos Firmicutes e maior abundância do gênero Prevotella quando comparados aos outros dois grupos de hábitos alimentares. Entre os ovo-lactovegetarianos verificou-se maior proporção de Firmicutes especialmente do gênero Faecalibacterium. Nos onívoros, houve super-representação do filo Proteobacteria (Succinivibrio e Halomonas) comparados aos vegetarianos. 3) Indivíduos normoglicêmicos apresentaram maior abundância de Akkermansia muciniphila que aqueles com glicemia alterada. A abundância desta bactéria correlacionou-se inversamente à glicemia e hemoglobina glicosilada. 4) Foram identificados três enterótipos (Bacteroides, Prevotella e Ruminococcaceae), similares àqueles previamente descritos. As concentrações de LDL-C foram menores no enterótipo 2, no qual houve maior frequência de vegetarianos estritos. Discussão: 1) Conhecimentos sobre participação da microbiota na fisiopatologia de doenças poderão reverter em estratégias para manipulá-la para promover saúde. 2) Apoia-se a hipótese de que hábitos alimentares se associam favorável ou desfavoravelmente a características metabólicas e inflamatórias do hospedeiro via alterações na composição da microbiota intestinal. Sugerimos que a exposição a alimentos de origem animal possa impactar negativamente nas proporções de comunidades bacterianas. 3) Sugerimos que a abundância da Akkermansia muciniphila possa participar do metabolismo da glicose. 4) Reforçamos que a existência de três enterótipos não deva ser específica de certas populações/continentes. Apesar de desconhecido o significado biológico destes agrupamentos, as correlações com o perfil lipídico podem sugerir sua utilidade na avaliação do risco cardiometabólico. Conclusões: Nossos achados fortalecem a ideia de que a composição da microbiota intestinal se altera mediante diferentes hábitos alimentares, que, por sua vez, estão associados a alterações nos perfis metabólicos e inflamatórios. Estudos prospectivos deverão investigar o potencial da dieta na prevenção de distúrbios cardiometabólicos mediados pela microbiota.

Efeito dos ácidos graxos ômega-3, ômega-6 e ômega-9 sobre o risco cardiovascular de indivíduos adultos: estudo clínico de prevenção primária.

INTRODUÇÃO: As doenças cardiovasculares (DCV) são a principal causa de morte no mundo, sendo muitos dos fatores de risco passíveis de prevenção e controle. Embora as DCV sejam complexas em sua etiologia e desenvolvimento, a concentração elevada de LDL-c e baixa de HDL-c constituem os fatores de risco modificáveis mais monitorados na prática clínica, embora não sejam capazes de explicar todos os eventos cardiovasculares. Portanto, investigar como intervenções farmacológicas e nutricionais podem modular parâmetros oxidativos, físicos e estruturais das lipoproteínas pode fornecer estimativa adicional ao risco cardiovascular. Dentre os diversos nutrientes e compostos bioativos relacionados às DCV, os lipídeos representam os mais investigados e descritos na literatura. Nesse contexto, os ácidos graxos insaturados (ômega-3, ômega-6 e ômega-9) têm sido foco de inúmeros estudos. OBJETIVOS: Avaliar o efeito da suplementação com ômega-3, ômega-6 e ômega-9 sobre os parâmetros cardiometabólicos em indivíduos adultos com múltiplos fatores de risco e sem evento cardiovascular prévio. MATERIAL E MÉTODOS: Estudo clínico, randomizado, duplo-cego, baseado em intervenção nutricional (3,0 g/dia de ácidos graxos) sob a fórmula de cápsulas contendo: ômega-3 (37 por cento de EPA e 23 por cento de DHA) ou ômega-6 (65 por cento de ácido linoleico) ou ômega-9 (72 por cento de ácido oleico). A amostra foi composta por indivíduos de ambos os sexos, com idade entre 30 e 74 anos, apresentando pelo menos um dos seguintes fatores de risco: Dislipidemia, Diabetes Mellitus, Obesidade e Hipertensão Arterial Sistêmica. Após aprovação do Comitê de Ética, os indivíduos foram distribuídos nos três grupos de intervenção. No momento basal, os indivíduos foram caracterizados quanto aos aspectos demográficos (sexo, idade e etnia) e clínicos (medicamentos, doenças atuais e antecedentes familiares). Nos momentos basal e após 8 semanas de intervenção, amostras de sangue foram coletadas após 12h de jejum. A partir do plasma foram analisados: perfil lipídico (CT, LDL-c, HDL-c, TG), apolipoproteínas AI e B, ácidos graxos não esterificados, atividade da PON1, LDL(-) e auto-anticorpos, ácidos graxos, glicose, insulina, tamanho e distribuição percentual da LDL (7 subfrações e fenótipo A e não-A) e HDL (10 subfrações). O efeito do tempo, da intervenção e associações entre os ácidos graxos e aspectos qualitativos das lipoproteínas foram testados (SPSS versão 20.0, p <0,05). RESULTADOS: Uma primeira análise dos resultados baseada em um corte transversal demonstrou, por meio da análise de tendência linear ajustada pelo nível de risco cardiovascular, que o maior tercil plasmático de DHA se associou positivamente com HDL-c, HDLGRANDE e tamanho de LDL e negativamente com HDLPEQUENA e TG. Observou-se também que o maior tercil plasmático de ácido linoleico se associou positivamente com HDLGRANDE e tamanho de LDL e negativamente com HDLPEQUENA e TG. Esse perfil de associação não foi observado quando foram avaliados os parâmetros dietéticos. Avaliando uma subamostra que incluiu indivíduos tabagistas suplementados com ômega-6 e ômega-3, observou-se que ômega-3 modificou positivamente o perfil lipídico e as subfrações da HDL. Nos modelos de regressão linear ajustados pela idade, sexo e hipertensão, o DHA plasmático apresentou associações negativas com a HDLPEQUENA. Quando se avaliou exclusivamente o efeito do ômega-3 em indivíduos tabagistas e não tabagistas, observou-se que fumantes, do sexo masculino, acima de 60 anos de idade, apresentando baixo percentual plasmático de EPA e DHA (<8 por cento ), com excesso de peso e gordura corporal elevada, apresentam maior probabilidade de ter um perfil de subfrações de HDL mais aterogênicas. Tendo por base os resultados acima, foi comparado o efeito do ômega-3, ômega-6 e ômega-9 sobre os parâmetros cardiometabólicos. O ômega-3 promoveu redução no TG, aumento do percentual de HDLGRANDE e redução de HDLPEQUENA. O papel cardioprotetor do ômega-3 foi reforçado pelo aumento na incorporação de EPA e DHA, no qual indivíduos com EPA e DHA acima de 8 por cento apresentaram maior probabilidade de ter HDLGRANDE e menor de ter HDLPEQUENA. Em adição, observou-se também que o elevado percentual plasmático de ômega-9 se associou com partículas de LDL menos aterogênicas (fenótipo A). CONCLUSÃO: Ácidos graxos plasmáticos, mas não dietéticos, se correlacionam com parâmetros cardiometabólicos. A suplementação com ômega-3, presente no óleo de peixe, promoveu redução no TG e melhoria nos parâmetros qualitativos da HDL (mais HDLGRANDE e menos HDLPEQUENA). Os benefícios do ômega-3 foram particularmente relevantes nos indivíduos tabagistas e naqueles com menor conteúdo basal de EPA e DHA plasmáticos. Observou-se ainda que o ômega-9 plasmático, presente no azeite de oliva, exerceu impacto positivo no tamanho e subfrações da LDL.

Regeneração hepática em animais jovens com estenose da veia porta ou ligadura da artéria hepática: estudos histológicos, moleculares e avaliação dos efeitos da insulina e do tacrolimus como agentes regenerativos

INTRODUÇÃO: O transplante hepático é o único tratamento efetivo para uma variedade de doenças hepáticas irreversíveis. No entanto, o número limitado de doadores pediátricos leva ao uso de enxertos hepáticos de doadores adultos, com necessidade de anastomoses vasculares mais complexas. Essas anastomoses tornam-se complicadas pela diferença no calibre dos vasos entre o doador e o receptor, resultando em alterações do fluxo sanguíneo, estenose da anastomose venosa ou arterial e trombose. Os efeitos para regeneração hepática decorrentes da privação do fluxo sanguíneo pela veia porta ou pela artéria hepática não estão completamente elucidados. Experimentalmente, quando um lobo do fígado não recebe o fluxo venoso portal, é observada atrofia deste segmento e hipertrofia do restante do órgão perfundido. Embora existam vários modelos experimentais para estudo da regeneração hepática, poucos são focados em animais em crescimento. Além disso, os efeitos regenerativos de drogas como o tacrolimus e a insulina precisam ser pesquisados, com o objetivo de encontrar um tratamento ideal para a insuficiência hepática ou um método de estimular a regeneração do fígado após ressecções ou transplantes parciais. O objetivo do presente estudo é descrever modelos de regeneração hepática em ratos em crescimento com: 1) ausência de fluxo hepático arterial e 2) redução do fluxo portal. Adicionalmente, o estudo avalia o efeito pró-regenerativo do tacrolimus e da insulina nesses modelos descritos. MÉTODOS: cento e vinte ratos (entre 50 e 100g de peso) foram divididos em 6 grupos, de acordo com o tipo de intervenção cirúrgica: Grupo 1, incisão abdominal sem intervenção hepática; Grupo 2, hepatectomia a 70%; Grupo 3, hepatectomia a 70% + estenose de veia porta; Grupo 4, hepatectomia a 70% + ligadura da artéria hepática; Grupo 5, hepatectomia a 70% + estenose de veia porta + insulina; Grupo 6, hepatectomia a 70% + estenose de veia porta + tacrolimus. Os animais dos grupos 1 ao 4 foram subdivididos em 5 subgrupos de acordo com o momento da morte: 1, 2, 3, 5 e 10 dias após a intervenção cirúrgica. Os animais dos grupos 5 e 6 foram subdividos em 2 subgrupos de acordo com o momento da morte: 2 e 10 dias após a intervenção cirúrgica. Os lobos hepáticos remanescentes foram submetidos à análise histomorfométrica, imuno-histoquímica e molecular. RESULTADOS: Verificou-se que no grupo com hepatectomia a 70% houve recuperação do peso do fígado no terceiro dia com aumento da atividade mitótica, enquanto que no grupo com estenose portal não se observou esse fenômeno (p < 0,001). A insulina e o tacrolimus promoveram aumento do peso do fígado e do índice mitótico. A atividade mitótica foi considerada aumentada nos animais dos grupos hepatectomia, hepatectomia + ligadura da artéria, insulina e tacrolimus; e esse parâmetro estava reduzido no grupo submetido à hepatectomia + estenose portal (p < 0,001). A expressão de interleucina 6 estava presente em todos os animais, sendo significativamente maior nos grupos hepatectomia, hepatectomia + ligadura da artéria e significativamente menor no grupo hepatectomia + estenose portal. Entretanto, a administração de tacrolimus ou insulina recuperou os níveis teciduais de interleucina 6 no grupo com estenose portal. CONCLUSÕES: No presente estudo foi padronizado um modelo simples e facilmente reprodutível para estudar a regeneração hepática em ratos em crescimento com redução do fluxo arterial ou venoso para o fígado. Foi demonstrado que a administração de insulina ou tacrolimus é capaz de reverter os efeitos deletérios da estenose portal na regeneração hepática. A obstrução do fluxo arterial não afetou a capacidade regenerativa hepática

Characterization of the interfaces between Au(hkl) single crystal basal plane electrodes and [Emmim][Tf2N] ionic liquid

The interface between Au(hkl) basal planes and the ionic liquid 1-Ethyl-2,3-dimethyl imidazolium bis(trifluoromethyl)sulfonil imide was investigated by using both cyclic voltammetry and laser-induced temperature jump. Cyclic voltammetry showed characteristic features, revealing surface sensitive processes at the interfaces Au(hkl)/[Emmim][Tf2N]. From laser-induced heating the potential of maximum entropy (pme) is determined. Pme is close to the potential of zero charge (pzc) and, therefore, the technique provides relevant interfacial information. The following order for the pme values has been found: Au(111) > Au(100) > Au(110). This order correlates well with work function data and values of pzc in aqueous solutions.

New theropod remains from the Tiourarén Formation (?Middle Jurassic, Niger) and their bearing on the dental evolution in basal tetanurans

A fragment of a maxilla and isolated theropod teeth from the (?) Middle Jurassic Tiourarén Formation are described. The specimens come from Tadibene, in the rural community of Aderbissinat, Thirozerine Department, Agadez Region, Niger. They were identified through direct comparison with teeth previously described in the literature as well as on the basis of discriminant and morphometric analyses. Our results suggest they belong to Ceratosauridae, Megalosauridae, and the oldest representatives of Spinosauridae. The analyzed sample shows some uncommon characters, such as spinosaurid-like ornamentation in megalosaurid-like teeth, or spinosaurid-like teeth with a low number of denticles, which sheds light on tooth morphology and dental evolution in basal tetanurans and early spinosaurids.

Drosophila melanogaster as a model for basal body research

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is one of the most extensively studied organisms in biological research and has centrioles/basal bodies and cilia that can be modelled to investigate their functions in animals generally. Centrioles are nine-fold symmetrical microtubule-based cylindrical structures required to form centrosomes and also to nucleate the formation of cilia and flagella. When they function to template cilia, centrioles transition into basal bodies. The fruit fly has various types of basal bodies and cilia, which are needed for sensory neuron and sperm function. Genetics, cell biology and behaviour studies in the fruit fly have unveiled new basal body components and revealed different modes of assembly and functions of basal bodies that are conserved in many other organisms, including human, green algae and plasmodium. Here we describe the various basal bodies of Drosophila, what is known about their composition, structure and function.