Analyse von Biotransformationen und Naturstoffsynthesen in pflanzlichen Zellkulturen unter Anwendung der in vivo NMR-Spektroskopie ohne Markierung

Die Aufklärung von Biosynthesewegen erfolgt häufig mit Hilfe von Fütterungsexperimenten mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markierten Präkusoren oder auf der Basis der Enzymreinigung mit anschließender molekularbiologischer Charakterisierung. Die erstgenannte Methode verlangt die Isolierung der Produkte. Jedoch besteht bei Aufarbeitung und Extraktion immer die Gefahr, daß sich der Metabolit teilweise oder vollständig chemisch verändert. Ein weiterer Nachteil der genannten Methoden ist, daß diese generell mühsam und zeitaufwendig sind. Mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie können diese Nachteile umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Biotransformationen und Biosynthesesequenzen des Ajmalin-Biosyntheseweges mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie in Pflanzenzellkulturen von Rauvolfia serpentina und Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta anhand der natürlichen 13C-Häufigkeit untersucht. Dafür wurden ein 700 MHz, 800 MHz und ein 500 MHz CryoProbe Spektrometer eingesetzt, um die Biotransformationen von Isatin-3-oxim und Isatin sowie die Metabolisierungen der Alkaloide Vellosimin, Vinorin, Vomilenin, Ajmalin, Nß-Methyl-dihydrochano-ajmalin und Perakin mit der 1H-13C invers korrelierten NMR-Spektroskopie zu verfolgen.

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina bearbeitet. Es wurde versucht, das an der Biosynthese des Alkaloids Ajmalin beteiligte Cytochrom P450-Enzym Vinorin-Hydroxylase heterolog und funktionell zu exprimieren. Ein zunächst unvollständiger, unbekannter Cytochrom P450-Klon konnte komplettiert und eindeutig mittels heterologer Expression in sf9-Insektenzellen als Cinnamoyl-Hydroxylase identifiziert werden. Die Tauglichkeit des Insektenzellsystems für die Untersuchung der Vinorin-Hydroxylase ist auf Grund der deacetylierenden Wirkung der Insektenzellen auf das Substrat Vinorin nicht gegeben. Im Rahmen des Homology Cloning Projektes konnten mehrere Volllängenklone und diverse Teilsequenzen von neuen Cytochrom P450-Klonen ermittelt werden. Ausserdem wurde durch das unspezifische Binden eines degenerierten Primers ein zusätzlicher Klon gefunden, der der Gruppe der löslichen Reduktasen zugeordnet werden konnte. Diese putative Reduktase wurde auf die Aktivität von mehreren Schlüsselenzymen der Ajmalin-Biosynthese durch heterologe Expression in E.coli und anschliessende HPLC-gestützte Aktivitätstests ohne Erfolg geprüft. Bedingt durch die Untauglichkeit des Insektenzellsystems für die Identifizierung der Vinorin-Hydroxylase, wurde ein neuartiges Modul-gestütztes, pflanzliches Expressionsystem etabliert, um vorhandene P450-Volllängenklone auf Vinorin- Hydroxylaseaktivität testen zu können. Die Funktionalität des Systems konnte durch die heterologe Expression der Polyneuridinaldehyd Esterase bestätigt werden. Trotzdem war es bis jetzt nicht möglich, die Cinnamoyl-Hydroxylase als Kontrollenzym für das pflanzliche System oder aber die gesuchte Vinorin- Hydroxylase in aktiver Form zu exprimieren.

Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese

Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden.

Synthesis and characterization of novel poly(imino ketone)s via palladium-catalyzed aryl amination

The challenge of the present work was to synthesize and to characterize new classes of N-containing polymers via palladium-catalyzed aryl amination. This work was inspired by a desire to combine the properties of high-performance polymers such as PEKs with those of N-containing conductive polymers such as polyaniline (PANI), poly(aromatic amides) (PAAs), and the ready synthesis of N-containing simple aromatic compound by the Buchwald-Hartwig reaction. Careful investigation of a model reaction was carried out to provide insights into the formation of side products which will have a negative effect upon the molecular weight or upon the materials properties of the desired polymers in the polycondensation reaction. In this thesis, five new different polymer classes namely, poly(imino ketone)s (PIKs), poly(imino acridine)s (PIAcs), poly(imino azobenzene)s (PIAzos), poly(imino fluorenone)s (PIFOs), and poly(imino carbazole)s (PICs) were synthesized and fully characterized by means of 1H-NMR, elemental analysis, UV, FT-IR, X-ray, GPC, TGA, DSC, DMA, and dielectric spectroscopy. To optimize the polycondensation process, the influence of the concentration, temperature, ligands and the reactivity of the halogen containing monomers were investigated. A temperature of 100-165 °C and a concentration of 30-36 % were found to be optimal for the palladium-catalyzed polycondensation to produce polymer with high molecular weight (Mn = 85 900, Mw = 474 500, DP = 126). Four different ligands were used successfully in the Pd-catalyzed process, of which the Pd/BINAP system was found to be the most effective catalyst, producing the highest yield and highest molecular weight polymers. It was found that the reactivity decreases strongly with increasing electronegativity of the halogen atoms, for example better yields, and higher molecular weights were obtained by using dibromo compounds than dichloro compounds while difluoro compounds were totally unreactive. Polymer analogous transformations, such as the protonation reaction of the ring nitrogens in PIAcs, or of the azobenzene groups of PIAzos, the photo and thermal cis-trans-isomerization of PIAzos, and of poly(imino alcohol)s were also studied. The values of the dielectric constants of PIKs at 1 MHz were in the range 2.71-3.08. These low values of the dielectric constant are lower than that of "H Film", a polyimide Kapton film which is one of the most preferred high-performance dielectrics in microelectronic applications having a dielectric constant of 3.5. In addition to the low values of the dielectric constants, PIKs have lower and glass transition temperatures (Tgs) than arimides such as Kapton which may make them more easily processable. Cyclic voltammetry showed that PICs exhibited low oxidation and reduction potentials and their values were shifted to low values with increasing degree of polymerization i.e. with increasing of the carbazole content in backbone of PICs (PIC-7, 0.44, 0.33 V, DP= 37, PIC-5, 0.63, 0.46, DP= 16, respectively).

Kohlenhydrat-Auxiliare in der asymmetrischen Synthese chiraler Stickstoffheterocyclen und Alkaloide

In dieser Arbeit wurden durch Verwendung eines stereodifferenzierenden Kohlenhydrat-Auxiliars chirale Stickstoffheterocyclen und enantiomerenreine Piperidin-Alkaloide synthetisiert. Alkaloide mit einer Piperidin-Grundstruktur sind in der Natur weit verbreitet und weisen vielfältige biologische Aktivitäten auf. Zusammen mit synthetischen Derivaten sind sie daher von großem Interesse für die Wirkstoffforschung. Mit dem aus D-Arabinose zugänglichen 2,3,4-Tri-O-pivaloyl-D-arabinosylamin wurden mit hoher Stereoselektivität N-Glycosyl-dehydropiperidinone aufgebaut, die vielfältig modifizierbare Ausgangsverbindungen zur Synthese unterschiedlich substituierter Stickstoffheterocyclen darstellen. In einer Vielzahl vor allem metallorganischer Reaktionen waren regio- und stereoselektive Derivatisierungen an allen Positionen der N-glycosidisch gebundenen Dehydropiperidinone möglich. Durchgeführt wurden z. B. die Addition aktivierter Cuprate, elektrophile Substitutionen, Reduktionen, Iod-Magnesium-Austausch sowie palladium- und kupferkatalysierte Kupplungen. Die Kombination dieser Methoden führte zu mehrfach substituierten Piperidinen. In einer Ringschlussmetathese wurde zudem ein Zugang zu bicyclischen Heterocyclen geschaffen. Das Kohlenhydrat-Auxiliar steuert den stereochemischen Verlauf der Bildung der Dehydropiperidinone und der daran durchgeführten Funktionalisierungen. Die Konfigurationen der neu gebildeten Stereozentren wurden mittels Röntgenstrukturanalysen und NMR-Spektroskopie sowie durch die Überführung der Piperidin-Derivate in Alkaloide mit bekanntem Drehwert ermittelt. Die Stickstoffheterocyclen können nach Entfernen der Enamin-Doppelbindung durch milde Acidolyse vom Kohlenhydrat-Auxiliar abgespalten werden, wodurch man die enantiomerenreinen Alkaloide erhält.

Organocatalytic tandem reactions of polyfunctional compounds for the synthesis of enantioenriched heterocycles. Reazioni tandem organocatalitiche di composti polifunzionali per la sintesi di eterocicli enantioarricchiti.

In questo lavoro di tesi sono state sviluppate reazioni domino, tandem e procedure one-pot per ottenere eterocicli enatioarricchiti. Lo sviluppo di queste metodologie sintetiche è molto importante perché permettono di ottenere molecole complesse partendo da prodotti semplici, senza effettuare ripetuti passaggi di purificazione (stop-and-go or step-by-step synthesis). Lo scopo di questo lavoro è di ottenere derivati tetraidrofuranici modificati e derivati ossoazzolinici enantioarrichiti tramite reazioni SN2-Michael o tramite reazioni aldolica-ciclizzazione-Michael usando la catalisi asimmetrica a trasferimento di fase (PTC). Come catalizzatori PTC per imprimere enantioselezione sono stati utilizzati sali di ammonio quaternario derivati dagli alcaloidi della Cinchona. Sono state ottimizzate le condizioni di reazione (base inorganica, temperatura, solvente, tempo di reazione) per i diversi substrati presi in considerazione. I prodotti target sono stati ottenuti con buone rese, ottime diastereoselezioni ma con bassa enantioselezione. I risultati ottenuti richiedono un’ulteriore ottimizzazione e dovranno essere valutate variazioni strutturali dei nucleofili utilizzati. In this thesis were developed domino, tandem reactions and one-pot procedures to obtained enantioenriched heterocycles. The development of these methodologies is very fundamental because they allow to obtain complex molecules starting from raw materials, without carrying out repeated purification steps (stop-and-go or step-by-step synthesis). The purpose of this work is to obtain enantioenriched tetrahydrofuran and oxazoline derivatives through a SN2-Michael reaction or a aldol- cyclization-Michael reaction using the phase-transfer asymmetric catalysis (PTC). For imprint enantioselection we used Cinchona alkaloids quaternary ammonium salts derivatives. The reaction conditions (inorganic base, temperature, solvent, reaction time) were optimised for the different substrates taken into account. The target products were obtained with good yields, excellent diastereoselections but with low enantioselections. The obtained results require further optimization and structural changes in the nucleophiles used must be evaluated.

Entwicklung neuartiger stickstoffreicher Polyphenylene

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Darstellung und elektronische Anwendungsmöglichkeiten von neuartigen stickstoff- und damit elektronenreichen Poly(para-phenylenen) untersucht. Der Teilbereich „Polycarbazole“ befasst sich mit der Synthese von konjugierten (Stufen)leiterpolymeren auf der Basis von Carbazol. Dazu wurde ein neuer und effizienter Syntheseweg zur Gewinnung von 2,7-Dibromcarbazol entwickelt. Durch die weitere Funktionalisierung von 2,7-Dibromcarbazol gelang es, elektronenreiche Leiterpolymere zu gewinnen, die eine grüne Emissionsfarbe aufwiesen. Mit der Verwendung von R = 2-Decyltetradecyl als löslichkeitsfördernder Seitenkette in einem Poly(2,7-carbazol) konnte erstmals ein hochmolekulares Polycarbazol gewonnen werden. Dieses gut lösliche Poly(2,7-carbazol) erwies sich als ein exzellentes Donatormaterial in Solarzellen, welches in Kombination mit dem Farbstoff PDI eine effiziente Solarzelle ergab. Eine OLED mit einem neuartigen arylierten Polycarbazol als Emittermaterial zeigte eine sehr niedrige Turn-on-Spannung und eine intensive blaue EL-Emission. Das Kapitel über imidazolhaltige Poly(para-phenylene) und Discoten stellt die Darstellung von planarisierten Bisimidazolen vor, welche in hohen Ausbeuten durch eine intramolekulare Buchwald-Reaktion zwischen den Imidazolringen und der zentralen Terphenyleinheit durchgeführte wurde. Die dreistufige Darstellung der Discoten aus einem Terephthalaldehyd-Derivat und einem Benzil erlaubt eine einfache sowie variable Einführung von löslichkeitsfördernden Alkylsubstituenten. Auf diese Weise ist der Zugang zu einer völlig neuartigen Klasse an discotischen Materialien möglich, die eine Kombination aus Discoten auf der Basis von Benzolringen (wie z.B. HBC) mit Heteroaromaten darstellen. Die gewonnenen scheibenförmigen Bisimidazole wiesen dementsprechend auf Selbstanordnung zurückzuführende kolumnare Anordnungen und hexagonale Überstrukturen auf. Im dritten Themengebiet wird der Einbau eines Phthalimidchromophors direkt in das Rückgrad von Polyanilin vorgestellt. Da jegliche Veränderung des Oxidationsgrades zu einer unterschiedlichen Donatorfähigkeit des Polyanilinhauptkette führt, variiert in Abhängigkeit davon das Absorptionsverhalten des eingebauten Farbstoffes. Durch die Einführung des Phthalimidchromophores war es zudem möglich, ein leitfähiges Polymer zu erhalten, das im Gegensatz zum nicht-fluoreszierenden Polyanilin eine intensive gelbe Fluoreszenz (lmax = 547 nm) aufweist.

Conjugated semiconducting organic materials for electronic applications

Since conjugated polymers, i.e. polymers with spatially extended pi-bonding system have offered unique physical properties, unobtainable for conventional polymers, significant research efforts directed to better understanding of their chemistry, physics and engineering have been undertaken in the past two and half decades. In this thesis we discuss the synthesis, characterisation and investigation of conjugated semiconducting organic materials for electronic applications. Owing to the versatile properties of metal-organic hybrid materials, there is significant promise that these materials can find use in optical or electronic devices in the future. In addressing this issue, the synthesis of bisthiazol-2-yl-amine (BTA) based polymers is attempted and their metallation is investigated. The focus of this work has been to examine whether the introduction of coordinating metal ions onto the polymer backbone can enhance the conductivity of the material. These studies can provide a basis for understanding the photophysical properties of metal-organic polymers based on BTA. In their neutral (undoped) form conjugated polymers are semiconductors and can be used as active components of plastics electronics such as polymer light-emitting diodes, polymer lasers, photovoltaic cells, field-effect transistors, etc. Toward this goal, it is an objective of the study to synthesize and characterize new classes of luminescent polymeric materials based on anthracene and phenanthrene moieties. A series of materials based on polyphenylenes and poly(phenyleneethynylene)s with 9,10-anthrylene subunits are not only presented but the synthesis and characterization of step-ladder and ladder poly(p-phenylene-alt-anthrylene)s containing 9,10-anthrylene building groups within the main chain are also explored. In a separate work, a series of soluble poly-2,7- and 3,6-phenanthrylenes are synthesized. This can enable us to do a systematic investigation into the optical and electronic properties of PPP-like versus PPV-like. Besides, the self-organization of 3,6-linked macrocyclic triphenanthrylene has been investigated by 2D wide-angle X-ray scattering experiments performed on extruded filaments in solution and in the bulk. Additionally, from the concept that donor-acceptor materials can induce efficient electron transfer, the covalent incorporation of perylene tetracarboxydiimide (PDI) into one block of a poly(2,7-carbazole) (PCz)-based diblock copolymer and 2,5-pyrrole based on push-pull type material are achieved respectively.

Nitrogen-bridged polyphenylene-based materials for electronic applications

Conjugated polymers are macromolecules that possess alternating single and double bonds along the main chain. These polymers combine the optoelectronic properties of semiconductors with the mechanical properties and processing advantages of plastics. In this thesis we discuss the synthesis, characterization and application of polyphenylene-based materials in various electronic devices. Poly(2,7-carbazole)s have the potential to be useful as blue emitters, but also as donor materials in solar cells due to their better hole-accepting properties. However, it is associated with two major drawbacks (1) the emission maximum occurs at 421 nm where the human eye is not very sensitive and (2) the 3- and 6- positions of carbazole are susceptible to chemical or electrochemical degradation. To overcome these problems, the ladder-type nitrogen-bridged polymers are synthesized. The resulting series of polymers, nitrogen-bridged poly(ladder-type tetraphenylene), nitrogen-bridged poly(ladder-type pentaphenylene), nitrogen-bridged poly(ladder-type hexaphenylene) and its derivatives are discussed in the light of photophysical and electrochemical properties and tested in PLEDs, solar cell, and OFETs. A promising trend which has emerged in recent years is the use of well defined oligomers as model compounds for their corresponding polymers. However, the uses of these molecules are many times limited by their solubility and one has to use vapor deposition techniques which require high vacuum and temperature and cannot be used for large area applications. One solution to this problem is the synthesis of small molecules having enough alkyl chain on the backbone so that they can be solution or melt processed and has the ability to form thin films like polymers as well as retain the high ordered structure characteristics of small molecules. Therefore, in the present work soluble ladderized oligomers based on thiophene and carbazole with different end group were made and tested in OFET devices. Carbazole is an attractive raw material for the synthesis of dyes since it is cheap and readily available. Carbazoledioxazine, commercially known as violet 23 is a representative compound of dioxazine pigments. As part of our efforts into developing cheap alternatives to violet 23, the synthesis and characterization of a new series of dyes by Buchwald-type coupling of 3-aminocarbazole with various isomers of chloroanthraquinone are presented.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Design, Synthese und biochemische/biologische Evaluierung bioisosterer Oligopyrrolcarboxamide mit aliphatisch-amidisch verknüpften DNA-Interkalatoren

Die DNA stellt aufgrund der genetischen Krankheitsursache nach wie vor ein überaus attraktives Target für das Design antitumoraktiver Zytostatika dar. Ein wesentlicher Schwerpunkt der heutigen Forschung besteht vor allem in der Entwicklung niedermolekularer, sequenzspezifischer DNA-Liganden zur gezielten Ausschaltung defekter Gene. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte daher in Anlehnung an die antitumoral wirksame Leitsubstanz Netropsin - ein AT-selektiver Minor Groove Binder mit Bispyrrolcarboxamid-Grundstruktur - erstmals der systematische Aufbau einer neuen Serie bioisosterer Hybridmoleküle, bestehend aus einem interkalierenden Strukturelement (Acridon, Naphthalimid, 5-Nitronaphthalimid, Anthrachinon, 11H-Pyrido[2,3-a]carbazol) und Thiophenpyrrol-, Imidazolpyrrol-, Thiazolpyrrol- bzw. Bisimidazolcarboxamid als rinnenbindende Oligoamid-Einheit (sog. Combilexine). Die chromophoren Systeme am N-Terminus wurden hierbei über aliphatische Linker variabler Kettenlänge mit der Carboxamid-Kette verknüpft. Als C-terminale Funktion kam sowohl die N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan- als auch die um ein C-Atom kürzere Dimethylaminoethylamin-Seitenkette zum Einsatz. Unter Verwendung modernster Reagenzien aus der Peptidkupplungschemie ist es gelungen, ein präparativ gut zugängliches, reproduzierbares Verfahren zur Synthese dieser bioisosteren Combilexine zu entwickeln. Anhand biophysikalischer/biochemischer, zellbiologischer und physikochemischer (1H-NMR-spektroskopischer und röntgenstrukturanalytischer) Methoden sowie Molecular Modelling Studien wurden erstmals bezüglich der DNA-Bindung, der Topoisomerase-Hemmung und der Antitumor-Zellzytotoxizität in einem breiten Rahmen vororientierende Struktur-Wirkungsbeziehungen an bioisosteren Liganden erstellt. Wenngleich zwischen den in vitro und in silico ermittelten Befunden keine konkreten Gesetzmäßigkeiten zu erkennen waren, so ließ die Summation der Ergebnisse dennoch darauf schließen, dass es sich bei den Naphthalimidpropion- und Acridonbuttersäure-Derivaten mit C-terminaler Propylendiamin-Funktion um die aussichtsreichsten Kandidaten in Bezug auf die DNA-Affinität bzw. Zytotoxizität handelte.

Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.

Enantioselective Reactions Promoted by Organocatalytic Species From The Natural Chiral Pool

During the course of my Ph.D. in the laboratories directed by Prof. Alfredo Ricci at the Department of Organic Chemistry “A. Mangini” of the University of Bologna, I was involved in the study and the application of a number of organocatalytic systems, all coming from the natural chiral pool. The first part of this thesis will be devoted to new homogeneous organocatalytic reactions promoted by Cinchona alkaloid-based organocatalysts. Quinine based catalysts were found to be a very effective catalyst for Diels-Alder reactions involving 3-vinylindoles. Excellent results in terms of yields and enantioselectivities were achieved, outlining also a remarkable organocatalytic operational mode mimicking enzymatic catalysis. The same reaction with 2-vinylindoles showed a completely different behaviour resulting in an unusual resolution-type process. The asymmetric formal [3+2] cycloaddition with in situ generated N-carbamoyl nitrones using Cinchona-derived quaternary ammonium salts as versatile catalysts under phase transfer conditions, outlines another application in organocatalysis of this class of alkaloids. During the seven months stage in the Prof. Helma Wennemers’ group at the Department of Chemistry of the University of Basel (Switzerland) I have been involved in organocatalysis promoted by oligopeptides. My contribution regarded the 1,4-addition reaction of aldehydes to nitroolefins. In the work performed at the Department of Organic Chemistry “A. Mangini” of the University of Bologna, in collaboration with the ‘Institut Charles Gerhardt-Montpellier, of Montpellier (France) the possibility of performing for the first time heterogeneous organocatalysis by using a natural polysaccharide biopolymer as the source of chirality was disclosed. With chitosan, derived from deacetylation of chitin, a highly enantioselective heterogeneous organocatalytic aldol reaction could be performed. The use of an eco-friendly medium such as water, the recyclability of the catalytic specie and the renewable nature of the polysaccharide are assets of this new approach in organocatalysis and open interesting perspectives for the use of biopolymers.

Elaeocarpacae-Alkaloide: flexible Synthese optisch aktiver (-) Elaeokanin C Schlüsselbausteine

Kurzzusammenfassung Elaeocarpacae-Alkaloide: flexible Synthesen optisch aktiver (-) Elaeokanin C Schlüsselbausteine Im Tier- und Pflanzenreich sind Alkaloide weit verbreitet und werden von der Biogenese her als Produkte des Aminosäure-Stoffwechsels angesehen. Die Elaeocarpacae-Alkaloide zählen zu den Indolizidinen, welche durch ein Azabicyclo-[4.3.0]-nonan Grundgerüst charakterisiert sind und erstmals Ende der 60er Jahre des letzten Jahrhunderts aus den Blättern der in Neu Guinea beheimateten Ölbaumgewächse isoliert wurden. Für verschiedene Vertreter dieses Alkaloid-Typs wurden sowohl racemische als auch asymmetrische Totalsynthesen entwickelt. Während für das (+) Elaeokanin C bereits Totalsynthesen existieren, gibt es für das (-) Elaeokanin C bis heute keine asymmetrische Synthese. Als Fernziel der vorliegenden Arbeit wurde die erste Totalsynthese von (-) Elaeokanin C ausgewählt. Der Syntheseplan sieht zunächst den diastereoselektiven Aufbau eines optisch aktiven Schlüsselbausteins mit Naturstoff-Stereotriade im Sinne einer konvergenten ex-chiral-pool Synthese vor. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies durch die Aza-Claisen-Umlagerung realisiert werden. Ausgehend von diesem Schlüsselbaustein wurden verschiedene Synthesewege verfolgt um sowohl das Substitutionsmuster der Seitenkette als auch das des Piperidinsegments vielfältig variieren zu können. Die Einführung der Seitenkette erwies sich durch vielfältige Nachbargruppeneffekte wie die unerwünschte 5-exo-trig Cyclisierung zu einem Pyrrolizidin Derivat als große Hürde. Eine geänderte Synthesestrategie mit einem schrittweisen Aufbau der Kette lieferte schließlich den Baustein, aus dem nun in wenigen Stufen das (-) Elaeokanin C sowie vielfältige Analoga herzustellen sein sollten.

Synthese und photophysikalische Eigenschaften von Indolocarbazolen und höheren Analoga

Das Ziel dieser Arbeit bestand zum einen in der Entwicklung einer einfachen Synthesestrategie zur Darstellung substituierter symmetrischer Indolo[3,2-b]carbazole sowie in der Erweiterung des -Elektronensystems, um höhere Analoga dieser Substanzklasse zu synthetisieren. Der Zugang sollte dabei durch eine doppelte Cadogan-Ringschlussreaktion als Schlüsselschritt erfolgen. Die doppelte Cadogan-Reaktion erfolgte dabei unter Mikrowellenbedingungen in zufriedenstellenden Ausbeuten. Mittels Röntgenstrukturanalyse sind die verschiedenen Indolo[3,2-b]carbazole und Diindolo[3,2-b;2´,3´-h]carbazole auf ihre Eigenschaften im Festkörper hin untersucht worden. Dabei zeigen sie mit ihren Anordnungen im festen Zustand gute Eigenschaften für deren Verwendung als organische Halbleitermaterialien in Organischen Dünnschichttransistoren oder auch in Organischen Leuchtdioden. Die photophysikalische Charakterisierung erfolgte mittels UV/Vis- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch elektrooptische Absorptionsmessung, die Informationen über die Größe der Dipolmomente im Grundzustand und im angeregten Franck-Condon-Zustand lieferte. Die elektrochemischen Eigenschaften wurden aus cyclovoltammetrischen Messungen durch die Bestimmung der Redoxpotentiale, und damit die Lage der HOMO- bzw. LUMO-Levels, gewonnen. Durch die Synthese und die Bestimmung ihrer photophysikalischen Eigenschaften, mittels UV/Vis- und Fluoreszenzspektroskopie, von auf Naphthalin basierenden Chromophoren wurden zudem Verbindungen dargestellt, die Verwendung in lumineszierenden Lanthanid(III)-Komplexen finden können. Die Darstellung erfolgte mittels einer palladium-katalysierten Arylaminierung gefolgt von einer Suzuki-Kupplung mit 1,4-Dibromnaphthalin als Startmaterial.