Effects of additional sequences directly downstream from the AUG on the expression of GFP gene

We have studied the expression of the green fluorescent protein (GFP) gene to gain more understanding of the effects of additional nucleotide triplets (codons) downstream from the initiation codon on the translation of the GFP mRNA in CHO and Cos1 cells. A leader sequence of six consecutive identical codons (GUG, CUC, AGU or UCA) was introduced into a humanized GFP (hm gfp) gene downstream from the AUG to produce four GFP gene variants. Northern blot and RT-PCR analysis indicated that mRNA transcription from the GFP gene was not significantly affected by any of the additional sequences. However, immunoblotting and FACS analysis revealed that AGU and UCA GFP variants produced GFP at a mean level per cell 3.5-fold higher than the other two GFP variants and the hm gfp gene. [35S]-Methionine labeling and immunoprecipitation demonstrate that GFP synthesis was very active in UCA variant transfected-cells, but not in GUG variant and hm gfp transfected-cells. Moreover, proteasome inhibitor MG-132 treatment indicated that the GFPs encoded by each of the GFP variants and the hm gfp were equally stable, and this together with the comparable mRNA levels observed for each construct suggested that the different steady-state GFP concentrations observed reflected different translation efficiencies of the various GFP genes. In addition, the CUC GFP variant, when transiently transfected into CHO or COS-1 cells, did not produce any GFP expressing cells (fully green cells), and the GUG variant produced GFP expressing cells less than 10%, while AGU and UCA GFP variants up to 30–35% in a time course study from 8 to 36 h posttransfection. Analysis of the potential secondary structure of the GFP variant mRNAs especially in the translation initiation region suggested that the secondary structure of the GFP mRNAs was unlikely to explain the different translation efficiencies of the GFP variants. The present findings indicate that a change of the initiation context of the GFP gene by addition of extra coding sequence can alter the translation efficiency of GFP mRNA, providing a means of more efficient expression of GFP in eukaryotic cells.

Constitutively active signal transducer and activator of transcription 5 can replace the requirement for growth hormone in adipogenesis of 3T3-F442A preadipocytes

Although it is the best characterized in vitro model of GH action, the mechanisms used by GH to induce differentiation of murine 3T3-F442A preadipocytes remain unclear. Here we have examined the role of three transcriptional regulators in adipogenesis. These regulators are either rapidly induced in response to GH [Stra13, signal transducer and activator of transcription (Stat) 3] or of central importance to GH signaling (Stat5). Retroviral transfection of 3T3-F442A preadipocytes was used to increase expression of Stra13, Stat3, and Stat5a. Only Stat5a transfection increased the expression of adipogenic markers peroxisome proliferator-activated receptor gamma, CCAAT enhancer binding protein (C/EBP)alpha, and adipose protein 2/fatty acid-binding protein in response to GH, as determined by quantitative RT-PCR. Transfection with constitutively active Stat3 and Stat5a revealed that constitutively active Stat5a but not Stat3 was able to replace the GH requirement for adipogenesis. Constitutively active Stat5a but not Stat3 was able to increase the formation of lipid droplets and expression of alpha-glycerol phosphate dehydrogenase toward levels seen in mature adipocytes. Constitutively active Stat5a was also able to increase the expression of transcripts for C/EBPalpha to similar levels as GH, and of C/EBPbeta, peroxisome proliferator-activated receptor gamma, and adipose protein 2/fatty acid-binding protein transcripts to a lesser extent. An in vivo role for GH in murine adipogenesis is supported by significantly decreased epididymal fat depot size in young GH receptor-deleted mice, before manifestation of the lipolytic actions of GH. We conclude that Stat5 is a critical factor in GH-induced, and potentially prolactin-induced, murine adipogenesis.

Identification and characterization of the hepatic stellate cell transferrin receptor

Activated hepatic stellate cells have been implicated in the fibrogenic process associated with iron overload, both in animal models and in human hemochromatosis. Previous studies have evaluated the role of ferritin/ferritin receptor interactions in the activation of stellate cells and subsequent fibrogenesis; however, the role of transferrin in hepatic stellate cell biology is unknown. This study was designed to identify and characterize the stellate cell transferrin receptor and to evaluate the influence of transferrin on stellate cell activation. Identification and characterization of the stellate cell transferrin receptor was determined by competitive displacement assays. The effect of transferrin on stellate cell activation was assessed using western blot analysis for alpha-smooth muscle actin expression, [H-3]Thymidine incorporation, and real-time RT-PCR for procollagen 1(I) mRNA expression. A specific receptor for rat transferrin was observed on activated but not quiescent stellate cells. Transferrin significantly increased the expression of alpha-smooth muscle actin, but caused a decrease in proliferation. Transferrin induced a significant increase in procollagen alpha1(I) mRNA expression. In conclusion, this study has demonstrated for the first time a specific, high affinity receptor for rat transferrin on activated hepatic stellate cells, which via interaction with transferrin regulates stellate cell activation. This suggests that transferrin may be an important factor in the activation of hepatic stellate cells in conditions of iron overload.

Distribution of Sugarcane mosaic virus in sugarcane plants

Variation in the concentration of virus in different parts of the plant has implications for virus-indexing programs. To allow more reliable detection of Sugarcane mosaic virus (SCMV), the distribution of the virus in sugarcane plants after artificial inoculation was studied using a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Leaves of susceptible and moderately resistant sugarcane were mechanically inoculated with SCMV 6 weeks after planting. Weekly for 8 weeks after inoculation, plants were examined for mosaic symptoms and samples of leaves, roots and tillers were tested by RT-PCR to detect virus. SCMV moved from the point of inoculation to younger leaves, roots and tillers and eventually to leaves that emerged prior to inoculation. The pattern of SCMV distribution in moderately resistant and susceptible cultivars was not substantially different. However, the virus moved more slowly in the moderately resistant than in the susceptible cultivar. Young leaves proved to be the most suitable tissue for testing.

An SNP-based PCR assay to differentiate between Listeria monocytogenes lineages derived from phylogenetic analysis of the sigB gene

The alternative sigma factor sigB gene is involved in the stress response regulation of Listeria monocytogenes, and contributes towards growth and survival in adverse conditions. This gene was examined to determine if it could be a useful indicator of lineage differentiation, similar to the established method based on ribotyping. The sigB sequence was resolved in four local L. monocytogenes strains and the phylogenetic relationship among these, and a further 21 sigB gene sequences from strains of different serotype and lineage including two Listeria innocua strains, obtained from the GenBank database were determined. The sigB nucleotide sequences of these 25 Listeria strains were then examined for single nucleotide polymorphic (SNP) sites that could differentiate between the three lineages. Based on nucleotide sequences L. monocytogenes lineage F serotype 1/2b and 4b clustered together, lineage II/serotype 1/2a and 1/2c strains clustered together, lineage III/serotypes 4a and 4c strains clustered together and L. innocua strains clustered together as an outgroup. SNPs differentiating the three lineages were identified. Individual allele-specific PCR reactions based on these polymorphisms were successful in grouping known and a further 37 local L. monocytogenes isolates into the three lineages. (C) 2003 Elsevier B.V. All fights reserved.

A protective effect of early pregnancy factor on experimental autoimmune encephalomyelitis induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein

Experimental antoimmune encephalomyelitis (EAE) is an organ-specific autoimmune disease characterised by inflammation and demyelination of the central nervous system and is the best available animal model of multiple sclerosis (MS). Since previous studies have shown that EAE is less severe or is delayed in onset during pregnancy and that administration of the pregnancy hormone early pregnancy factor (EPF) down-regulates EAE, experiments in the present study were designed to explore further the role of EPF in EAE. By using the rosette inhibition test, the standard bioassay for EPF and, by semi-quantitative RT-PCR techniques, we have now shown that inflammatory cells from the spinal cord of rats with EAE can produce and secrete EPF, with production being greatest during recovery from disease. Administration of EPF to rats with EAE resulted in a significant increase in the expression of IL-4 and IL-10 mRNA and a significant decrease in IFN-gamma mRNA expression in spinal cord inflammatory cells. Encephalitogenic MBP-specific T cell lines were prepared from popliteal lymph nodes of rats with EAE. Proliferation assays using these cells demonstrated the ability of exogenous EPF to down-regulate the responses of T lymphocytes to MBP. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Impregnação tuberculosa em menores de quatorze anos, detectada pela prova tuberculínica, em duas áreas do município de São Paulo

Os autores estudaram as reações ao teste tuberculínico com PPD Rt-23, nos menores de 14 anos de dois bairros do município de São Paulo. No Dispensário da Faculdade de Saúde Pública foram examinadas 18.129 pessoas, no período de 1960 a 1969 e, no Dispensário da Associação dos Sanatórios Populares "Campos do Jordão" 38.436 pessoas, no período de 1966 a 1969, usando-se a mesma técnica e orientação. A porcentagem de reações positivas manteve-se inferior a 10,6%, nas pessoas examinadas.

Levantamento da prevalência da infecção tuberculosa em escolares do primeiro ano primário das escolas públicas de São Paulo - 1970

Apresentam-se os resultados obtidos com o levantamento da prevalência da infecção tuberculosa em escolares do primeiro ano primário das escolas públicas de São Paulo, Capital. Foram trabalhadas 104 escolas públicas, abrangendo um total de 29.009 escolares. Estes foram submetidos à prova tuberculinica padronizada/OMS, com PPD Rt 23-2UT. De 29.009 provas realizadas, 27.434 foram lidas, cujos resultados encontrados foram: 91,4% de não reatores; 1,6% de reatores fracos e 7,0% de reatores fortes. Estes índices aumentam de 6,3% nas crianças de 6 anos para 16,1% nas crianças de 10 anos e mais.

Duas epidemias de tuberculose em crianças menores de três anos de idade, vacinadas com BCG oral, numa creche do município de São Paulo, Brasil

São descritas duas epidemias de tuberculose em crianças menores de 3 anos de idade vacinadas com BCG oral, ocorridas numa creche para crianças menores de 5 anos de idade, no município de São Paulo, nos anos de 1967 e 1969. Em 1967 havia no estabelecimento 96 crianças, inicialmente não reatoras ao teste tuberculínico padronizado (PPD, Rt-23, 2 UT). Foram encontrados 19 reatores, sendo 12 reatores fortes (63,2%) e 7 reatores fracos (36,8%) e imagens radiológicas indicativas de anormalidade pulmonar em 15 crianças ou 78,9% dos reatores. Em 1969 havia no estabelecimento mais 62 crianças não reatoras, que foram acompanhadas separadamente em relação ao grupo de 1967, embora convivessem no mesmo ambiente. Foram encontrados 36 reatores à tuberculina, sendo 29 reatores fortes (80,5%) e 7 reatores fracos (19,5%) e imagens radiológicas indicativas de anormalidade pulmonar em 11 crianças, ou 30,5% dos reatores. Nesse mesmo ano houve viragem tuberculínica em mais 7 crianças pertencentes ao grupo de não reatores de 1967, sendo 5 reatores fortes e 2 reatores fracos. Nas duas epidemias, as viragens tuberculínicas e as alterações radiológicas pulmonares foram constatadas apenas nas crianças menores de 3 anos de idade, em sua maioria vacinadas previamente com 3 doses de BCG oral, com intervalo de uma semana entre uma dose e outra. A fonte de infecção foi um operário que trabalhou no estabelecimento durante aproximadamente dois meses em 1967 e um mês em 1969, nos locais onde eram mantidas as crianças menores de 3 anos de idade. A vacina administrada por esse método não parece ter influenciado nas conversões tuberculínicas e no desenvolvimento de imunidade específica.

Análise dos resultados da pesquisa da infecção tuberculosa e do primeiro programa de vacinação pelo BCG intradérmico em escolares de São Paulo, Brasil, 1971-1974

São apresentados os resultados do programa de pesquisa da sensibilidade tuberculínica e de vacinação pelo BCG intradérmico em escolares da primeira série da Rede Municipal de Ensino de São Paulo, no período de 1971 a 1974. A pesquisa tuberculínica através da aplicação do PPD, Rt-23, 2 UT, revelou, nos diferentes anos, coeficientes variando de 6,6 a 7,6% de reatores fortes e de 1,6 a 3,0% de reatores fracos. A vacinação pelo BCG intradérmico foi feita em 129.784 crianças, correspondendo a 89,7% dos 144-641 não reatores. O reteste tuberculínico feito em amostra de escolares vacinados, apresentou percentuais anuais de viragem variando de 85,6 a 96,1%. Destes, 7,8 a 21,4% reagiram fracamente e 64,2 a 88,3% reagiram fortemente. Os objetivos foram alcançados, o que se pode observar pelos resultados apresentados observando receptividade do programa por parte da população trabalhada.

Interpretação da sensibilidade tuberculínica em população do interior do Estado de São Paulo

O teste tuberculínico padronizado com 2 U.T. de PPD rt 23 foi aplicado em 35.680 pessoas de todas as idades, ambos os sexos, residentes no município de Ribeirão Preto, São Paulo, região Sudeste do Brasil. O aspecto dos histogramas representativos da sensibilidade tuberculínica sugere a existência de infecções por micobactérias atípicas nessa área.

Viabilidade da aplicação do teste tuberculínico com o dermo-jet

Foram estudadas as reações de hipersensibilidade tuberculínica induzidas por aplicações simultâneas, em adultos jovens, de tuberculina (PPD. RT-23, 2UT), com agulha e seringa e com o dermo-jet. Foram encontrados 61,3% de reatores nas aplicações com agulha e seringa para 40,0% de reatores nas aplicações com o dermo-jet. Os resultados não são considerados favoráveis ao uso do injetor a jato na prática corrente de aplicação do teste tuberculínico.

Aspectos epidemiológicos da tuberculose pulmonar nos municípios de Botucatu, Conchas, São Manuel e Avaré, Estado de São Paulo, Brasil, de 1963 a 1972

O diagnóstico da situação da tuberculose pulmonar nos Municípios de Botucatu, Conchas, São Manuel e Avaré, SP, Brasil, baseou-se na prevalência e risco de infecção em escolares de lª série, em 1972, e em dados de morbidade e mortalidade específica, de 1963 a 1972. Realizou-se inquérito tuberculínico em 2.913 escolares, com PPD 23 RT-2UT; foram analisados os prontuários de 718 casos inscritos no CSI de Botucatu e os atestados de óbito de residentes, incluindo-se os ocorridos em hospitais especializados. As taxas de prevalência de infecção para os quatro Municípios foram respectivamente 2,4%; 6,8%; 1,9% e 4,5%. Para a idade de 7,5 anos, os riscos de infecção foram: 0,27%; 0,32; 0,20% e 0,34%. O nível de infecção apurado caracterizou o conjunto como área de média prevalência da tuberculose pulmonar. Os índices de prevalência de infecção relacionaram-se diretamente à incidência de casos bacilíferos de cada Município. Em 530 casos com baciloscopia, houve 62,0% de positividade. As formas radiológicas moderada e avançada predominaram principalmente em adultos jovens do sexo masculino. Foram registradas alta taxa de abandono (39,5%}, baixo percentual de cura (17,9%) e 3,4% de óbitos; ao redor de 32,0% estava em tratamento. Não houve diferenças estatisticamente significativas das proporções de abandono, segundo procedência por Município ou formas da doença. Invocaram-se razões técnico-administrativas do sistema vigente para explicar esses achados. A incidência média de casos confirmados, no período, foi de 35,4 em Conchas, 33,1 em Avaré, 23,7 em Botucatu e 18,5 em São Manuel (por 100.000). Com casos confirmados e suspeitos os índices foram: 57,6; 48,8; 43,8 e 35,3. Os índices médio-anuais de mortalidade, foram: 7,6 em Botucatu, 12,14 em Conchas, 5,0 em São Manuel e 18,7 em Avaré (por 100.000). Apenas em Botucatu registrou-se declínio das taxas de mortalidade de 1963 a 1972. A mortalidade específica em adultos jovens ainda era elevada, predominando no sexo masculino, principalmente em Conchas. Sublinhou-se a necessidade de descentralizar as atividades antituberculose para atingir um controle eficiente.

Hipersensibilidade tuberculínica em crianças menores de um ano de idade vacinadas com BCG oral

São relatados os resultados da pesquisa da hipersensibilidade tuberculínica pelo PPD, Rt-23,2UT, em crianças menores de um ano de idade, vacinadas anteriormente com BCG oral, pertencentes a uma área do município de São Paulo. Os resultados mostram que para 790 crianças houve 13,0% de reatores fracos e 16,3% de reatores fortes, com um total de 29,3% de reatores. São feitos comentários sobre a vacinação oral e o baixo percentual de reatores encontrados, no controle tuberculínico pós-vacinal, relativamente aos obtidos com o BCG intradérmico.

Análise da situação da poliomielite em uma amostra de crianças da cidade de São Paulo, com o auxílio de um parâmetro de vigilância epidemiológica

A situação da poliomielite é analisada em uma amostra de crianças de 0-10 anos de idade da cidade de São Paulo, assistidas pelo Hospital Menino Jesus, com o auxílio de um parâmetro de vigilância epidemiológica - o fator r da dinâmica da imunização. Os resultados de um recente inquérito soro-epidemiológico foram transformados matematicamente na curva de crescimento expressa pela função exponencial y = a+(1-a) (1-rt), aumentando-se, com isto, consideravelmente o valor informativo do inquérito. A análise mostrou que pela vacinação oral se imunizaram efetivamente cerca de 50% e 60% do total dos indivíduos da população infantil de 0-10 anos de idade contra os poliovírus dos tipos 1 e 2, respectivamente. Além disto, houve em decorrência da circulação de poliovírus, nesta população, em média, cerca de 85 infecções com poliovírus do tipo 1 e 70 infecções com o poliovírus do tipo 2, por 1.000 habitantes, por ano. Tendo em vista que o coeficiente de morbidade da poliomielite alcança cifras da ordem 31 e 27 casos por 100.000 habitantes, respectivamente nos grupos etários de 0-1 e 1-2 anos de idade, os autores recomendam que não sejam poupados esforços no sentido de que as crianças sejam efetivamente vacinadas dentro do esquema de imunização estabelecido, recebendo a 1ª dose da vacina já aos 2 ou 3 meses de idade.