Étude de la fonction du promoteur foetal A[gamma] dans la régulation de la commutation de l'hémoglobine foetale à adulte

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de la régulation transcriptionnelle du gène Indian Hedgehog et de son rôle dans l'ostéoarthrose

L’Ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire entrainant une dégénérescence du cartilage et une ossification de l’os sous-chondral. Elle touche un Canadien sur 10 et pourtant l’origine de cette pathologie est encore inconnue. Dans le cadre de ce projet, la contribution de deux facteurs de transcription, NFAT1 et PITX1, dans la régulation transcriptionnelle du promoteur d’IHH a été examiné compte tenu de l’implication potentielle de la voie hedgehog (Hh) et de ces facteurs dans la pathogenèse de l’OA. La voie de signalisation Hh régule la croissance et la différenciation des chondrocytes. Indian hedgehog (IHH), l’un des trois membres de la famille Hh, contrôle leur prolifération et leur différenciation.

Régulation transcriptionnelle du gène de la protéine de liaison de la chlorophylle-a et de la péridinine chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.

Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires : détermination du rôle des séquences 3' non traduites

Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit.

Identification de caractéristiques communes et rares dans les ARN structurés dans la base de données Rfam

Les ARN non codants (ARNnc) sont des transcrits d'ARN qui ne sont pas traduits en protéines et qui pourtant ont des fonctions clés et variées dans la cellule telles que la régulation des gènes, la transcription et la traduction. Parmi les nombreuses catégories d'ARNnc qui ont été découvertes, on trouve des ARN bien connus tels que les ARN ribosomiques (ARNr), les ARN de transfert (ARNt), les snoARN et les microARN (miARN). Les fonctions des ARNnc sont étroitement liées à leurs structures d’où l’importance de développer des outils de prédiction de structure et des méthodes de recherche de nouveaux ARNnc. Les progrès technologiques ont mis à la disposition des chercheurs des informations abondantes sur les séquences d'ARN. Ces informations sont accessibles dans des bases de données telles que Rfam, qui fournit des alignements et des informations structurelles sur de nombreuses familles d'ARNnc. Dans ce travail, nous avons récupéré toutes les séquences des structures secondaires annotées dans Rfam, telles que les boucles en épingle à cheveux, les boucles internes, les renflements « bulge », etc. dans toutes les familles d'ARNnc. Une base de données locale, RNAstem, a été créée pour faciliter la manipulation et la compilation des données sur les motifs de structure secondaire. Nous avons analysé toutes les boucles terminales et internes ainsi que les « bulges » et nous avons calculé un score d’abondance qui nous a permis d’étudier la fréquence de ces motifs. Tout en minimisant le biais de la surreprésentation de certaines classes d’ARN telles que l’ARN ribosomal, l’analyse des scores a permis de caractériser les motifs rares pour chacune des catégories d’ARN en plus de confirmer des motifs communs comme les boucles de type GNRA ou UNCG. Nous avons identifié des motifs abondants qui n’ont pas été étudiés auparavant tels que la « tetraloop » UUUU. En analysant le contenu de ces motifs en nucléotides, nous avons remarqué que ces régions simples brins contiennent beaucoup plus de nucléotides A et U. Enfin, nous avons exploré la possibilité d’utiliser ces scores pour la conception d’un filtre qui permettrait d’accélérer la recherche de nouveaux ARN non-codants. Nous avons développé un système de scores, RNAscore, qui permet d’évaluer un ARN en se basant sur son contenu en motifs et nous avons testé son applicabilité avec différents types de contrôles.

Optimisation du promoteur CR5 inductible au cumate.

Les produits biologiques représentent une avenue thérapeutique très prometteuse pour diverses maladies actuellement sans traitement, dont le cancer. La demande pour ces produits est donc très forte et des bioprocédés industriels efficaces et fiables doivent être mis en place pour y répondre. Le système inductible au cumate (CR5) développé par le groupe de Bernard Massie permet d’exprimer des protéines d’intérêt de façon finement régulable et à haut niveau dans les cellules CHO. Un travail d’optimisation est toutefois nécessaire afin de maximiser l’expression tout en améliorant l’étanchéité du système. Dans cette optique, diverses constructions du promoteur comportant des configurations différentes d’espacement entre ses constituants, des transactivateurs comportant des domaines d’activation différents, et une séquence opératrice synthétique ont été testées pour évaluer leur capacité à améliorer le rendement et l’étanchéité du CR5. Ainsi, un protomoteur comportant trois séquences opératrices avec six paires de bases entre chacune de ces dernières s’est montré plus efficace en termes de rendement et d’étanchéité que la configuration actuelle du CR5. De plus, une nouvelle configuration du CR5 où le transactivateur est régulé par le système inductible à la coumermycine a été étudiée et a montré une régulation très fine. Le travail d’optimisation effectué dans ce projet s’applique seulement dans le but d’optimiser un procédé dans des conditions spécifiques. Son application à d’autres lignées cellulaires et d’autres promoteurs reste à démontrer.

Die Rolle des Zelladhäsionsmoleküls L1 in der Tumorprogression

Das neuronale Adhäsionsmolekül L1 wird neben den Zellen des Nervensystems auf vielen humanen Tumoren exprimiert und ist dort mit einer schlechten Prognose für die betroffenen Patienten assoziiert. Zusätzlich zu seiner Funktion als Oberflächenmolekül kann L1 durch membranproximale Spaltung in eine lösliche Form überführt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von L1 auf die Motilität von Tumorzellen untersucht. Lösliches L1 aus Asziten führte zu einer Integrin-vermittelten Zellmigration auf EZM-Substraten. Derselbe Effekt wurde durch Überexpression von L1 in Tumorlinien beobachtet. Weiterhin führt die L1-Expression zu einer erhöhten Invasion, einem verstärkten Tumorwachstum in NOD/SCID Mäusen und zur konstitutiven Aktivierung der MAPK ERK1/2. Eine Mutation in der zytoplasmatischen Domäne von hL1 (Thr1247Ala/Ser1248Ala)(hL1mut) führte hingegen zu einer Blockade dieser Funktionen. Dies weist daraufhin, dass nicht nur lösliches L1, sondern auch die zytoplasmatische Domäne von L1 funktionell aktiv ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Mechanismus, der L1-vermittelten Signaltransduktion untersucht. Die zytoplasmatische Domäne von L1 gelangt nach sequenzieller Proteolyse durch ADAM und Presenilin-abhängiger γ-Sekretase Spaltung in den Zellkern. Diese Translokation im Zusammenspiel mit der Aktivierung der MAPK ERK1/2 durch L1-Expression führt zu einer L1-abhängigen Genregulation. Die zytoplasmatische Domäne von hL1mut konnte ebenfalls im Zellkern detektiert werden, vermittelte jedoch keine Genregulation und unterdrückte die ERK1/2 Phosphorylierung. Die L1-abhängige Induktion von ERK1/2-abhängigen Genen wie Cathepsin B, β3 Integrin und IER 3 war in Zellen der L1-Mutante unterdrückt. Die Expression des Retinsäure-bindenden Proteins CRABP-II, welches in hL1 Zellen supprimiert wird, wurde in der L1-Mutante nicht verändert. Weitere biochemische Untersuchungen zeigen, dass die zytoplasmatische Domäne von L1 Komplexe mit Transkriptionsfaktoren bilden kann, die an Promoterregionen binden können. Die dargestellten Ergebnisse belegen, dass L1-Expression in Tumoren an drei Funktionen beteiligt ist; (i) L1 erhöht Zellmotilität, (ii) fördert Tumorprogression durch Hochregulation von pro-invasiven und proliferationsfördernden Genen nach Translokation in den Nukleus und (iii) schützt die Zellen mittels Regulation pro- bzw. anti-apoptotischer Gene vor Apoptose. Die mutierte Phosphorylierungsstelle im L1-Molekül ist essentiell für diese Prozesse. Die Anwendung neuer Therapien für Patienten mit L1-positiven Karzinomen kann mit Hinblick auf die guten Erfolge der Antikörper-basierenden Therapie mit dem mAk L1-11A diskutiert werden.

Heterochromatin und epigenetische Kontrolle der Centromere in Dictyostelium discoideum

Heterochromatin Protein 1 (HP1) is an evolutionarily conserved protein required for formation of a higher-order chromatin structures and epigenetic gene silencing. The objective of the present work was to functionally characterise HP1-like proteins in Dictyostelium discoideum, and to investigate their function in heterochromatin formation and transcriptional gene silencing. The Dictyostelium genome encodes three HP1-like proteins (hcpA, hcpB, hcpC), from which only two, hcpA and hcpB, but not hcpC were found to be expressed during vegetative growth and under developmental conditions. Therefore, hcpC, albeit no obvious pseudogene, was excluded from this study. Both HcpA and HcpB show the characteristic conserved domain structure of HP1 proteins, consisting of an N-terminal chromo domain and a C-terminal chromo shadow domain, which are separated by a hinge. Both proteins show all biochemical activities characteristic for HP1 proteins, such as homo- and heterodimerisation in vitro and in vivo, and DNA binding activtity. HcpA furthermore seems to bind to K9-methylated histone H3 in vitro. The proteins thus appear to be structurally and functionally conserved in Dictyostelium. The proteins display largely identical subnuclear distribution in several minor foci and concentration in one major cluster at the nuclear periphery. The localisation of this cluster adjacent to the nucleus-associated centrosome and its mitotic behaviour strongly suggest that it represents centromeric heterochromatin. Furthermore, it is characterised by histone H3 lysine-9 dimethylation (H3K9me2), which is another hallmark of Dictyostelium heterochromatin. Therefore, one important aspect of the work was to characterise the so-far largely unknown structural organisation of centromeric heterochromatin. The Dictyostelium homologue of inner centromere protein INCENP (DdINCENP), co-localized with both HcpA and H3K9me2 during metaphase, providing further evidence that H3K9me2 and HcpA/B localisation represent centromeric heterochromatin. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed that two types of high-copy number retrotransposons (DIRS-1 and skipper), which form large irregular arrays at the chromosome ends, which are thought to contain the Dictyostelium centromeres, are characterised by H3K9me2. Neither overexpression of full-length HcpA or HcpB, nor deletion of single Hcp isoforms resulted in changes in retrotransposon transcript levels. However, overexpression of a C-terminally truncated HcpA protein, assumed to display a dominant negative effect, lead to an increase in skipper retrotransposon transcript levels. Furthermore, overexpression of this protein lead to severe growth defects in axenic suspension culture and reduced cell viability. In order to elucidate the proteins functions in centromeric heterochromatin formation, gene knock-outs for both hcpA and hcpB were generated. Both genes could be successfully targeted and disrupted by homologous recombination. Surprisingly, the degree of functional redundancy of the two isoforms was, although not unexpected, very high. Both single knock-out mutants did not show any obvious phenotypes under standard laboratory conditions and only deletion of hcpA resulted in subtle growth phenotypes when grown at low temperature. All attempts to generate a double null mutant failed. However, both endogenous genes could be disrupted in cells in which a rescue construct that ectopically expressed one of the isoforms either with N-terminal 6xHis- or GFP-tag had been introduced. The data imply that the presence of at least one Hcp isoform is essential in Dictyostelium. The lethality of the hcpA/hcpB double mutant thus greatly hampered functional analysis of the two genes. However, the experiment provided genetic evidence that the GFP-HcpA fusion protein, because of its ability to compensate the loss of the endogenous HcpA protein, was a functional protein. The proteins displayed quantitative differences in dimerisation behaviour, which are conferred by the slightly different hinge and chromo shadow domains at the C-termini. Dimerisation preferences in increasing order were HcpA-HcpA << HcpA-HcpB << HcpB-HcpB. Overexpression of GFP-HcpA or a chimeric protein containing the HcpA C-terminus (GFP-HcpBNAC), but not overexpression of GFP-HcpB or GFP-HcpANBC, lead to increased frequencies of anaphase bridges in late mitotic cells, which are thought to be caused by telomere-telomere fusions. Chromatin targeting of the two proteins is achieved by at least two distinct mechanisms. The N-terminal chromo domain and hinge of the proteins are required for targeting to centromeric heterochromatin, while the C-terminal portion encoding the CSD is required for targeting to several other chromatin regions at the nuclear periphery that are characterised by H3K9me2. Targeting to centromeric heterochromatin likely involves direct binding to DNA. The Dictyostelium genome encodes for all subunits of the origin recognition complex (ORC), which is a possible upstream component of HP1 targeting to chromatin. Overexpression of GFP-tagged OrcB, the Dictyostelium Orc2 homologue, showed a distinct nuclear localisation that partially overlapped with the HcpA distribution. Furthermore, GFP-OrcB localized to the centrosome during the entire cell cycle, indicating an involvement in centrosome function. DnmA is the sole DNA methyltransferase in Dictyostelium required for all DNA(cytosine-)methylation. To test for its in vivo activity, two different cell lines were established that ectopically expressed DnmA-myc or DnmA-GFP. It was assumed that overexpression of these proteins might cause an increase in the 5-methyl-cytosine(5-mC)-levels in the genomic DNA due to genomic hypermethylation. Although DnmA-GFP showed preferential localisation in the nucleus, no changes in the 5-mC-levels in the genomic DNA could be detected by capillary electrophoresis.

Global transcript analysis of rice leaf and seed using SAGE technology.

We have compiled two comprehensive gene expression profiles from mature leaf and immature seed tissue of rice (Oryza sativa ssp. japonica cultivar Nipponbare) using Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) technology. Analysis revealed a total of 50 519 SAGE tags, corresponding to 15 131 unique transcripts. Of these, the large majority (approximately 70%) occur only once in both libraries. Unexpectedly, the most abundant transcript (approximately 3% of the total) in the leaf library was derived from a type 3 metallothionein gene. The overall frequency profiles of the abundant tag species from both tissues differ greatly and reveal seed tissue as exhibiting a non-typical pattern of gene expression characterized by an over abundance of a small number of transcripts coding for storage proteins. A high proportion ( approximately 80%) of the abundant tags (> or = 9) matched entries in our reference rice EST database, with many fewer matches for low abundant tags. Singleton transcripts that are common to both tissues were collated to generate a summary of low abundant transcripts that are expressed constitutively in rice tissues. Finally and most surprisingly, a significant number of tags were found to code for antisense transcripts, a finding that suggests a novel mechanism of gene regulation, and may have implications for the use of antisense constructs in transgenic technology.

Transcriptome analysis and crop improvement (a review)

The identification and characterization of differential gene expression from tissues subjected to stress has gained much attention in plant research. The recognition of elements involved in the response to a particular stress enhances the possibility of promoting crop improvement through direct genetic modification. However, the performance of some of the 'first generation' of transgenic plants with the incorporation of a single gene has not always been as expected. These results have stimulated the development of new transgenic constructions introducing more than one gene and capable of modifying complex pathways. Several techniques are available to conduct the analysis of gene regulation, with such information providing the basis for novel constructs specifically designed to modify metabolism. This review deals with techniques that allow the identification and characterization of differentially-expressed genes and the use of molecular pathway information to produce transgenic plants.

Genistein blocks homocysteine-induced alterations in the proteome of human endothelial cells

Dietary isoflavones from soy are suggested to protect endothelial cells from damaging effects of endothelial stressors and thereby to prevent atherosclerosis. In search of the molecular targets of isoflavone action, we analyzed the effects of the major soy isoflavone, genistein, on changes in protein expression levels induced by the endothelial stressor homocysteine (Hcy) in EA.hy 926 endothelial cells. Proteins from cells exposed for 24 h to 25 mu M Hcy alone or in combination with 2.5 mu M genistein were separated by two-dimensional gel electrophoresis and those with altered spot intensities were identified by peptide mass fingerprinting, Genistein reversed Hcy-induced changes of proteins involved in metabolism, detoxification, and gene regulation: and some of those effects can be linked functionally to the antiatherosclerotic properties of the soy isoflavone. Alterations of steady-state levels of cytoskeletal proteins by genistein suggested an effect oil apoptosis. As a matter of fact genistein caused inhibition of Hcy-mediated apoptotic cell death as indicated by inhibition of DNA fragmentation and chromatin condensation. In conclusion, proteome analysis allows the rapid identification of cellular target proteins of genistein action in endothelial cells exposed to the endothelial stressor Hcy and therefore enables the identification of molecular pathways of its antiatherosclerotic action

Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in three rice cultivars reveals its preferential localization in transcriptionally silent transposable element genes

5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), a modified form of cytosine that is considered the sixth nucleobase in DNA, has been detected in mammals and is believed to play an important role in gene regulation. In this study, 5hmC modification was detected in rice by employing a dot-blot assay, and its levels was further quantified in DNA from different rice tissues using liquid chromatography-multistage mass spectrometry (LC-MS/MS/MS). The results showed large intertissue variation in 5hmC levels. The genome-wide profiles of 5hmC modification in three different rice cultivars were also obtained using a sensitive chemical labelling followed by a next-generation sequencing method. Thousands of 5hmC peaks were identified, and a comparison of the distributions of 5hmC among different rice cultivars revealed the specificity and conservation of 5hmC modification. The identified 5hmC peaks were significantly enriched in heterochromatin regions,and mainly located in transposable element (TE) genes, especially around retrotransposons. The correlation analysis of 5hmC and gene expression data revealed a close association between 5hmC and silent TEs. These findings provide a resource for plant DNA 5hmC epigenetic studies and expand our knowledge of 5hmC modification.

Inter-plant communication through mycorrhizal networks mediates complex adaptive behaviour in plant communities

Adaptive behaviour of plants, including rapid changes in physiology, gene regulation and defence response, can be altered when linked to neighbouring plants by a mycorrhizal network (MN). Mechanisms underlying the behavioural changes include mycorrhizal fungal colonization by the MN or interplant communication via transfer of nutrients, defence signals or allelochemicals. We focus this review on our new findings in ectomycorrhizal ecosystems, and also review recent advances in arbuscular mycorrhizal systems. We have found that the behavioural changes in ectomycorrhizal plants depend on environmental cues, the identity of the plant neighbour and the characteristics of the MN. The hierarchical integration of this phenomenon with other biological networks at broader scales in forest ecosystems, and the consequences we have observed when it is interrupted, indicate that underground ‘tree talk’ is a foundational process in the complex adaptive nature of forest ecosystems.

Fur controls iron homeostasis and oxidative stress defense in the oligotrophic alpha-proteobacterium Caulobacter crescentus

In most bacteria, the ferric uptake regulator (Fur) is a global regulator that controls iron homeostasis and other cellular processes, such as oxidative stress defense. In this work, we apply a combination of bioinformatics, in vitro and in vivo assays to identify the Caulobacter crescentus Fur regulon. A C. crescentus fur deletion mutant showed a slow growth phenotype, and was hypersensitive to H(2)O(2) and organic peroxide. Using a position weight matrix approach, several predicted Fur-binding sites were detected in the genome of C. crescentus, located in regulatory regions of genes not only involved in iron uptake and usage but also in other functions. Selected Fur-binding sites were validated using electrophoretic mobility shift assay and DNAse I footprinting analysis. Gene expression assays revealed that genes involved in iron uptake were repressed by iron-Fur and induced under conditions of iron limitation, whereas genes encoding iron-using proteins were activated by Fur under conditions of iron sufficiency. Furthermore, several genes that are regulated via small RNAs in other bacteria were found to be directly regulated by Fur in C. crescentus. In conclusion, Fur functions as an activator and as a repressor, integrating iron metabolism and oxidative stress response in C. crescentus.