MEKK1 phosphorylates MEK1 and MEK2 but does not cause activation of mitogen-activated protein kinase.

A constitutively active fragment of rat MEK kinase 1 (MEKK1) consisting of only its catalytic domain (MEKK-C) expressed in bacteria quantitatively activates recombinant mitogen-activated protein (MAP) kinase/extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) kinases 1 and 2 (MEK1 and MEK2) in vitro. Activation of MEK1 by MEKK-C is accompanied by phosphorylation of S218 and S222, which are also phosphorylated by the protein kinases c-Mos and Raf-1. MEKK1 has been implicated in regulation of a parallel but distinct cascade that leads to phosphorylation of N-terminal sites on c-Jun; thus, its role in the MAP kinase pathway has been questioned. However, in addition to its capacity to phosphorylate MEK1 in vitro, MEKK-C interacts with MEK1 in the two-hybrid system, and expression of mouse MEKK1 or MEKK-C in mammalian cells causes constitutive activation of both MEK1 and MEK2. Neither cotransfected nor endogenous ERK2 is highly activated by MEKK1 compared to its stimulation by epidermal growth factor in spite of significant activation of endogenous MEK. Thus, other as yet undefined mechanisms may be involved in determining information flow through the MAP kinase and related pathways.

Identification of NAB1, a repressor of NGFI-A- and Krox20-mediated transcription.

NGFI-A (also called Egr1, Zif268, or Krox24) and the closely related proteins Krox20, NGFI-C, and Egr3 are zinc-finger transcription factors encoded by immediate-early genes which are induced by a wide variety of extracellular stimuli. NGFI-A has been implicated in cell proliferation, macrophage differentiation, synaptic activation, and long-term potentiation, whereas Krox20 is critical for proper hindbrain segmentation and peripheral nerve myelination. In previous work, a structure/function analysis of NGFI-A revealed a 34-aa inhibitory domain that was hypothesized to be the target of a cellular factor that represses NGFI-A transcriptional activity. Using the yeast two-hybrid system, we have isolated a cDNA clone which encodes a protein that interacts with this inhibitory domain and inhibits the ability of NGFI-A to activate transcription. This NGFI-A-binding protein, NAB1, is a 570-aa nuclear protein that bears no obvious sequence homology to known proteins. NAB1 also represses Krox20 activity, but it does not influence Egr3 or NGFI-G, thus providing a mechanism for the differential regulation of this family of immediate-early transcription factors.

Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins.

The repair of DNA double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae requires genes of the RAD52 epistasis group, of which RAD55 and RAD57 are members. Here, we show that the x-ray sensitivity of rad55 and rad57 mutant strains is suppressible by overexpression of RAD51 or RAD52. Virtually complete suppression is provided by the simultaneous overexpression of RAD51 and RAD52. This suppression occurs at 23 degrees C, where these mutants are more sensitive to x-rays, as well as at 30 degrees C and 36 degrees C. In addition, a recombination defect of rad55 and rad57 mutants is similarly suppressed. Direct in vivo interactions between the Rad51 and Rad55 proteins, and between Rad55 and Rad57, have also been identified by using the two-hybrid system. These results indicate that these four proteins constitute part of a complex, a "recombinosome," to effect the recombinational repair of double-strand breaks.

Cyclin-dependent protein kinase and cyclin homologs SSN3 and SSN8 contribute to transcriptional control in yeast.

The SSN3 and SSN8 genes of Saccharomyces cerevisiae were identified by mutations that suppress a defect in SNF1, a protein kinase required for release from glucose repression. Mutations in SSN3 and SSN8 also act synergistically with a mutation of the MIG1 repressor protein to relieve glucose repression. We have cloned the SSN3 and SSN8 genes. SSN3 encodes a cyclin-dependent protein kinase (cdk) homolog and is identical to UME5. SSN8 encodes a cyclin homolog 35% identical to human cyclin C. SSN3 and SSN8 fusion proteins interact in the two-hybrid system and coimmunoprecipitate from yeast cell extracts. Using an immune complex assay, we detected protein kinase activity that depends on both SSN3 and SSN8. Thus, the two SSN proteins are likely to function as a cdk-cyclin pair. Genetic analysis indicates that the SSN3-SSN8 complex contributes to transcriptional repression of diversely regulated genes and also affects induction of the GAL1 promoter.

Repression by SSN6-TUP1 is directed by MIG1, a repressor/activator protein.

The SSN6-TUP1 protein complex represses transcription of diversely regulated genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Here we present evidence that MIG1, a zinc-finger protein in the EGR1/Zif268 family, recruits SSN6-TUP1 to glucose-repressed promoters. DNA-bound LexA-MIG1 represses transcription of a target gene in glucose-grown cells, and repression requires SSN6 and TUP1. We also show that MIG1 and SSN6 fusion proteins interact in the two-hybrid system. Unexpectedly, we found that LexA-MIG1 activates transcription strongly in an ssn6 mutant and weakly in a tup1 mutant. Finally, LexA-MIG1 does not repress transcription in glucose-deprived cells, and MIG1 is differentially phosphorylated in response to glucose availability. We suggest a role for phosphorylation in regulating repression.

Mapeamento global de interações proteicas nas vias de sinalização mediadas por c-di-GMP de Pseudomonas aeruginosa

A persistência bacteriana correlacionada à formação de biofilmes bacterianos é, há algum tempo, fonte de grande preocupação médica em virtude de sua ampla associação com a dificuldade de tratamento de infecções crônicas. Por outro lado, as perspectivas de utilização de biofilmes bacterianos em novas aplicações biotecnológicas e até mesmo para fins terapêuticos são promissoras. Há, portanto, grande interesse em compreender os mecanismos que levam as células bacterianas a deixar o estado planctônico, de vida livre, e associarem-se nesses conglomerados celulares altamente complexos. Ao longo das últimas décadas, o segundo mensageiro c-di-GMP – em conjunto com as moléculas que catalisam sua síntese (diguanilato ciclases) e sua degradação (fosfodiesterases) e seus receptores – estabeleceu-se como um elemento central de regulação de uma série de respostas celulares que determinam a formação ou a dispersão de biofilmes. Curiosamente, as proteínas que participam do metabolismo deste segundo mensageiro estão, frequentemente, codificadas múltiplas vezes em um mesmo genoma bacteriano. Em vista dessa observação, estudos mais recentes apontam que, para reger paralelamente uma variedade tão ampla de fenótipos, este sistema opera em modo de alta especificidade de sinalização e que, portanto, o sinal metabolizado por determinados conjuntos de diguanilato ciclases e fosfodiesterases tem alvos celulares específicos. Evidências robustas, porém isoladas até o momento, apontaram que um dos meios pelo qual ocorre a segregação entre sinal produzido e alvo específico é a interação direta entre as proteínas componentes das vias de sinalização. Mais, demonstrou-se que, em algumas vias, a transmissão de sinal ocorre exclusivamente via interação proteica, dispensando a intermediação do sinalizador em si. Para avaliar a validade e relevância global deste mecanismo, propôs-se, neste estudo, a investigação da rede total de interações entre as proteínas tipicamente associadas às vias de sinalização por c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, utilizando ensaios de duplo-hibrido bacteriano. Para tanto, foram construídas duas bibliotecas de DNA direcionadas e foram feitos testes de interação de forma estratégica para possibilitar o esgotamento e averiguação de todas as possíveis interações entre as proteínas alvo identificadas. O resultado obtido, um mapa inicial, porém abrangente, da rede de interações proteicas em P. aeruginosa, indica uma grande probabilidade de que os mecanismos previamente descritos sejam realmente recorrentes e relevantes para o intermédio da sinalização nesse organismo. Algumas das interações mais robustas encontradas são bastante interessantes e serão, em estudos futuros, mais extensivamente estudadas.

Identificação e caracterização de RNA mensageiros candidatos a alvo das proteínas PUMILHO de Arabidopsis através do sistema triplo-híbrido de levedura

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas.

The impact of a future solar minimum on climate change projections in the Northern Hemisphere

Solar variability represents a source of uncertainty in the future forcings used in climate model simulations. Current knowledge indicates that a descent of solar activity into an extended minimum state is a possible scenario. With aid of experiments from a state-of-the-art Earth system model, we investigate the impact of a future solar minimum on Northern Hemisphere climate change projections. This scenario is constructed from recent 11 year solar-cycle minima of the solar spectral irradiance, and is therefore more conservative than the 'grand' minima employed in some previous modeling studies. Despite the small reduction in total solar irradiance (0.36 W m^-2), relatively large responses emerge in the winter Northern Hemisphere, with a reduction in regional-scale projected warming by up to 40%. To identify the origin of the enhanced regional signals, we assess the role of the different mechanisms by performing additional experiments forced only by irradiance changes at different wavelengths of the solar spectrum. We find that a reduction in visible irradiance drives changes in the stationary wave pattern of the North Pacific and sea-ice cover. A decrease in UV irradiance leads to smaller surface signals, although its regional effects are not negligible. These results point to a distinct but additive role of UV and visible irradiance in the Earth's climate, and stress the need to account for solar forcing as a source of uncertainty in regional scale projections.

Experiências do desenvolvimento de transformador para alta temperatura baseado em isolação semi-híbrida e óleo vegetal isolante.

O transformador de potência é um importante equipamento utilizado no sistema elétrico de potência, responsável por transmitir energia elétrica ou potência elétrica de um circuito a outro e transformar tensões e correntes de um circuito elétrico. O transformador de potência tem ampla aplicação, podendo ser utilizado em subestações de usinas de geração, transmissão e distribuição. Neste sentido, mudanças recentes ocorridas no sistema elétrico brasileiro, causadas principalmente pelo aumento considerável de carga e pelo desenvolvimento tecnológico tem proporcionado a fabricação de um transformador com a aplicação de alta tecnologia, aumentando a confiabilidade deste equipamento e, em paralelo, a redução do seu custo global. Tradicionalmente, os transformadores são fabricados com um sistema de isolação que associa isolantes sólidos e celulose, ambos, imersos em óleo mineral isolante, constituição esta que define um limite à temperatura operacional contínua. No entanto, ao se substituir este sistema de isolação formado por papel celulose e óleo mineral isolante por um sistema de isolação semi- híbrida - aplicação de papel NOMEX e óleo vegetal isolante, a capacidade de carga do transformador pode ser aumentada por suportar maiores temperaturas. Desta forma, o envelhecimento do sistema de isolação poderá ser em longo prazo, significativamente reduzido. Esta técnica de aumentar os limites térmicos do transformador pode eliminar, essencialmente, as restrições térmicas associadas à isolação celulósica, provendo uma solução econômica para aperfeiçoar o uso de transformadores de potência, aumentando a sua confiabilidade operacional. Adicionalmente, à aplicação de sensores de fibra óptica, em substituição aos sensores de imagem térmica no monitoramento das temperaturas internas do transformador, se apresentam como importante opção na definição do equacionamento do comportamento do transformador sob o ponto de vista térmico.

Extração de casos de teste utilizando Redes de Petri hierárquicas e validação de resultados utilizando OWL.

Este trabalho propõe dois métodos para teste de sistemas de software: o primeiro extrai ideias de teste de um modelo desenvolvido em rede de Petri hierárquica e o segundo valida os resultados após a realização dos testes utilizando um modelo em OWL-S. Estes processos aumentam a qualidade do sistema desenvolvido ao reduzir o risco de uma cobertura insuficiente ou teste incompleto de uma funcionalidade. A primeira técnica apresentada consiste de cinco etapas: i) avaliação do sistema e identificação dos módulos e entidades separáveis, ii) levantamento dos estados e transições, iii) modelagem do sistema (bottom-up), iv) validação do modelo criado avaliando o fluxo de cada funcionalidade e v) extração dos casos de teste usando uma das três coberturas de teste apresentada. O segundo método deve ser aplicado após a realização dos testes e possui cinco passos: i) primeiro constrói-se um modelo em OWL (Web Ontology Language) do sistema contendo todas as informações significativas sobre as regras de negócio da aplicação, identificando as classes, propriedades e axiomas que o regem; ii) em seguida o status inicial antes da execução é representado no modelo através da inserção das instâncias (indivíduos) presentes; iii) após a execução dos casos de testes, a situação do modelo deve ser atualizada inserindo (sem apagar as instâncias já existentes) as instâncias que representam a nova situação da aplicação; iv) próximo passo consiste em utilizar um reasoner para fazer as inferências do modelo OWL verificando se o modelo mantém a consistência, ou seja, se não existem erros na aplicação; v) finalmente, as instâncias do status inicial são comparadas com as instâncias do status final, verificando se os elementos foram alterados, criados ou apagados corretamente. O processo proposto é indicado principalmente para testes funcionais de caixa-preta, mas pode ser facilmente adaptado para testes em caixa branca. Obtiveram-se casos de testes semelhantes aos que seriam obtidos em uma análise manual mantendo a mesma cobertura do sistema. A validação provou-se condizente com os resultados esperados, bem como o modelo ontológico mostrouse bem fácil e intuitivo para aplicar manutenções.

Sistema Nacional de Salud español. Características y análisis

La Ley General de Sanidad 14/1986 de 25 de Abril posibilitó el tránsito del antiguo modelo de Seguridad Social al actual modelo de Sistema Nacional de Salud (SNS), financiado con impuestos y de cobertura prácticamente universal. Desde entonces se han producido profundos cambios en el sistema que culminaron en el año 2002 con la descentralización total de competencias en materia de salud en las Comunidades Autónomas. La regulación nacional de competencias en materia de salud se realiza desde el Consejo Interterritorial del Sistema Nacional de Salud, organismo que agrupa a los máximos responsables autonómicos en materia de salud de cada Comunidad Autónoma y que tiene entre otras, la responsabilidad de evitar las desigualdades en servicios sanitarios dentro del territorio nacional. La creación y competencias del Consejo Interterritorial quedan recogidas en la Ley 16/2003 de 28 de mayo de Cohesión de la calidad del Sistema Nacional de Salud. La cartera de servicios comunes del SNS se establece en el Real Decreto 1030/2006 de 15 de Septiembre, actualizando el Real Decreto 63/1995 de 20 de enero sobre Ordenación de las prestaciones sanitarias, resultando del actual marco legislativo con la descentralización de competencias y gestión de los presupuestos un horizonte de posible variabilidad en los modelos de gestión de cada CCAA, que, si bien deben garantizar la universalidad de las prestaciones, también ofrece una diversidad de modalidades de gestionar los recursos en materia de salud. En cuanto al estado de salud de los españoles, destacar que la esperanza de vida al nacer se sitúa en 79,9 años, superior a la media europea, 78,3 años, y la esperanza de vida ajustada por incapacidad fue en 2002 de 72,6 años en España respecto a los 70,8 de la UE. Según cifras del propio Ministerio de Sanidad, la percepción de la salud de los ciudadanos fue positiva para un 73% de los hombres y un 63,2 de las mujeres. Alrededor del 60% de la población tiene un peso normal y la morbilidad sitúa en los primeros lugares las enfermedades del aparato circulatorio, el cáncer y las enfermedades del aparato respiratorio (CIE-9). El gasto sanitario en España, es un capítulo presupuestario importante, al situarse en torno al 7,5 del P.I.B, y los recursos e inversiones presentan aparentes desigualdades autonómicas. Los modelos de gestión y dependencia patrimonial de los recursos, variables entre Autonomías, plantean la necesidad de monitorizar un seguimiento que permita evaluar en los próximos diez años el impacto de la descentralización de competencias del Sistema. La estructura del Sistema tiene dos niveles asistenciales mayoritarios, atención primaria y especializada, absorbiendo la atención especializada la mayor parte del presupuesto. El incremento del gasto sanitario y la universalidad de las prestaciones han condicionado en gran medida la implantación de modelos de gestión diferentes a los tradicionales. Esta situación no es exclusiva del Estado Español. En los Estados del entorno de la Unión Europea, el Consejo de Ministros de Sanidad de la UE en su sesión celebrada los días 1 y 2 de Junio de 200625 concluyeron un documento que recoge los valores y principios comunes de los sistemas sanitarios de los países de la Unión Europea, resaltando los principios y valores de los sistemas sanitarios como soporte estructural de dichos estados. Como conclusión, en este momento (2007) el Sistema Nacional de Salud Español, está inmerso en un proceso de trasformación orientado a garantizar la eficiencia de las prestaciones de manera responsable, es decir, ofertar al ciudadano la mejor calidad de servicios al mínimo coste.

Optimização de um sistema híbrido off-grid PV, Gerador Diesel e Baterias

Tese de mestrado integrado, Engenharia da Energia e do Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016

Host insulin stimulates Echinococcus multilocularis insulin signalling pathways and larval development.

BACKGROUND The metacestode of the tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis, a lethal zoonosis. Infections are initiated through establishment of parasite larvae within the intermediate host's liver, where high concentrations of insulin are present, followed by tumour-like growth of the metacestode in host organs. The molecular mechanisms determining the organ tropism of E. multilocularis or the influences of host hormones on parasite proliferation are poorly understood. RESULTS Using in vitro cultivation systems for parasite larvae we show that physiological concentrations (10 nM) of human insulin significantly stimulate the formation of metacestode larvae from parasite stem cells and promote asexual growth of the metacestode. Addition of human insulin to parasite larvae led to increased glucose uptake and enhanced phosphorylation of Echinococcus insulin signalling components, including an insulin receptor-like kinase, EmIR1, for which we demonstrate predominant expression in the parasite's glycogen storage cells. We also characterized a second insulin receptor family member, EmIR2, and demonstrated interaction of its ligand binding domain with human insulin in the yeast two-hybrid system. Addition of an insulin receptor inhibitor resulted in metacestode killing, prevented metacestode development from parasite stem cells, and impaired the activation of insulin signalling pathways through host insulin. CONCLUSIONS Our data indicate that host insulin acts as a stimulant for parasite development within the host liver and that E. multilocularis senses the host hormone through an evolutionarily conserved insulin signalling pathway. Hormonal host-parasite cross-communication, facilitated by the relatively close phylogenetic relationship between E. multilocularis and its mammalian hosts, thus appears to be important in the pathology of alveolar echinococcosis. This contributes to a closer understanding of organ tropism and parasite persistence in larval cestode infections. Furthermore, our data show that Echinococcus insulin signalling pathways are promising targets for the development of novel drugs.

High-resolution pollen record of ODP Hole 175-1078C

To address the connection between tropical African vegetation development and high-latitude climate change we present a high-resolution pollen record from ODP Site 1078 (off Angola) covering the period 50-10 ka BP. Although several tropical African vegetation and climate reconstructions indicate an impact of Heinrich Stadials (HSs) in Southern Hemisphere Africa, our vegetation record shows no response. Model simulations conducted with an Earth System Model of Intermediate Complexity including a dynamical vegetation component provide one possible explanation. Because both precipitation and evaporation increased during HSs and their effects nearly cancelled each other, there was a negligible change in moisture supply. Consequently, the resulting climatic response to HSs might have been too weak to noticeably affect the vegetation composition in the study area. Our results also show that the response to HSs in southern tropical Africa neither equals nor mirrors the response to abrupt climate change in northern Africa.

Tyre-force estimation by Kalman inverse filtering: applications to off-highway mining trucks

Kalman inverse filtering is used to develop a methodology for real-time estimation of forces acting at the interface between tyre and road on large off-highway mining trucks. The system model formulated is capable of estimating the three components of tyre-force at each wheel of the truck using a practical set of measurements and inputs. Good tracking is obtained by the estimated tyre-forces when compared with those simulated by an ADAMS virtual-truck model. A sensitivity analysis determines the susceptibility of the tyre-force estimates to uncertainties in the truck's parameters.