Impact of sub-inhibitory concentrations of amoxicillin on helicobacter pylori virulence factors

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização funcional e estrutural das proteínas RUV-1 e RUV-2 do fungo Neurospora crassa

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Heat stress induced alteration in bovine oocytes: functional and cellular aspects

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Identification of epsilon PKC Targets During Cardiac Ischemic Injury

Background: Epsilon-protein kinase C (epsilon PKC) protects the heart from ischemic injury. However, the mechanism(s) of epsilon PKC cardioprotection is still unclear. Identification of the epsilon PKC targets may aid in elucidating the epsilon PKC-mediated cardioprotective mechanisms. Previous studies, using epsilon PKC transgenic mice and difference in gel electrophoresis, identified proteins involved in glucose metabolism, the expression of which was modified by epsilon PKC. Those studies were accompanied by metabolomic analysis, suggesting that increased glucose oxidation may be responsible for the cardioprotective effect of epsilon PKC. Whether these epsilon PKC-mediated alterations were because of differences in protein expression or phosphorylation was not determined. Methods and Results: In the present study, we used an epsilon PKC -specific activator peptide, psi epsilon RACK, combined with phosphoproteomics, to find epsilon PKC targets, and identified that the proteins whose phosphorylation was altered by selective activation of epsilon PKC were mostly mitochondrial proteins. Analysis of the mitochondrial phosphoproteome led to the identification of 55 spots, corresponding to 37 individual proteins, exclusively phosphorylated, in the presence of psi epsilon RACK. The majority of the proteins identified were involved in glucose and lipid metabolism, components of the respiratory chain as well as mitochondrial heat shock proteins. Conclusions: The protective effect of epsilon PKC during ischemia involves phosphorylation of several mitochondrial proteins involved in glucose and lipid metabolism and oxidative phosphorylation. Regulation of these metabolic pathways by epsilon PKC phosphorylation may lead to epsilon PKC-mediated cardioprotection induced by psi epsilon RACK. (Circ J 2012; 76: 1476-1485)

Molecular Characterization of the Putative Transcription Factor SebA Involved in Virulence in Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus is a major opportunistic pathogen and allergen of mammals. Nutrient sensing and acquisition mechanisms, as well as the capability to cope with different stressing conditions, are essential for A. fumigatus virulence and survival in the mammalian host. This study characterized the A. fumigatus SebA transcription factor, which is the putative homologue of the factor encoded by Trichoderma atroviride seb1. The Delta sebA mutant demonstrated reduced growth in the presence of paraquat, hydrogen peroxide, CaCl2, and poor nutritional conditions, while viability associated with sebA was also affected by heat shock exposure. Accordingly, SebA:GFP (SebA:green fluorescent protein) was shown to accumulate in the nucleus upon exposure to oxidative stress and heat shock conditions. In addition, genes involved in either the oxidative stress or heat shock response had reduced transcription in the Delta sebA mutant. The A. fumigatus Delta sebA strain was attenuated in virulence in a murine model of invasive pulmonary aspergillosis. Furthermore, killing of the Delta sebA mutant by murine alveolar macrophages was increased compared to killing of the wild-type strain. A. fumigatus SebA plays a complex role, contributing to several stress tolerance pathways and growth under poor nutritional conditions, and seems to be integrated into different stress responses.

Characterization of anti-silencing factor 1 in Leishmania major

Anti-silencing factor 1 (ASF1) is a histone chaperone that contributes to the histone deposition during nucleosome assembly in newly replicated DNA. It is involved in chromatin disassembly, transcription activation and in the cellular response to DNA damage. In Leishmania major the ASF1 gene (LmASF1) is located in chromosome 20 and codes for a protein showing 67% of identity with the Trypanosoma brucei TbASF1a. Compared to orthologous proteins, LmASF1 conserves the main residues relevant for its various biological functions. To study ASF1 in Leishmania we generated a mutant overexpressing LmASF1 in L. major. We observed that the excess of LmASF1 impaired promastigotes growth rates and had no impact on cell cycle progress. Differently from yeast, ASF1 overproduction in Leishmania did not affect expression levels of genes located on telomeres, but led to an upregulation of proteins involved in chromatin remodelling and physiological stress, such as heat shock proteins, oxidoreductase activity and proteolysis. In addition, we observed that LmASF1 mutant is more susceptible to the DNA damaging agent, methyl methane sulphonate, than the control line. Therefore, our study suggests that ASF1 from Leishmania pertains to the chromatin remodelling machinery of the parasite and acts on its response to DNA damage.

Analyse immunologischer und proteomischer Aspekte im Rahmen der Glaukompathogenese

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verstärkt die Beteiligung autoreaktiver Antikörper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantikörper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte geklärt werden, inwieweit die Immunreaktivitäten dieser beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantikörper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antikörper-basierenden immunologischen Vorgänge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark ähneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantikörper-Reaktionen für die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion möglicher veränderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu ermöglichen, wurde das Verfahren des Antikörper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegenübergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verstärkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erhöhte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung möglicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. Ähnliches konnte für verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-α, IFN-γ oder IL1-β beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verstärktem Maße detektiert werden konnten. Die erhöhte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zurückzuführen, ein Ereignis für das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgelöst, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Darüber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Veränderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, begünstigen bzw. verstärken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungeklärt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn

Pathomechanische Analysen zum Untergang retinaler Ganglienzellen im experimentellen autoimmunen Glaukom-Modell

In den vergangenen Jahren konnten zahlreiche Studien die Veränderung des natürlichen Autoantikörperrepertoirs bei Glaukompatienten aufzeigen. Zu den Antigenen zählen verschiedenen Hitzeschockproteinen, aber ebenso neuronal assoziierte Strukturproteine wie das Myelin basische Protein (MBP) oder das sauren Gliafaserprotein und einige neuropyhsiologische Proteine aus der Retina und dem Sehnerven. Da bei den Glaukompatienten nicht einzelne Antikörperreaktionen verändert sind, sondern vielmehr komplexe Autoantikörpermuster vorliegen, bestand das primäre Ziel der Dissertation zu zeigen, ob eine systemische Immunisierung mit MBP, Homogenaten opticus-assoziierter Antigene (ONA) und Antigenen der retinalen Ganglienzellschicht (RGA) den Verlust von retinalen Ganglienzellen (RGZ) in einem Experimentellen Autoimmunen Glaukom (EAG) Tiermodell auslösen können. Die systemische Injektion von MBP, ONA oder RGA induzierten ophthalmopathologische Veränderungen in der Retina, gekennzeichnet durch retinalen Ganglienzellverlust mitsamt Zerstörung der Axone im Sehnerv. Unter der Annahme, dass die Neurodegeneration durch Autoantiköper vermittelt ist, wurde ebenfalls untersucht, ob sich die Antikörperreaktivität gegen okulare Strukturen oder den Sehnerv im Verlauf der Studie verändern. Getestet wurde die Antikörperreaktivität gegen Gewebsschnitte gesunder Tiere mit dem Ergebnis einer signifikanten und zeitabhängigen Zunahme der Immunreaktivität. Darüber hinaus war es erstmals möglich die Ablagerung von IgG Autoantikörpern in der Retina und dem Sehnerv nachzuweisen sowie die Caspase mediierte Apoptose zu untersuchen. Ebenfalls konnte die Verteilung von aktivierten Mikroglia im optischen System evaluiert werden, wobei diese mehrmals in Kolokalisation mit den IgG-Autoantikörpern auftraten. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass die Immunreaktionen von Autoantikörpern alleine und im Zusammenspiel mit der Mikroglia im Zusammenhang mit der Neurodegeneration der retinalen Ganglienzelle im EAG Modell stehen könnten.

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on human fibrinogen and fibrin clot

Latex glycoprotein (LGP) from Synadenium grantii latex was purified by the combination of heat precipitation and gel permeation chromatography. LGP is a heat stable protein even at 80 degrees C showed a sharp single band both in SDS-PAGE as well as in native (acidic) PAGE. LGP is a monomeric protein appears as single band under reducing condition. It is a less hydrophobic protein showed sharp single peak in RP-HPLC with retention time of 13.3 m. The relative molecular mass of LGP is 34.4 kDa. CD spectrum of LGP explains less content of alpha-helix (7%), and high content of beta-pleated sheets (48%) and random coils (46%). The N-terminal sequence of LGP is D-F-P-S-D-W-Y-A-Y-E-G-Y-V-I-D-R-P-F-S. Purified LGP is a fibrinogen degrading protease hydrolyses all the three subunits in the order of Aalpha, Bbeta and gamma. The hydrolytic pattern is totally different from plasmin as well as thrombin. LGP reduces recalcification time from 165 to 30 s with citrated human plasma but did not show thrombin like as well as factor Xa-like activity. Although LGP induces procoagulant activity, it hydrolyses partially cross-linked fibrin clot. It hydrolyses all the subunits of partially cross-linked fibrin clot (alpha- chains, beta-chain and gamma-gamma dimer). LGP is a serine protease, inhibited by PMSF. Other serine protease inhibitors, aprotinin and leupeptin did not inhibit the caseinolytic activity as well as fibrinogenolytic activity. We report purification and characterization of a glycoprotein from Synadenium grantii latex with human fibrino(geno)lytic activity.

Chemokine receptor 4 (CXCR4) is part of the lipopolysaccharide "sensing apparatus"

Recognition of bacterial lipopolysaccharide (LPS) by the innate immune system involves at least three receptor molecules: CD14, TLR4 and MD-2. Additional receptor components such as heat shock proteins, chemokine receptor 4 (CXCR4), or CD55 have been suggested to be part of this activation cluster; possibly acting as additional LPS transfer molecules. Our group has previously identified CXCR4 as a component of the "LPS-sensing apparatus". In this study we aimed to elucidate the role that CXCR4 plays in innate immune responses to LPS. Here we demonstrate that CXCR4 transfection results in responsiveness to LPS. Fluorescence correlation spectroscopy experiments further showed that LPS directly interacts with CXCR4. Our data suggest that CXCR4 is not only involved in LPS binding but is also responsible for triggering signalling, especially mitogen-activated protein kinases in response to LPS. Finally, co-clustering of CXCR4 with other LPS receptors seems to be crucial for LPS signalling, thus suggesting that CXCR4 is a functional part of the multimeric LPS "sensing apparatus".

Stress-induced targeting of molecular chaperones in the yeast Saccharomyces cerevisiae

The eukaryotic stress response is an essential mechanism that helps protect cells from a variety of environmental stresses. Cell death can result if cells are not able to properly adapt and protect themselves against adverse stress conditions. Failure to properly deal with stress has implications in human diseases including neurodegenerative disorders and distinct cancers, emphasizing the importance of understanding the eukaryotic stress response in detail. As part of this response, expression of a battery of heat shock proteins (HSP) is induced, which act as molecular chaperones to assist in the repair or triage of unfolded proteins. The 90-kDa HSP (Hsp90) operates in the context of a multi-chaperone complex to promote the maturation of nuclear and cytoplasmic clients. I have discovered that Hsp90 and the co-chaperone Sba1 accumulate in the nucleus of quiescent Saccharomyces cerevisiae cells in a karyopherin-dependent manner. I isolated nuclear accumulation- defective HSP82 mutant alleles to probe the nature of this targeting event and identified a mutant with a single amino acid substitution (I578F) sufficient to prevent nuclear accumulation of Hsp90 in quiescent cells. Diploid hsp82-I578F cells exhibited pronounced defects in spore wall construction and maturation, resulting in catastrophic sporulation. The mislocalization and sporulation phenotypes were shared by another previously identified HSP82 mutant allele, further linking localization to Hsp90 functional status. Pharmacological inhibition of Hsp90 with macbecin in sporulating diploid cells also blocked spore formation, underscoring the importance of this chaperone in this developmental program. The yeast molecular chaperone Hsp104 is a member of the Hsp100 superfamily of AAA+ ATPases. Unlike the Hsp90 family of chaperones, Hsp104 is not restricted to a specific set of client proteins, but rather assists in reactivating stress-denatured proteins by solubilizing protein aggregates. I have discovered that Hsp104, along with the Hsp70 chaperone, Ssa1, and the sHSP Hsp26 accumulate into RNA processing bodies (P- bodies) and stress granules, sites of mRNA metabolism. I found that Hsp104 recruits both Ssa1 and Hsp26 to P-bodies and that these three chaperones are required for stress granule formation. These findings suggest a possible role for chaperones in mRNA metabolism by aiding in the assembly, disassembly or conversion of these enigmatic mRNP complexes. Taken together, the work presented in this dissertation serves to better understand the eukaryotic stress response by illustrating the importance of subcellular-chaperone localization in key biological processes.

Rtr1 is the Saccharomyces cerevisiae homolog of a novel family of RNA polymerase II-binding proteins.

Cells must rapidly sense and respond to a wide variety of potentially cytotoxic external stressors to survive in a constantly changing environment. In a search for novel genes required for stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae, we identified the uncharacterized open reading frame YER139C as a gene required for growth at 37 degrees C in the presence of the heat shock mimetic formamide. YER139C encodes the closest yeast homolog of the human RPAP2 protein, recently identified as a novel RNA polymerase II (RNAPII)-associated factor. Multiple lines of evidence support a role for this gene family in transcription, prompting us to rename YER139C RTR1 (regulator of transcription). The core RNAPII subunits RPB5, RPB7, and RPB9 were isolated as potent high-copy-number suppressors of the rtr1Delta temperature-sensitive growth phenotype, and deletion of the nonessential subunits RPB4 and RPB9 hypersensitized cells to RTR1 overexpression. Disruption of RTR1 resulted in mycophenolic acid sensitivity and synthetic genetic interactions with a number of genes involved in multiple phases of transcription. Consistently, rtr1Delta cells are defective in inducible transcription from the GAL1 promoter. Rtr1 constitutively shuttles between the cytoplasm and nucleus, where it physically associates with an active RNAPII transcriptional complex. Taken together, our data reveal a role for members of the RTR1/RPAP2 family as regulators of core RNAPII function.

Activation of DegP chaperone-protease via formation of large cage-like oligomers upon binding to substrate proteins.

Cells use molecular chaperones and proteases to implement the essential quality control mechanism of proteins. The DegP (HtrA) protein, essential for the survival of Escherichia coli cells at elevated temperatures with homologues found in almost all organisms uniquely has both functions. Here we report a mechanism for DegP to activate both functions via formation of large cage-like 12- and 24-mers after binding to substrate proteins. Cryo-electron microscopic and biochemical studies revealed that both oligomers are consistently assembled by blocks of DegP trimers, via pairwise PDZ1-PDZ2 interactions between neighboring trimers. Such interactions simultaneously eliminate the inhibitory effects of the PDZ2 domain. Additionally, both DegP oligomers were also observed in extracts of E. coli cells, strongly implicating their physiological importance.

Characterization of Hsp70 binding and nucleotide exchange by the yeast Hsp110 chaperone Sse1.

SSE1 and SSE2 encode the essential yeast members of the Hsp70-related Hsp110 molecular chaperone family. Both mammalian Hsp110 and the Sse proteins functionally interact with cognate cytosolic Hsp70s as nucleotide exchange factors. We demonstrate here that Sse1 forms high-affinity (Kd approximately 10-8 M) heterodimeric complexes with both yeast Ssa and mammalian Hsp70 chaperones and that binding of ATP to Sse1 is required for binding to Hsp70s. Sse1.Hsp70 heterodimerization confers resistance to exogenously added protease, indicative of conformational changes in Sse1 resulting in a more compact structure. The nucleotide binding domains of both Sse1/2 and the Hsp70s dictate interaction specificity and are sufficient for mediating heterodimerization with no discernible contribution from the peptide binding domains. In support of a strongly conserved functional interaction between Hsp110 and Hsp70, Sse1 is shown to associate with and promote nucleotide exchange on human Hsp70. Nucleotide exchange activity by Sse1 is physiologically significant, as deletion of both SSE1 and the Ssa ATPase stimulatory protein YDJ1 is synthetically lethal. The Hsp110 family must therefore be considered an essential component of Hsp70 chaperone biology in the eukaryotic cell.